Name: Métodos para identificar as ressonâncias de RMN da amina N-terminal 13C-dimetil em proteínas metiladas redutivamente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Aprenda métodos para atribuir ressonâncias de RMN de dimetilamina em lisozima metilada redutivamente usando formaldeído carbono-13 e aminopeptidase. Esta técnica permite análise estrutural precisa de proteínas.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Prêmio Número R00RR024105 do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa, Instituto Nacional de Saúde.

1. Metilação redutiva da lisozima
<ol>
	<li>Preparar 500 ml de um tampão fosfato de sódio a 50 mM a pH 7,5. Armazene em temperatura ambiente.</li>
	<li>Rotule três tubos de microcentrífuga de 1 ml para amostra totalmente marcada (FLS), amostra parcialmente marcada com baixo pH (LpH) e amostra parcialmente marcada com pH alto (HpH).</li>
	<li>Pesar 10 mg de lisozima e dissolver em 2 ml de tampão fosfato de sódio para criar uma solução aquosa com uma concentração de 5 mg/ml. Cobrir os tubos com folha de alumínio para proteger o formaldeído da degradação devida à exposição à luz. Adicionar 500 μl de solução de lisozima a cada tubo.</li>
	<li>Prepare soluções frescas de 1,0 M de complexo de dimetilamina borano (DMAB) e 13C-formaldeído. Conservar a 0 °C.</li>
	<li>Para a amostra totalmente marcada, use uma proporção molar de 1:10 (amina reativa: formaldeído) e, para as amostras parcialmente marcadas, use uma proporção de 1:5. Alternativamente, a proporção pode ser otimizada. Por exemplo, para ver a dominância do pico de C-dimetilamina α-13em pH baixo, foi necessária uma proporção de 2:7.</li>
	<li>Adicione 6,1 μl de DMAB 1,0 M ao FLS, adicione 3,2 μl de DMAB 1,0 M a LpH e HpH e vore suavemente. Em seguida, adicione 12,3 μl de 1,0 M 13C-formaldeído a FLS e 6,1 μl de 1,0 M 13C-formaldeído a LpH e HpH. Agite as misturas de reação a 4 ° C por 2 horas.</li>
	<li>Adicionar outra alíquota de DMAB 1,0 M e formaldeído 13C, como no passo anterior, e agitar a mistura de reacção durante a noite a 4 °C durante um tempo de reacção total de 18-24 horas.</li>
	<li>Troque o tampão da amostra por fosfato a pH 7,5 para remover o excesso de reagentes e produtos secundários usando um filtro centrífugo (corte de peso molecular de 3 kDa).</li>
	<li>Para as amostras parcialmente marcadas, metile redutivamente as amostras a pH 7,5 com formaldeído de abundância natural para criar uma proteína modificada de forma homogênea. Prepare novas soluções 1,0 M de DMAB e formaldeído de abundância natural.</li>
	<li>Cubra os tubos de amostra com papel alumínio, adicione 6,1 μl de DMAB a LpH e HpH e vore suavemente. Em seguida, adicione 12,3 μl de formaldeído de abundância natural. Agitar as misturas de reacção a 4 °C durante 2 horas.</li>
	<li>Adicionar outra alíquota de DMAB 1,0 M e formaldeído de abundância natural como no passo anterior e agitar as misturas de reacção durante a noite a 4 °C durante um tempo de reacção total de 18-24 horas. Em seguida, troque o tampão usando as etapas 2,5-2.6 e armazene amostras de 50 μg a -20 °C para EM.</li>
</ol>
2. Prepare a amostra para análise de RMN
<ol>
	<li>Prepare uma solução tampão de borato de sódio 2,0 M a pH 8,5 em H2O.</li>
	<li>Adicionar 375 μl de solução tampão de borato de sódio 2,0 M a quatro tubos cónicos de 15 ml. Parafilme os topos e faça furos. Colocar o balão num balão liofilizante e congelar a amostra.</li>
	<li>Coloque a amostra congelada em um liofilizador para secar. Retire quando estiver seco.</li>
	<li>Com uma pipeta, adicionar 15 ml de D2O a cada tubo e homogeneizar.</li>
