Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

O objetivo geral deste procedimento é investigar a função do fator de transcrição NF kappa B no cérebro adulto. Isso é conseguido primeiro criando camundongos transgênicos que inibem especificamente a atividade do NF kappa B nos neurônios. A segunda etapa do procedimento é testar as consequências comportamentais da inibição do NF kappa B usando o padrão espacial, separação ou celeiros, labirinto.

O terceiro passo é a profusão cuidadosa dos animais, a remoção dos cérebros e o corte adequado dos mesmos. A etapa final é analisar os efeitos histológicos e estruturais, como a visualização de projeções de fibras musgosas por imunocoloração. Em última análise, o uso do teste de comportamento seguido de histologia pode correlacionar alterações no aprendizado dependente do giro dentado com mudanças estruturais nos tecidos associados.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o Mars Vase, é que a separação de padrões espaciais liga o MA oferece a oportunidade de medir especificamente os processos de aprendizagem dependentes de crianças, bem como a neurodegeneração e regeneração nessa área do cérebro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese adulta, como a aprendizagem como separação de padrões especiais. A demonstração do labirinto será feita por Angela Kula, uma técnica do meu laboratório.

A perfusão será apresentada por Peter Hyman, pesquisador associado. Em seguida, o seccionamento dos cérebros será mostrado pelo técnico Ulrich KA. E, finalmente, a microscopia de varredura confocal será apresentada por Jeanine Muah, aluna de doutorado do meu laboratório Realize a separação de padrões espaciais.

Barnes Maze Teste comportamental de acordo com as diretrizes internacionais e locais. Para este ensaio, é importante usar apenas camundongos machos com pelo menos seis meses de idade. Para cada série de ensaios, os animais devem ter menos de quatro dias de idade e o mesmo operador deve realizar todos os ensaios antes do ensaio.

Os ratos devem ser alimentados com uma dieta padrão para que sejam motivados por alimentos doces. Para configurar o teste primeiro, obtenha uma placa branca de 120 centímetros de diâmetro feita de plástico rígido. As dicas extras do labirinto podem ser feitas de diferentes materiais e podem ter formas diferentes.

É importante ressaltar que eles devem ter alto contraste para serem claramente reconhecidos pelas rodas de corrida do animal. Escadas e túneis são boas dicas. Posicione a placa sob várias lâmpadas fluorescentes de néon moderadamente intensas, para que os ratos fiquem motivados a sair da luz.

A sala deve ter umidade controlada e a uma temperatura constante de 22 graus Celsius. Agora configure o sistema de rastreamento de vídeo. Posicione a câmera 115 centímetros acima do centro da placa.

Em seguida, anexe dicas extras de labirinto multicoloridas a um pano de cor branca que se encaixe no prato. Posicione-os perto do centro do pano para que fiquem facilmente visíveis para os animais. Agora, limpe cuidadosamente a placa com o desinfetante rápido que pode remover qualquer odor da configuração experimental.

Posicione sete casas de comida amarelas idênticas no prato branco. Suas posições devem ser marcadas de forma inequívoca um dia antes de iniciar os testes, habituar cada mouse ao disco. Coloque recompensas de pellets de comida doce como um loop de frutas esquartejado dentro de cada uma das sete casas de comida para o teste de habitação.

Coloque cada mouse no ponto inicial da placa e aguarde 10 minutos para explorar. Registre essa exploração entre ratos. Limpe a placa circular e as casas de alimentação com desinfetante rápido.

Reabasteça também as recompensas de comida. Nos próximos sete dias consecutivos, execute os testes de teste para os testes. Todas, exceto uma casa, são fechadas por fita transparente durante todo o experimento.

É sempre a mesma casa. Cada casa ainda é carregada com uma recompensa e o teste é executado como o teste de habituação. Faça os testes na mesma hora do dia para cada animal para evitar variações circadianas.

Posteriormente, analise a latência, a distância percorrida e os erros usando estatísticas apropriadas. O software define erros como se aproximar da casa de comida errada ou fazer contato com a caixa adequada, mas não conseguir entrar e recuperar a recompensa. Para comparar os grupos, use uma ANOVA de duas vias com um teste post hoc bon fer.

Depois de anestesiar o animal com uma injeção interperitoneal de vertina, perfunda-o cuidadosamente trans cordialmente com PBS contendo heparina e propano. Faça um furo no ventrículo esquerdo usando uma agulha de calibre 26. Faça também um corte no átrio direito para permitir que o sangue e perfunda oito flua para fora.

Insira a agulha de perfusão no ventrículo esquerdo no orifício com um ângulo reto e a uma profundidade de um a dois milímetros. Use 1,2 a 1,4 metros de pressão hidrostática e perfunda o mouse por dois a quatro minutos. Siga a heparina e o propano com 4% de paraldeído em PBS por 10 a 15 minutos.

