Name: Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Aprenda métodos para modular e analisar a neurogênese adulta dependente de NF-κB em camundongos. Este protocolo demonstra testes comportamentais com labirinto de Barnes e análises histológicas para investigar funções cognitivas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos Angela Kralemann-Köhler para excelente suporte técnico. O trabalho experimental aqui descrito foi realizado em nosso laboratório e foi apoiado por subsídios do Conselho Alemã de Pesquisa (DFG) para CK e BK e uma concessão do Ministério alemão da Educação e Pesquisa (BMBF) para BK.

Declaração de Ética Este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos do animal e uso de cuidados comitê governamental, LANUV do estado Renânia do Norte-Vestfália, (Düsseldorf, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo LANUV, Düsseldorf sob o número de licença 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento e o número de animais necessários para o estudo. 1. Animal Care e Habitação <ol><li> Todos os animais utilizados nos protocolos aqui descritos devem ser mantidos em condições livres de patógenos específicos, conforme definido pela Associação Federação Europeia Laboratory Animal Science (FELASA). </li><li> Os ratos devem ser mantidos em gaiolas padrão numa sala de temperatura e humidade controladas (22 ° C) sob condições diurnas (12 horas de luz / escuridão) com ar filtrado HEPA. </li><li> Comida padronizada e água devem ser fornecidas ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Se IkB / tTA e IkB / - murganhos de controlo são utilizados, genotipagem baseada em PCR deve ser efectuada para cada animal, tal como descrito em 7, 18. </li><li> Animais do sexo masculino com uma diferença de idade de menos de quatro dias devem ser usadas para reduzir a variabilidade individual. </li><li> (Opcional): Para as experiências de reactivação de NF-kB, a doxiciclina pode ser administrado na água de beber (2 mg / ml com 2,5% de sacarose) durante pelo menos 14 dias. </li></ol> 2. Padrão espacial Separação-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Todos os testes de comportamento deve ser realizada de acordo com as diretrizes internacionais e locais. </li><li> IMPORTANTE! Use apenas camundongos machos com idade de seis meses ou mais. A diferença de idade entre os animais de uma série de testes deve ser inferior a quatro dias. O teste deve ser realizado pelo mesmo operador para cada uma das séries. Os ratos devem receber uma dieta padrão antes do teste para aumentar ainda mais a motivação parcialmente conduzido por quantorecompensa alimentar weet. </li><li> Defina-se uma placa circular branco feito de plástico duro (120 centímetros de diâmetro, ver Figura 5A) em um e humidade ambiente com temperatura controlada (22 ° C), iluminado com pelo menos 4 x 80 W e 3 x 215 lâmpadas fluorescentes W néon . IMPORTANTE! Garantir a iluminação correta é usado, como a motivação dos ratos para entrar nas casas dos alimentos é parcialmente impulsionado por sua aversão a brilhantes, locais expostos. </li><li> Configure o sistema de vídeo-monitoramento. A câmara deve ser colocado 115 centimetros acima do centro da placa (ver Figura 5A). </li><li> Anexar multicoloridas pistas extra-labirinto (CEM) em um pano de cor branca em posições facilmente visíveis para os animais, cerca de 100 cm da borda da placa (ver Figura 5A). </li><li> Limpe cuidadosamente a placa com um desinfectante rápido que pode remover qualquer odor do experimental set-up. </li><li> Coloque sete casas idênticas amarelas de alimentos (12 cm x 7 cm x 8 cm, ver Figura 5A </strong&gt;) na placa branca. As posições devem ser marcadas de forma inequívoca (ver Figura 5A). </li><li> Coloque doces recompensas da pelota de alimentos (um quarto de uma casa Froot Curva / comida Kellogs `s) dentro de todas as casas de comida em posições definidas (ver Figura 5A), com apenas uma casa comida definido ser de livre acesso ao animal (localização F, ver figura 5A ). Feche as casas de alimentos não-alvo com folha transparente. </li><li> Antes do ensaio, realizar habituação (um dia antes de iniciar o trabalho). Fazer todos os estabelecimentos de comida livremente acessível e permitir que os ratinhos a explorar livremente o labirinto e para recuperar uma recompensa alimentar pelete (10 min / animal). </li><li> Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de vídeo-monitoramento. </li><li> Inicie a gravação. </li><li> Colocar o animal no ponto inicial definida na placa circular (Figura 5A, S: a posição de partida) e permitir