	<li>Rotule três filtros centrífugos de 4 ml (corte de peso molecular de 3 kDa) com FLS, LpH e HpH. Adicione a amostra correspondente aos tubos de filtro (~ 500 μl). Adicione 3,0 ml de tampão borato de sódio 50 mM a pH 8,5 a cada tubo. Fazer um tubo de equilíbrio para o terceiro tubo e concentrar as amostras a 500 μl utilizando uma centrífuga com um rotor de ângulo fixo de 35° a 4 °C e 7.500 rcf.</li>
	<li>Esvazie a armadilha sob cada filtro. Adicionar mais 3,0 ml de tampão às amostras e concentrar novamente as amostras a 500 μl. Repita a etapa 2.5 4x.</li>
	<li>Usando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA)36, determine a concentração de cada amostra. Diluir as amostras de lisozima com tampão borato de sódio 50 mM para fazer amostras de 150 μM.</li>
	<li>Transfira 530 μl para um tubo de RMN de 5 mm ou 250 μM para um tubo de suscetibilidade magnética de 5 mm.</li>
	<li>Preparar uma solução-mãe de 80 mM de 1,2-dicloroetano-13 C2 em D2O. Conservar esta solução-mãe a -80 °C. Diluir a 24 mM em 80 μl e transferir para um tubo de inserção coaxial para utilizar como referência na análise de RMN. Analise as amostras com RMN. Nota: Execute um HSQC 1D 1 H-13C e integre as áreas de pico para cada ressonância. As áreas de pico devem ser as mesmas para amostras totalmente rotuladas.</li>
</ol>
3. Degradação da Lisozima pela Aminopeptidase
<ol>
	<li>Preparar uma solução de 5 mg/ml de lisozima em água ultrapura.</li>
	<li>Adicionar 250 μl da solução de lisozima a um tubo de centrifugação limpo de 1 ml.</li>
	<li>Adicionar 25 μl de uma solução de tricina 0,1 M, pH 8,0, e 6 μl de uma solução de Aeromonas proteolytica aminopeptidase a 2,16 μg/ml.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 6 horas.</li>
	<li>Adicione mais 6 μl da solução de aminopeptidase 2,16 μg / ml à amostra para uma proporção molar de 1:50 de aminopeptidase para lisozima. Incubar por mais 20 horas a 37 °C.</li>
	<li>Dessalinize 30 μl da amostra usando uma coluna de centrifugação C18 (siga o protocolo do fabricante). Armazene a -20 °C para análise MALDI MS.</li>
	<li>Preparar a amostra de proteína restante para RMN, conforme descrito no protocolo 2).</li>
</ol>
4. Preparar amostras para espectrometria de massa
<ol>
	<li>Utilizando os 50 μg de amostra reservados no passo 2.3, trocar o tampão por 100 mM de bicarbonato de amónio, pH 8,0, e concentrar a cerca de 50 μl utilizando um filtro centrífugo de 1 ml (corte de massa molecular de 3 kDa). Transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 1 ml e embrulhe em papel alumínio.</li>
	<li>Adicione 2,0 μl de ditiotreitol 500 mM para reduzir as ligações dissulfeto. Incubar a solução a 60 °C durante 1 hora.</li>
	<li>Adicione 2 μl de iodoacetamida a 500 mM recém-preparada para alquilar os grupos tióis. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Remova a folha e adicione 1,0 μl da solução de ditiotreitol 500 mM para extinguir a reação.</li>
	<li>Adicione 2,0 μg de tripsina de grau sequencial para digerir a proteína. Incubar a mistura a 37 °C durante 16-24 horas.</li>
	<li>Adicione TFA até que o pH seja inferior a 2 para extinguir a digestão. (Ácidos fórmico e acético também podem ser usados)</li>
	<li>Dessalinize a amostra em uma coluna de centrifugação C18 e elua a proteína em 80% de acetonitrila / 0,1% de TFA. Seque a amostra usando um concentrador de vácuo.</li>
	<li>Reconstituir a amostra em 5,0 μl de acetonitrila a 50% / TFA a 0,1% para análise MALDI MS. Misturar volumes iguais da amostra reconstituída e uma solução saturada de solução de matriz de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico na placa-alvo MALDI. Analise as amostras em um MALDI MS. Nota: Use tandem MS para confirmar a identidade dos picos de peptídeos. Suavize os espectros de massa e analise. Para cada peptídeo contendo dimetilamina, determinar a intensidade de pico e a área de pico de cada isótopo no perfil. Calcule a porcentagem de 13incorporação C conforme descrito anteriormente34.</li>
</ol>