A perfusão deve ser de 15 mililitros por minuto. Agora disseque o cérebro. Deve ser branco pálido, sem vasos sanguíneos vermelhos visíveis.

Fixe todos os cérebros coletados em 4% de formaldeído a quatro graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte. Cryo protege os cérebros em 30% de sacarose em PBS, armazena-os a quatro graus Celsius por pelo menos 24 horas depois.

Os cérebros são congelados em um estágio de tom criogênico e cortados em seções horizontais de 40 mícrons de espessura. Depois de corar as seções com um anticorpo para o neurofilamento M, as projeções de fibras musgosas podem ser visualizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser no comprimento de onda apropriado para o anticorpo fluorescente. Inicie a varredura com baixa ampliação e oriente-se para as projeções do hipocampo e das fibras musgosas.

Em seguida, com maior ampliação, colete varreduras de cesariana de alta resolução das fibras musgosas para análise para investigar a expressão do transgene I kappa B alfa AA um. Nos cérebros de camundongos transgênicos duplos foram isolados, seccionados criogênicos e corados usando um anticorpo contra a varredura confocal a laser GFP. A microscopia revelou alta expressão do transgene na região CA um, na região CA três e no DG para determinar o tipo de célula mais precoce expressando o CAMK dois alfa impulsionado I kappa B alfa AA um na região neurogênica do hipocampo.

Seções criogênicas de hipopótamos Campi de I Kappa BTTA. Os animais foram corados para dupla corteína e a análise confocal do transgene revelou sinais de GFP em células granulares jovens DCX positivas marcadas pelas setas indicando a indução da expressão do transgene pela atividade CAMK dois alfa. Cortes coronais do hipocampo de camundongos i kappa BTTA e i Kappa B menos foram corados para o neurofilamento M para visualizar projeções de fibras musgosas e revelar organização complexa e vesicular em camundongos I kappa BTTA.

As projeções de fibras musgosas foram severamente prejudicadas. Além disso, a inibição do NF kappa B levou a uma espessura de lâmina speral significativamente reduzida e a um volume de DG menor para estudar as possíveis razões para o defeito estrutural dramático. Fatias frescas de hipocampo não fixadas de camundongos controle e I kappa BTTA foram coradas com fluoro jade C, que permite a detecção específica da morte celular neuronal.

Um número dramaticamente aumentado de neuritos degenerados foi observado em animais transgênicos duplos em comparação com controles transgênicos únicos. Além disso, um aumento significativo de células positivas para capapace clivado foi detectado em camundongos I kappa BTTA. Por outro lado, a coloração imuno-histoquímica contra DCX revelou quantidades significativamente aumentadas de células positivas para DCX no cérebro de camundongos I kappa BT.

Além disso, as células d CX positivas em I kappa B TTA hipopótamo Campi não foram dispostas exclusivamente na zona subgranular, mas também foram encontradas nas regiões mais profundas do dg. Já os progenitores positivos D CX nos animais controle estavam localizados quase exclusivamente dentro da zona subgranular. Testar o aumento da quantidade de células que expressam DCX foi resultado da maturação de progenitores anteriores ou diretamente devido à proliferação de células DCX positivas.

BRDU foi injetado intraperitoneal de camundongos i kappa BTTA e controle, que foram então seccionados criogogênicos e corados com DCX e BRDU para análise de proliferação. A BRDU foi injetada uma vez, seguida de análise após 24 horas. Para análise de diferenciação, foram realizadas três injeções diárias, seguidas de análise após sete dias após uma única injeção de BRDU.

Não foram observadas diferenças significativas no número total de células positivas para BRDU entre os animais I kappa BTTA negativo e controle. Por outro lado, a abordagem de três injeções seriadas revelou uma quantidade claramente aumentada de células positivas B-R-D-U-D-C-X no DG de I capa, BTTA. A diferenciação ou integração perturbada de camundongos com células que expressam DCX pode ter aumentado o número de células e as células do tipo três podem ter sido envolvidas para testar especificamente o comportamento dos camundongos transgênicos duplos.

Em uma tarefa dependente de GD, o S-P-S-B-M foi empregado. Os animais controle I kappa B exploraram as casas de alimentação em série no primeiro dia do experimento. Após sete dias de treinamento, os animais conseguiram encontrar a casa de alimentação aberta diretamente.

Em contraste, os animais IA BTTA continuam a explorar as casas de alimentação em série, mesmo após o treinamento. A observação de aumentos significativos nas distâncias percorridas e maiores latências e taxas de erro nos animais I kappa BTTA em comparação com os animais controle i Kappa B sugere que esses animais apresentaram graves defeitos de aprendizagem. Uma vez estabelecida, esta técnica pode ser feita em 30 minutos por animal se for realizada corretamente após o seu desenvolvimento.

Essa técnica pode abrir caminho para outros neurocientistas interessados em tarefas dependentes de giroscópios daid, como neurogênese adulta, degeneração ou regeneração em camundongos.