que os ratinhos procurar a casa comida alvo durante 10 min. </li><li> Stop-tracking o vídeo. </li><li> IMPORTANTE! Limpe a placa circular e as casas de comida depois de cada ensaio com desinfectante rápido. </li><li> Repetir o teste diariamente durante sete dias consecutivos (por cada animal). </li><li> Analisar os resultados (latência, distância percorrida e erros) usando o software estatísticas apropriadas. Definir erros como se aproximar da casa comida errada e / ou contato com a caixa adequada, sem entrar e recuperar a recompensa pellet alimentos. Para a análise agrupada usar two-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni. </li><li> (OPCIONAL) Sacrifício dos ratinhos e analisar o hipocampo, como descrito abaixo. </li></ol> 3. BrdU Labeling <ol><li> Injectar por via intraperitoneal de 50 mg / kg ip de BrdU uma vez por dia durante 3 dias (análise de diferenciação e integração) ou ip de 200 mg / kg para uma única injecção (análise de proliferação). </li><li> Sacrifício dos animais, dissecar o hipocampo e preparar 40 mM secções, conforme descrito abaixo. </li><li> Desnaturar asecções com 2 M de HCl durante 10 minutos e incubar em tampão de borato 0,1 M durante 10 min. </li><li> Rotular uma série de um em doze dos 40 mM secções (240 uM) para além de cada animal imuno-histoquímica, tal como descrito a seguir, utilizando anticorpos dirigidos contra a BrdU. </li><li> Quantificar as células marcadas por análise de microscopia confocal em toda a extensão do rostro-caudal da camada de células granulares e zona subgranular. Multiplica os números resultantes por 12 para obter o número total estimado de células marcadas com BrdU por hipocampo e dividir por dois, para obter o número total de células marcadas por DG. </li></ol> 4. Remoção dos cérebros e Preparação de Cortes congelados de Nonperfused Animais <ol><li> Observe os procedimentos aprovados localmente para eutanásia de animais. Os ratinhos podem ser directamente submetidos à eutanásia por deslocamento cervical. </li><li> (Opcional) Os animais podem ser anestesiados antes de eutanásia de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais, por exemplo, inje intraperitonealcção de 0,8 ml Avertin para um 33 g de rato (feito recentemente pela mistura de 150 ml de solução estoque feito de 2,2 mg de 2,2,2-tribromoetanol em 1 ml de etanol isoamyl com 1,85 ml de tampão de soro fisiológico ou). </li><li> Esterilizar a cabeça com Betadine (10% iodopovidona)-gaze embebida e cotonete posteriormente com gaze embebida em álcool 70%. </li><li> Decapitar o animal usando uma tesoura cirúrgica apropriados e puxar a pele de lado. </li><li> (Opcional) Fixadores pode ser aplicada para evitar a dobragem para trás da pele retardado. </li><li> Faça uma incisão na linha média no crânio e puxe cuidadosamente os fragmentos do crânio de lado. </li><li> Retire cuidadosamente todo o cérebro através de um instrumento cirúrgico apropriado (por exemplo, Moria Colher). </li><li> Precool 25 ml de 2-metilbutano numa proveta de 50 ml (por exemplo, Duran de Schott) a -30 a -40 ° C em gelo seco. Nota: Para a coloração de livre flutuação das seções &quot;grossas&quot;, que são ideais para a microscopia confocal a laser, remova cérebro, lavar 3vezes, em tampão e armazenar a 4 ° C em tampão fosfato solução de sacarose a 30% em 50 ml tubo até cérebro afundado para baixo (tipicamente durante a noite). </li><li> Com cuidado, coloque cérebro em um pedaço de Nescofilm (Parafilm) e cubra com uma ampla quantidade de composto TissueTek outubro, congelar em Nescofilm em 2-metilbutano, armazenar a -80 ° C até o uso. Nota: Para o armazenamento de longo prazo a -20 ° C em armazenamento de 9% de sacarose, 7 mM de MgCl2, 50 mM de tampão fosfato, 44% de glicerol. </li><li> Corte o cérebro em 10-12 mm de espessura sobre cryomicrotome apropriado. Nota: Para, seções flutuantes grossas, congelar cérebro em cryotome fase de cryotome apropriado (por exemplo Reichert Jung, Frigomobil.) E corte 40 mM seções horizontais a -20 ° e - 25 ° C. Colete seções de faca com pincel fino e recolher em tampão ou manter em solução de armazenamento (passo 4.9) a -20 ° C para armazenamento de longo prazo. </li><li> Monte cuidadosamente duas fatias em lâminas de microscópio simples. A nóse de lâminas Superfrost Ultraplus é altamente recomendado para maximizar a adesão das seções. </li><li> Secam-se as lâminas durante 5 min à temperatura ambiente. As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 5. Preparação das Seções de perfusão Animais <ol><li> Anestesiar os animais como descrito acima (passo 4.2). </li><li> Aspergir