<ol><li>Bax, A., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+Advances+in+Protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological Advances in Protein NMR.</a> Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).</li>
<li>Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Labeling+of+Arbitrary+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins.</a> Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).</li>
<li>Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalomares%2C+L+%22Recombinant+Gene+Expression%22">Recombinant Gene Expression</a>. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Production+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein Production and Purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+Structural+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Lessons from Structural Genomics.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).</li>
<li>Goto, N. K., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Developments+in+Isotope+Labeling+Strategies+for+Protein+Solution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).</li>
<li>Lian, L., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+Approaches+for+Protein+Structural+Studies+by+Solution-State+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magn.+Reson.+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR.</a> Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).</li>
<li>Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Type+Selective+Isotope+Labelling+of+the+Multidrug+ABC+Transporter+LmrA+for+Solid-State+NMR+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies.</a> Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Amino-Acid-Type+Selective+Isotope+Labeling+of+Protein+Expressed+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3AStructure+Function+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris.</a> Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).</li>
<li>Means, G., Feeney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Alkylation+of+Amino+Groups+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins.</a> Biochem. 7 (6), 2192 (1968).</li>
<li>Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR-Studies+of+Ribonuclease-A+Methylated+With+Formaldehyde-C-13.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+alkylation+of+lysine+residues+to+alter+crystallization+properties+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).</li>
<li>French, D., Edsall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactions+of+Formaldehyde+with+Amino+Acids+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins.</a> Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).</li>
<li>Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+Proteins+by+Reductive+Methylation+Using+Sodium+Cyanoborohydride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride.</a> J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).</li>
<li>Walter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Methylation+as+a+Routine+Rescue+Strategy+for+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Struct%22%5BJournal%5D)">Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization.</a> Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).</li>
<li>Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Consequences+of+Reductive+Methylation+of+Lysine+Residues+in+Hen+Egg-White+Lysozyme+-+An+X-ray+Analysis+at+1.8-Angstrom+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution.</a> Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).</li>
<li>Bokoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-specific+regulation+of+the+extracellular+surface+of+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor.</a> Nat. 463 (7277), (2010).</li>
<li>Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).</li>
<li>Sherry, A., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Studies+of+C-13-Methylated+Concanavalin+A+-+pH+and+Co2%2B-Induced+Nuclear+Magn.+Reson.+Shifts.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts.</a> J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).</li>
<li>Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+NMR+Studies+of+the+Lysyl+Residues+of+fd+Gene+5+Protein+-+Lysines+24%2C+46%2C+and+69+May+be+Involved+in+Nucleic+Acid+Binding.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding.</a> J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.</li>
<li>Moore, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-epsilon%2CN-epsilon-dimethyl-lysine+cytochrome+c+as+an+NMR+probe+for+lysine+involvement+in+protein-protein+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation.</a> Biochem. J. 332, 439-449 (1998).</li>
<li>Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+Active-Site+Lysine+of+Ribonuclease-A+By+C-13+NMR.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR.</a> Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).</li>
<li>Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Interactions+of+Amino+Groups+in+C-13+Reductively+Methylated+Hen+Egg-White+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme.</a> J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).</li>
<li>Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+of+Methylated+Lysines+of+fd+Gene-5+Protein+-+Evidence+for+A+Conformational+Change+Involving+Lysine-24+Upon+Binding+of+A+Negatively+Charged+Lanthanide+Chelate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate.</a> Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).</li>
<li>Gluck, M., Sweeney, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13-NMR+of+Clostridium-Pasteurianum+Ferredoxin+After+Reductive+Methylation+of+the+Amines+Using+C-13+Formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).</li>
<li>Jentoft, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+Methylation+and+C-13+Nuclear-Magnetic-Resonance+in+Structure-Function+Studies+of+Fc+Fragment+and+Its+Subfragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments.</a> Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).</li>
<li>Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conformation+of+Apolipoprotein+A-I+in+Discoidal+and+Spherical+Recombinant+High+Density+Lipoprotein+Particles+-+C-13+NMR+Studies+of+Lysine+Ionization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization.</a> J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).</li>
<li>Ashfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Modification+of+a+Variant+of+Human+MIP-1+Alpha%2C+Implications+for+Dimer+Structure.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure.</a> Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).</li>
<li>Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+Inversion+in+Proteins+-+A+C-13-NMR+Study+of+Proton+Exchange+and+Nitrogen+Inversion+Rates+in+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha-%5BC-13%5DTetramethyllysine%2C+N-Epsilon%2CN-Epsilon%2CN-Alpha%2CN-Alpha%5BC-13%5DTetramethyllysine+Methyl-Ester%2C+and+Reductively+Methylated+Concanavalin-A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A.</a> Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).</li>
<li>Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+Motions+in+C-13+Methylated+Concanavalin-as+Studied+by+C-13+Magnetic-Resonance+Relaxation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques.</a> Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).</li>
<li>Huque, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+NMR+Studies+of+the+Lysine+Side+Chains+of+Calmodulin+and+Its+Proteolytic+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments.</a> Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).</li>
<li>Brown, L., Bradbury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-Magnetic-Resonance+Studies+of+Lysine+Residues+of+Ribonuclease-A%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A.</a> Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).</li>
<li>Zhang, M., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Side+Chain+pKa+Values+of+the+Lysine+Residues+in+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin.</a> J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).</li>
<li>Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrometry+Assisted+Assignment+of+NMR+Resonances+in+Reductively+C-13-Methylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).</li>
<li>Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncovalent+Polycationic+Coatings+for+Capillaries+in+Capillary+Electrophoresis+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins.</a> Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+strategies+for+characterizing+protein+conformations+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomolec.+NMR%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR.</a> J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).</li>
<li>Bradbury, J. H., Brown, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dissociation+Constants+of+Lysine+Residues+of+Lysozyme+by+Proton-Magnetic-Resonance+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy.</a> Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).</li>
<li>Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+the+Aminopeptidase+from+Aeromonas+proteolytica+on+Mg2%2B%2FAl3%2B+Layered+Double+Hydroxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.%2C+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles.</a> Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).</li>
<li>Poncz, L., Dearborn, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resistance+to+Tryptic+Hydrolysis+of+Peptide-Bonds+Adjacent+to+N-epsilon%2CN-Dimethyllysyl+Residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues.</a> J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).</li>
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A atribuição dos sinais de RMN de proteínas 13C-metiladas é necessária para utilizar totalmente este método de marcação isotópica. O uso de MS para auxiliar na atribuição dos sinais de RMN através da correlação dos dados parciais de incorporação de 13C é uma técnica promissora. A vantagem dessa técnica sobre outros métodos de atribuição é que apenas a sequência primária de aminoácidos é necessária. O método de atribuição assistida por EM é limitado quando o aminoácido N-terminal é uma lisin...