cuidadosamente o animal transcardialmente com tampão fosfato salino (PBS) contendo heparina (0,025 g/100 ml de PBS) e procaína (0,5 g/100 ml de PBS) durante 2-4 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 min . A perfusão é optimamente realizada irrigando através do ventrículo esquerdo e abertura do átrio direito com uma pressão hidrostática de cerca de 1,2-1,4 m ou utilizando uma bomba peristáltica definido para aproximadamente 15 ml / min. Resultados de perfusão ideal em um cérebro branco pálido, sem vasos sanguíneos vermelhos sendo visível. </li><li> Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 24 hr. </li><li> Cryoproteger os cérebros em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante pelo menos 24 horas. </li><li> Congelar os cérebros no palco cryotome. </li><li> Prepare 40 mM seções horizontais de forebrains inteiras usando uma cryotome apropriado. </li><li> As lâminas podem ser armazenadas em solução de crioprotector (tampão fosfato 0,1 M, 50% glicerol, 0,14% de MgCl 2, 8,6% de sacarose), a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 6. Imunohistoquímica de seções do cérebro de Nonperfused Animais <ol><li> Pós-corrigir os criocortes, preparadas como descrito acima, usando -20 ° C metanol frio durante 10 min. </li><li> Bloco com 5% de soro normal contendo 0,3% de Triton-X (a partir das espécies que foram utilizados para aumentar o anticorpo secundário) durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos secundários, à temperatura ambiente durante uma hora. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x </li><li> Counterstain seção de DNA usando SYTOX verde, ou DAPI (ou um corante DNA alternativa). </li><li> Lavar 3x com PBS 1x </li><li> Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação. </li><li> Deixe o meio incorporar polimerizar por pelo menos 48 horas. </li></ol> 7. Imunohistoquímica de seções do cérebro de animais perfundidos <ol><li> Bloco tal como descrito no passo 6.2 e subsequentemente incuba-se as secções de cérebro fixadas em solução de anticorpo primário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (flutuante) durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x e incubar em solução de anticorpo secundário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (livre flutuante) à temperatura ambiente durante 3 hr. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x </li><li> Contracorante seção de DNA usando SYTOX verde ou DAPI (ou um corante DNA alternativa). </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x </li><li> Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação. </li><li> Deixe o meio de fixação para polimerizar umt menos de 48 horas. </li></ol> 8. Investigação de Projeções Mossy Fibra <ol><li> Sacrifício dos animais, preparar 40 mM secções coronais como descritos acima e manchar a secção de hipocampo utilizando o anticorpo para neurofilamento M. </li><li> Digitalizar as seções no comprimento de onda apropriado, usando um microscópio de varredura a laser confocal para visualizar fibras musgosas e núcleos. Inicie a digitalização em baixa ampliação. </li><li> Utilize as imagens de baixa ampliação para orientação e atingir o hipocampo com as projeções de fibras musgosas. </li><li> Digitalize as seções (z-seccionamento) em alta resolução e alta ampliação. </li><li> Analisar o aspecto morfológico e conectividade das fibras musgosas visualizadas através de coloração para NF-M. </li><li> (OPCIONAL) Analisar o tamanho e volume de lâminas do hipocampo. Usar o sinal de ADN para as medições. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal morte celular) <ol><li> Sacrificar os animais, dissecar o hippocAmpus, e preparar 12 mM secções como descritos acima. </li><li> Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Corrigir as seções em PFA 4% por 40 min em temperatura ambiente. </li><li> Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH 2 O. </li><li> Incubar as seções com 0,06% de permanganato de potássio (KMnO 4) por 10 min sob contínua agitação suave. </li><li> Lavar as seções 3x com DDH 2 O. </li><li> Incubar as secções com 0,002% Fluoro-Jade solução C, durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> (Opcional) para colorações nucleares simultâneas, uma solução de 0,002% Fluoro-Jade C pode ser suplementado com 10 ug / ml de DAPI. </li><li> Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH 2 O. </li><li> Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as seções com xileno (1 min) </li><li> Monte as seções usando um meio de montagem com base em xileno (DPX). </li></ol>