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma valiosa ferramenta de elucidação da estrutura para proteínas1. A espectroscopia de RMN pode ser usada para determinar a estrutura da solução de uma proteína em seu estado nativo. Para superar a baixa abundância natural de isótopos magnéticos estáveis, é necessário incorporar 13C e 15N na proteína de interesse. O método mais comum empregado é a expressão recombinante em um hospedeiro bacteriano2-3. No entanto, duas desvantagens da superexpressão do hospedeiro bacteriano são que ele não pode produzir modificações pós-traducionais e não funciona para todas as proteínas3-4. Quando a expressão bacteriana não é uma rota viável para a produção de proteínas, a superexpressão em hospedeiros não bacterianos pode ser usada, mas a marcação isotópica é difícil e cara5. Métodos alternativos de expressão para incorporar isótopos de 13C e 15N em proteínas para análise de RMN incluem técnicas de marcação esparsa usando precursores metabólicos para marcação de metila6 e aminoácidos 13C, 15N7-9. Uma abordagem química para a marcação esparsa usada aqui é a reação redutiva de 13C-metilação bem estabelecida (Figura 1), onde os grupos amino primários em uma proteína - a α-amina N-terminal e a lisina, ε-aminas de cadeia lateral - são metilados. Uma vez que as monometilaminas são formadas, a amina prontamente sofre metilação novamente, devido ao maior valor de pKa, para formar dimetilaminas.
A metilação redutiva foi introduzida pela primeira vez como um método para modificar quimicamente proteínas por Means e Feeney10. As vantagens dessa reação são sua ampla aplicabilidade e condições de reações leves em pH fisiológico tamponado e baixas temperaturas11,12. Na presença de formaldeído e um agente redutor, como o complexo dimetilamina borano (DMAB), os grupos lisina ε-amino e o grupo N-terminal α-amino são seletivamente metilados para produzir aminas dimetiladas. Embora o formaldeído seja conhecido por reticular proteínas através da formação de pontes de metileno, esse processo é bloqueado pelo agente redutor13,14.
A metilação redutora tem sido usada com sucesso para estudar proteínas com RMN e cristalografia de raios-x. A metilação redutiva é usada para facilitar a cristalização de proteínas intratáveis15. A lisozima de clara de ovo de galinha foi a primeira proteína cristalizada em sua forma dimetilada. A diferença quadrada média entre os átomos pesados nas estruturas de lisozima metilada e não metilada é de 0,40 Å16. Essa comparação demonstra que a estrutura da proteína pode ser mantida após a metilação redutiva, tornando a reação uma ferramenta viável de rotulagem para elucidação da estrutura.
Usando formaldeído marcado com 13C na reação de metilação redutiva, 13aminas C-dimetiladas são produzidas. As 13C-dimetilaminas são sondas detectáveis por RMN que têm sido amplamente utilizadas para estudar a dinâmica, estrutura e função de proteínas. A RMN e a metilação 13C redutora têm sido usadas para estudar as interações proteína-ligante e proteína-proteína para o receptor adrenérgico β2 17, ribonuclease A18, lisozima19, proteína20 do gene fd 5 e citocromo c21. Da mesma forma, foram estudadas propriedades estruturais e funcionais da ribonuclease A22 13C-metilada de forma redutora, lisozima23, proteína24 do gene fd 5, ferredoxina de Clostridium pasteurianum 25, fragmento Fc de IgG26, apolipoproteína A-I27 e MIP-1α28 A dinâmica dos 13grupos C-dimetilamino foi estudada na concanavalina A29-30 e na calmodulina31.
Embora a metilação 13C redutora tenha sido amplamente utilizada para estudar proteínas com RMN, o método de marcação sempre foi limitado pelas dificuldades de atribuir as ressonâncias de RMN26. A maioria das estratégias de atribuição para reduzir 13proteínas C-metiladas dependeu de um pequeno número de locais,20,28 propriedades estruturais conhecidas11,19,23,26,31,32. ou extensas modificações genéticas33. Nenhum desses estudos atribuiu com sucesso todos os 13picos de C-dimetilamina, exceto o estudo da calmodulina, onde os picos foram atribuídos por mutagênese dirigida ao local de cada lisina33. No estudo da formação de dímeros MIP-1α, o uso de espectrometria de massa (MS) para auxiliar na atribuição de RMN de 13aminas C-metiladas redutoras foi relatado pela primeira vez28. O tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistido por matriz (MALDI-TOF) MS foi usado para identificar a lisina na interface do dímero. As lisinas parcialmente metiladas de peptídeos trípticos MIP-1α humanos foram identificadas com MS e correlacionadas com o aparecimento de sinais de mono e dimetilamina da proteína intacta observados em espectros de RMN 2D 1 H-13C HSQC28. Nosso grupo expandiu o uso da SM e apresentou um método de atribuição que não requer conhecimento prévio da estrutura ou propriedades da proteína além da sequência de aminoácidos34. Este método é aplicável à maioria das proteínas. Uma exceção é quando uma proteína tem uma lisina N-terminal porque o perfil isotópico MS da lisina N-terminal α- e ε-13C-dimetilaminas não pode ser medido independentemente.
Aqui apresentamos dois métodos, um químico e outro enzimático, para identificar os sítios N-terminal de α-dimetilamina e ε-dimetilamina de cadeia lateral de um resíduo de lisina N-terminal. O primeiro método foi inspirado em Córdova et al.que utilizaram o pH para controlar a seletividade da acetilação de proteínas35. A reação favorece a α-amina N-terminal em pH baixo e as ε-aminas de cadeia lateral em pH alto, permitindo que os grupos α e ε-amino proteicos sejam distinguidos, em seus estudos, com eletroforese capilar35. Demonstramos como o pH alto e baixo é usado para alterar a marcação de grupos amino proteicos usando a reação redutora de 13C-metilação e para permitir a aplicação da estratégia de atribuição assistida por MS. O segundo método para atribuir as C-dimetilaminas N-terminal α- e ε-13aproveita a remoção seletiva do(s) resíduo(s) N-terminal usando Aeromonas proteolytica aminopeptidase recombinante.