<ol><li>Gutierrez, H., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+process+growth%2C+elaboration+and+structural+plasticity+by+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB.</a> Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).</li>
<li>Imielski, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regrowing+the+adult+brain%3A+NF-kappaB+controls+functional+circuit+formation+and+tissue+homeostasis+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahippocampal+injection+of+A+beta%281-42%29+inhibits+neurogenesis+and+down-regulates+IFN-gamma+and+NF-kappaB+expression+in+hippocampus+of+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain.</a> Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).</li>
<li>Denis-Donini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adult+neurogenesis+associated+with+short-term+memory+defects+in+NF-kappaB+p50-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice.</a> J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).</li>
<li>Bracchi-Ricard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+nuclear+factor-kappaB+regulates+learning+and+memory+and+synaptic+plasticity+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J%2C+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice.</a> J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).</li>
<li>Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor-kappaB+is+a+critical+mediator+of+stress-impaired+neurogenesis+and+depressive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).</li>
<li>Fridmacher, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain-specific+neuronal+inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activity+leads+to+loss+of+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection.</a> J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).</li>
<li>Whiteside, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-terminal+sequences+control+degradation+of+MAD3%2FI+kappa+B+alpha+in+response+to+inducers+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22B+activity.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa.</a> B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).</li>
<li>Mayford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+memory+formation+through+regulated+expression+of+a+CaMKII+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene.</a> Science. 274, 1678-1683 (1996).</li>
<li>Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+hepatic+apoptosis+and+embryonic+lethality+in+RelA%2FTNFR-1+double+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice.</a> Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).</li>
<li>Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+of+a+water-maze+procedure+for+studying+spatial+learning+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.</a> J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).</li>
<li>Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+deficits+associated+with+senescence%3A+a+neurophysiological+and+behavioral+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Compar.+Physiol.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat.</a> J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).</li>
<li>Brun, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cells+and+place+recognition+maintained+by+direct+entorhinal-hippocampal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry.</a> Science. 296, 2243-2246 (2002).</li>
<li>Meshi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+is+not+required+for+behavioral+effects+of+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment.</a> Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).</li>
<li>Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+human+hippocampal+CA3+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus.</a> Science. 319, 1640-1642 (2008).</li>
<li>Dupret, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relational+memory+requires+hippocampal+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).</li>
<li>Kaltschmidt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+regulates+spatial+memory+formation+and+synaptic+plasticity+through+protein+kinase+A%2FCREB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, 210-213 (2009).</li>
<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Neurogênese adulta, ea possibilidade de sua manipulação através da inibição do NF-kB nos neurônios, e sua reativação posterior através doxiciclina, oferece um sistema fascinante para as investigações sobre os neurônios recém-nascidos no cérebro adulto, bem como em neuronal de-e re-geração . A beleza desse sistema é que a inibição de NF-kB via de sinalização nos neurônios não só resulta em mudanças na morte neuronal, proliferação e migração de células progenitoras, e as mudanças estruturais e anatômicas graves, mas també...