<table><tbody>Filtro centrífugo <tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 ml (3k MWCO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC800308 (8pk)</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptidase</td><td>Creative Biomart</td><td>Aminopeptidase-86A</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Complexo de borano-dimetilamina</td><td>Sigma</td><td>180238</td><td>Faça uma solução fresca de 1 M antes de usar.</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colunas de rotação</td><td>Thermo Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dicloroetano-13C2</td><td>Sigma</td><td>714321</td><td>Solução estoque de 80 mM armazenada a -80 ° C. Usado como referência em espectros de RMN a 24 mM.</td></tr><tr><td>Formaldeído (36,5% em peso/peso)</td><td>Sigma</td><td>33220</td><td>Faça uma solução fresca de 1 M antes de usar.</td></tr><tr><td>13C-formaldeído (99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-806-1</td><td>Faça uma solução fresca de 1 M antes de usar.</td></tr><tr><td>Lisozima (clara de ovo de galinha)</td><td>Sigma</td><td>L6376</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (heptahidratado dibásico)</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (monobásico)</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td></td><td>Sigma T0377</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>700 MHz Varian VNMRS com sonda HCN 5922 de 5 mm</td><td>Agilent Tecnologias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para identificar as ressonâncias de rmn da amina n-terminal 13c-dimetil em proteínas metiladas redutivamente

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica comprovada para estudos dinâmicos e de estrutura de proteínas. Para estudar proteínas com RMN, isótopos magnéticos estáveis são tipicamente incorporados metabolicamente para melhorar a sensibilidade e permitir a atribuição de ressonância sequencial. A C-metilação 13redutora é um método alternativo de marcação para proteínas que não são passíveis de superexpressão do hospedeiro bacteriano, o método mais comum de incorporação de isótopos. A 13C-metilação redutora é uma reação química realizada sob condições leves que modifica os grupos amino primários de uma proteína (grupos ε-amino de lisina e o grupo α-amino N-terminal) para 13grupos C-dimetilamino. A estrutura e a função da maioria das proteínas não são alteradas pela modificação, tornando-a uma alternativa viável à marcação metabólica. Como a 13C-metilação redutiva adiciona rótulos isotópicos esparsos, os métodos tradicionais de atribuição dos sinais de RMN não são aplicáveis. Um método alternativo de atribuição usando espectrometria de massa (MS) para auxiliar na atribuição de sinais de RMN da proteína 13C-dimetilamina foi desenvolvido. O método depende de quantidades parciais e diferentes de marcação de 13C em cada grupo amino primário. Uma limitação do método surge quando o resíduo N-terminal da proteína é uma lisina porque os grupos α e ε-dimetilamino de Lys1 não podem ser medidos individualmente com MS. Para contornar essa limitação, dois métodos são descritos para identificar a ressonância de RMN das 13C-dimetilaminas associadas à α-amina N-terminal e à ε-amina de cadeia lateral. Os sinais de RMN da α-dimetilamina N-terminal e da ε-dimetilamina de cadeia lateral da lisozima da clara de ovo de galinha, Lys1, são identificados em espectrosde coerência quântica única heteronucleares 1 H-13 C.