Ontologicamente, o hipocampo é um dos mais antigos estruturas anatómicas cerebrais conhecidos. Ele é responsável por diversas tarefas complexas, tais como funções fundamentais na regulação da memória de longo prazo, a orientação espacial ea formação e consolidação da respectiva memória. Anatomicamente, o hipocampo é constituído por camadas de células piramidais (estrato piramidal), incluindo o cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, e CA4) e regiões do giro dentado (gyrus dentatus), que contém as células granulares e alguns progenitores neuronais dentro da sua zona subgranular . As células granulares projectar em direcção à região CA3 através das ditas fibras musgosas (axónios de células granulares). Até o final do século passado, cérebro de mamíferos adultos se acreditava ser um órgão estático falta plasticidade celular e neurogênese. No entanto, durante as duas últimas décadas, uma quantidade crescente de evidências demonstra claramente a neurogênese adulta ocorrendo em pelo menosduas regiões do cérebro, da zona subventricular (SVZ) e a zona subgranular do hipocampo. Nossos estudos anteriores, e das de outros grupos, têm mostrado que o fator de transcrição NF-kB é um dos reguladores moleculares cruciais da neurogênese adulta, e que os seus resultados de-regulação em defeitos estruturais do hipocampo graves e deficiências cognitivas 1-6. NF-B é o nome genérico de um factor de transcrição indutível composto por diferentes combinações diméricos de cinco subunidades de ligação ao ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), o último dos quais tem três domínios de transactivação. Dentro do cérebro, a forma mais abundante encontrada no citoplasma é um heterodímero de p50 e p65, que é mantido sob uma forma inactiva, por inibidor de kappa B (IkB)-proteínas. Para estudar e manipular diretamente neurogênese NF-kB-driven, usamos modelos de camundongos transgênicos para permitir simples inibição de toda a subun NF-kBsua, especificamente no cérebro anterior 7 (ver Figura 1). Para este fim, nós Cruzado as seguintes linhas camundongo transgênico, IkB / - e -/tTA. O transgênico IkB / - linha foi gerada usando um mutante negativo trans-dominante do NF-kB-inibidor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. Em contraste com o do tipo selvagem IκBα, IκBα-AA1 tem dois resíduos de serina mutados para alaninas (V32 e V36), os quais impedem a fosforilação e subsequente degradação proteosomal do inibidor. Para prosencéfalo expressão específica do neurônio do IκBa-AA1-transgene, IkB / - ratos foram cruzadas com ratos abrigar uma quinase cálcio-calmodulina-dependente IIα (CAMKIIα)-promotor que pode ser conduzido por tetraciclina trans-ativador (ATT) 9. p65 camundongos knock-out ter um fenótipo letal embrionário, devido à maciça apoptose hepática 10, então a abordagem mostrada aqui fornece um método elegantepara investigar o papel do NF-kB em pós-natal e neurogênese adulta. O teste comportamental clássica para estudar a aprendizagem espacial ea memória foi descrita em 1980 por Richard Morris, um teste conhecido como a água-labirinto Morris (MWM) 11. Neste campo aberto água-labirinto, os animais aprendem a escapar da água opaca sobre uma plataforma escondida com base na orientação e extra-labirinto pistas. Uma variante de seco da MWM é o chamado labirinto Barnes (BM) 12. Este teste utiliza uma placa circular com 20 orifícios circulares dispostas na fronteira de uma placa com um furo definida como uma caixa de fuga, e visuais pistas extra-labirinto de orientação. Ambos os paradigmas experimentais dependem do comportamento de fuga induzido por um roedor `s aversão à água, ou espaços abertos, brilhantemente iluminados. Ambos os testes permitem que uma investigação de orientação espacial, eo desempenho da memória relacionada. Embora o hipocampo desempenha um papel em geral e fundamental na formação da memória espacial, o hipocampo rEGIÕES envolvidos diferem dependendo do teste aplicado. A memória testada em BM surge da atividade neuronal entre o córtex enthorinal (CE) e os neurônios piramidais localizados no CA1-região do hipocampo, sem uma contribuição da DG 13-16. Em particular, o clássico BM depende principalmente da sua navegação através da via temporo-ammonic monossináptico de CE III CA1 para CE V. Mais importante, o DG é crucialmente envolvido no chamado reconhecimento do padrão espacial 17, o que implica não só o tratamento de informação visual e espacial, mas também a transformação das representações ou memórias semelhantes em diferentes representações, não sobrepostas. Esta tarefa exige um circuito tri-sináptico funcional do CE II DG para CA3 para CA1 e CE VI, que não podem ser testados na BM 15. Para enfrentar esses desafios, nós planejamos SPS-BM como um teste comportamental para testar especificamente o desempenho cognitivo denteado dependente de giro em control animais, e no modelo de super-repressora de IkB / tTA a inibição do NF-kB. Importante, em contraste com a MWM ou o BM, o SPS-BM pode revelar déficits comportamentais sutis resultantes da diminuição da neurogênese. Desde espacial-padrão de separação é estritamente dependentes de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, este teste é altamente sensível a mudanças potenciais na neurogênese, modificações da via fibra de musgo ou alterações de homeostase do tecido dentro do DG. Tecnicamente, a configuração do nosso teste baseia-se no estudo de Clelland et al., Em que o padrão de separação espacial foi testado utilizando uma madeira de 8 braços do labirinto radial do braço (RAM) 19. Em nossa modificado set-up, os oito braços foram substituídos por sete casas amarelas idênticas alimentos. Em resumo, os métodos mostrados aqui, incluindo a análise de células que expressam doublecortin (DCX +) dentro do hipocampo, as projeções de fibras musgosas, neuronal de células deatletas e, particularmente, o SPS-BM apresentado aqui, pode ser aplicado a investigações de outros modelos de mouse incorporando transgenes que têm um impacto sobre a neurogênese adulta. Outras aplicações podem incluir o estudo de agentes farmacológicos e medir o seu impacto sobre a separação padrão DG e espacial.