Metilação Redutiva e pH
Demonstrou-se uma reação de metilação redutiva quimiosseletiva com 13C induzida por pH em lisozima. Em pH baixo, a reação prefere a α-amina do N-terminal sobre as ε-aminas da cadeia lateral e vice-versa em pH alto. Em solução, os grupos amino da proteína existem em equilíbrio entre a amina livre e o ácido conjugado, que pode ser ajustado com o pH. A faixa de pH ideal para esta reação depende do agente redutor utilizado. Neste caso, o borano de dimetilam...

Dois métodos para atribuir os sinais de ressonância magnética nuclear de α e ε-dimetilamina de uma lisina N-terminal 13C-metilada redutora são descritos. Um método utiliza a seletividade induzida pelo pH da reação de metilação redutiva e o outro usa aminopeptidase para remover seletivamente a lisina N-terminal.

Métodos para identificar as ressonâncias de RMN da amina N-terminal 13C-dimetil em proteínas metiladas redutivamente

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

O objetivo geral deste procedimento é atribuir o carbono alfa e épsilon. 13 ressonância de RMN de dimetilamina da lisina terminal final, resíduo de lisozima. Isso é conseguido primeiro metilando redutivamente a lisozima em pH baixo e alto, com uma quantidade subgeométrica de carbono 13 formaldeído.O segundo passo é metilar redutivamente as amostras de pH baixo e alto com excesso de abundância natural de formaldeído para completar a metilação. A etapa final é a troca tampão das amostras redutivamente metiladas em tampão D dois O para análise de RMN. No segundo método, o objetivo é alcançado pela degradação da aminopeptidase de uma amostra de lisozima.O segundo passo é metilar redutivamente a amostra de proteína truncada com excesso de carbono 13 formaldeído, seguido de troca de tampão para análise de RMN. Em última análise, a espectroscopia de RMN é usada para mostrar a ausência de ressonância de carbono 13 metil para fazer atribuições. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que ela permite a atribuição inequívoca das ressonâncias alfa e SSON dimetillamina e ML da lisina interna de uma proteína Rotule três tubos de microcentrífuga de um mililitro com F-L-S-

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Chemistry

Química

Métodos para identificar as ressonâncias de NMR da amina 13C-dimetil N-terminal em proteínas metiladas redutivamente

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Métodos para identificar as ressonâncias de RMN da ^{amina N-terminal 13}C-dimetil em proteínas metiladas redutivamente

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