<table><tbody><tr><td>Colher Perfurada Moria MC17</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>remoção dos cérebros</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>remoção dos</td></tr><tr><td>cérebros Tesoura cirúrgica&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>remoção do cérebro</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>remoção do cérebro</td></tr><tr><td>Dumont # 5 fórceps</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>remoção do cérebro</td></tr><tr><td>SuperFrost Slides</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td>slides para imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>fixador</td></tr><tr><td>TissueTek OCT composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>1004200018</td><td>incorporação dos cérebros</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>bloqueio em IHC</td></tr><tr><td>Soro de coelho normal</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>bloqueio em IHC</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>bloqueio em</td></tr><tr><td>anticorpo anti-neurofilamento-M</td> IHC <td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>2H3</td><td>IHC, Diluição 1:200</td></tr><tr><td>anti-Doublecortin&nbsp; anticorpo</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, Diluição 1:800</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, Diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>anticorpo anti-BrdU</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, Diluição 1:2.000&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>Determinação da morte celular neuronal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td>D08AG02 desinfetante</td></tr><tr><td>Criomicrótomo</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>preparação de fatias de cérebro Sal de</td></tr><tr><td>heparina sódica</td><td>Perfusão Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Placa circular feita de plástico rígido (diâmetro 120 cm)</td> <td>feita</td> <td>em laboratórionenhuma</td><td>placa para SPS-BM, diâmetro 120 cm</td></tr><tr><td>Desinfetante rápido Buraton&nbsp;</td><td>Sch&uuml; lke Mayr</td><td>113 911</td><td>desinfetante</td></tr><tr><td>Sistema de rastreamento de vídeo TSE VideoMot 2 com pacote de software VideoMot2</td><td>TSE Systems</td><td>302050-SW-KIT</td><td>rastreamento e análise de SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>permeabilização/IHC</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>preparação de 40 &micro; m fatias de cérebro</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>incorporação das lâminas</td></tr><tr><td>SYTOX verde</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Coloração nuclear</td></tr><tr><td>Pellets de alimentos (Kellog's Froot Loops)</td><td>Kellog's</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, versão 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, EUA</td><td></td><td>Avaliação estatística do software SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 ou Zen 2011</td><td>Software Carl Zeiss</td><td></td><td>(microscópio confocal)</td></tr> <tr>Meio <td>de</td> montagem <td>317616 DPX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>para coloração Fluoro-Jade C</td></tr></tbody></table>

os métodos para a modulação e análise de nf-kb-dependente adulto neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

O hipocampo desempenha um papel fundamental na formação e consolidação de memórias episódicas, e na orientação espacial. Historicamente, o hipocampo adulto foi visto como uma região anatómica muito estático do cérebro de mamíferos. No entanto, resultados recentes demonstraram que o giro denteado do hipocampo é uma área de grande plasticidade em adultos, que envolva não apenas modificações de circuitos neuronais existentes, mas também a neurogénese adulto. Esta plasticidade é regulada por redes complexas de transcrição, em que o factor de transcrição NF-kB desempenha um papel proeminente. Para estudar e manipular neurogenesis adulto, um modelo de ratinho transgénico para-específica do cérebro anterior inibição neuronal da actividade de NF-kB pode ser usado. Neste estudo, são descritos métodos para a análise da neurogénese NF-kB-dependentes, incluindo os seus aspectos estruturais, apoptose neuronal e a proliferação de células progenitoras, e significância cognitiva, which foi especificamente avaliada através de um giro denteado (DG) dependente teste comportamental, o padrão de separação espacial-Barnes labirinto (SPS-BM). O protocolo SPS-BM poderia ser simplesmente adaptados para uso com outros modelos animais transgênicos destinados a avaliar a influência de genes específicos em neurogênese adulta. Além disso, o SPS-BM poderia ser usado em outras configurações experimentais com vista a investigar e manipular aprendizagem DG-dependentes, por exemplo, por meio de agentes farmacológicos.

-Cruzamento das IkB / - linhas de camundongo transgênico e tTA leva à inibição condicional da atividade de NF-kB no hipocampo. Para investigar a expressão de a-AA1-IκBα transgene no ratinho transgénico duplo (Figura 1A), os cérebros foram isolados, cryosectioned e coradas utilizando um anticorpo contra a GFP (proteína fluorescente verde). A microscopia de varrimento de laser confocal revelou elevada expressão do transgene nas regiões CA1 e CA3, e no GD <stro...

Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a função do fator de transcrição NF kappa B no cérebro adulto. Isso é conseguido primeiro criando camundongos transgênicos que inibem especificamente a atividade do NF kappa B nos neurônios. A segunda etapa do procedimento é testar as consequências comportamentais da inibição do NF kappa B usando o padrão espacial, separação ou celeiros, labirinto.O terceiro passo é a profusão cuidadosa dos animais, a remoção dos cérebros e o corte adequado dos mesmos. A etapa final é analisar os efeitos histológicos e estruturais, como a visualização de projeções de fibras musgosas por imunocoloração. Em última análise, o uso do teste de comportamento seguido de histologia pode correlacionar alterações no aprendizado dependente do giro dentado com mudanças estruturais nos tecidos associados.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o Mars Vase, é que a separação de padrões espaciais liga o MA oferece a oportunidade de medir especificamente os processos de aprendizagem dependentes de crianças, bem como a neurodegeneração e regeneração nessa área do cérebro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ne

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma maneira de estudar a integração de recém-nascidos células granulares denteado em animais adultos é descrito. Esta técnica utiliza um retrovírus engenharia para rotular neurônios recém-nascidos, seguido de gravações eletrofisiológicas para determinar a integração funcional vivo.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

A função dos neurônios de mamíferos nascido de adultos continua a ser uma área ativa de pesquisa. A radiação ionizante inibe o nascimento de novos neurônios. Usando computador guiada por tomografia irradiação focal (CFIR), segmentação anatômica tridimensional de populações específicas progenitoras neurais agora pode ser usado para avaliar o papel funcional da neurogênese adulta.

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

Migração neuroblastos é um passo crucial na neurogênese pós-natal. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para investigar o papel dos reguladores de candidatos de migração neuroblastos empregando DNA / RNA pequeno hairpin (shRNA) nucleofection e um ensaio de migração 3D com neuroblastos isolados do roedor pós-natal fluxo migratório rostral.

Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração<em&gt; In vitro</em

Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Os ensaios de crescimento de neuritos fornecem um valor quantitativo sobre os processos neuronais regenerativos. A vantagem deste software semiautomático é que ele segmenta corpos celulares e neurites separadamente, criando uma máscara e mede vários parâmetros, como comprimento de neurites, número de pontos de ramificação, área de aglomerado de células-corpo e número de aglomerados de células.

Padronização de um novo software semiautomático para medição de crescimento de neuritos 

Aprenda métodos para modular e analisar a neurogênese adulta dependente de NF-κB em camundongos. Este protocolo demonstra testes comportamentais com labirinto de Barnes e análises histológicas para investigar funções cognitivas.

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

Explorar mais vídeos