Name: Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a capturar imagens de alta resolução da resposta gravitropica de raízes de Arabidopsis usando scanners de mesa. Este método econômico permite coleta em alta vazão para análises fenotípicas em biologia vegetal.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (número prêmio IOS-1031416) e foi realizado em colaboração com Nathan Miller, Logan Johnson e Edgar Spalding, da Universidade de Wisconsin e Brian Bockelman, Carl Lundstedt e David Swanson do University of Holland Computing Center do Nebraska.

1. Image Acquisition Protocol Considerações: Este protocolo é mais eficiente realizada com duas pessoas, embora seja possível para um trabalho sozinho. O acordo de trabalho melhor neste laboratório foi para uma pessoa para preparar pratos para a digitalização enquanto outros trabalhos sobre a configuração do scanner, em seguida, ambos trabalham juntos para colocar placas em scanners e iniciar o processo de digitalização. Também é importante notar que os scanners neste projeto são orientados verticalmente com as tampas de scanner descansando na parte de trás do scanner. Um suporte personalizado foi feito para segurar pratos nesta posição vertical e foi afixada à superfície de mesa com tiras 3M Command (Figura 2). A tampa removível documento que vem com o scanner utilizada neste protocolo (um Epson V700) foi forrado em um lado com feltro preto. A tampa do documento foi posicionado contra a mesa com uma corda elástica paramanter as placas no lugar, e para fornecer uma imagem de contraste (Figura 3). Qualquer digitalizador de resolução suficiente poderia ser usado para a captura de imagem. O Epson Perfection V700 foi escolhido devido ao seu perfil quadrado (tornando mais fácil para posicionar verticalmente), sua alta resolução, e as opções adicionais para fazer a varredura do tanto a cama e tampa e usar o canal infravermelho. Estas opções adicionais não foram utilizados neste protocolo. Uma vez que as placas foram removidas da câmara de crescimento, é imperativo que o protocolo continuar até ao fim. Preparação Placa Foram utilizados pratos padrão de Petri contendo 10 ml de meio transparente e 9 sementes plantadas em todo o meio de cada placa. Procedimentos de rotulagem placa, preparação de mídia e plantio pode ser encontrado em: <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><li&gt; Recuperar a primeira placa de ágar e absorver a condensação recolhida sobre a tampa e o aro da tampa da placa de agar com um Kimwipe. </li><li> Aplicar o Triton X-100 (detergente) a tampa com um Kimwipe - ser generoso. (Note que o Triton X-100 ajuda a evitar o acúmulo de condensação na tampa como a placa é digitalizada. Uma aplicação de generoso (o suficiente para criar uma película na superfície da tampa) vai ajudar a certificar-se de que a tampa fica transparente ao longo de todo o prazo do scanner .) </li><li> Envolva a placa com micropore para fixar a tampa, e para permitir a ventilação. </li></ol> Configuração do scanner e coleção de imagens Este protocolo assume que mais de 1 scanner está sendo usado, e fornece instruções para começar a vários scanners de um único computador. <ol start="4"><li> Crie pastas para armazenar imagens de cada scanner. Cada scanner irá realizar duas placas, de modo manter isso em mente ao criar pastas. Umpode optar por usar os metadados como componentes do nome do arquivo, tais como IDs únicos para cada placa, com idades de mudas, tamanho da semente, e os IDs de ações plantadas. Um exemplo de um nome de pasta utilizada na coleta de dados contendo estes metadados é &quot;1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161&quot;. </li><li> Definir temporizadores saída para tempo coletando designado (9 hr foi usado neste laboratório). Certifique-se de definir um tempo extra (uma hora) para a preparação. (Note-se que scanners deve ser conectado a timers saída, a fim de definir o tempo de aquisição. Enquanto o software VueScan permite que um usuário para coletar imagens repetidamente, ele não permite que o usuário para indicar quantas imagens para coletar ou quanto tempo para coletar imagens para .) </li><li> Ligue o primeiro scanner e esperar cerca de 10 segundos para o scanner de passar por suas iniciais warm-ups. </li><li> Abra o programa VueScan uma vez. VueScan versão 9.0.20 foi utilizado neste protocolo (ver Tabela Materiais), embora as versões mais recentes podem ser usados ​​com pouca modificção. Verifique se o botão &quot;Mais&quot; foi pressionado no painel inferior da interface do usuário para exibir as opções de menu descritos abaixo. </li><li> Defina a repetição Auto: drop-down caixa para nenhum sob a guia de entrada e na guia Cortar definir a área de visualização: a máxima (Figura 4). Pressione &#39;Preview&#39;. </li><li> Criar uma caixa de culturas que captura a região de interesse, usando o mouse para clicar e arrastar toda a região de interesse na imagem de visualização. As configurações podem ser alteradas para a região de interesse na guia Cortar. Os ajustes típicos usados ​​para a caixa de corte foram: x-offset 0,675; 1.924 em, embora este foi ajustado para capturar área de mudas para cada scanner-offset y. O tamanho da caixa de colheita utilizado foi 7,246 em largura por 1,1 de altura na (Figura 5). </li><li> Para mover a caixa de corte, segure a tecla Shift enquanto arrasta com o mouse. Certifique-se a caixa de corte contém todas as mudas a serem verificados mais qualquer metadados desejado que podem estar contidas em um rótulo (Figura 5). </li><li> Sob a guia Colheita, definir a área de Preview: a caixa de corte e Imprensa &#39;Preview&#39;. </li><li> Vá até a aba Output e selecione o arquivo correto para o scanner (Figura 5). </li><li> Repita os passos 1,7-1,12 em todos os scanners para um computador. Escolha a opção &quot;sim&quot; quando perguntado se deseja abrir mais de uma instância de VueScan. </li><li> Passar por cada guia e verificar as configurações estão corretas. (Note-se que todas as especificações podem ser alteradas para atender às necessidades de um laboratório individual incluindo a cor da imagem, resolução, etc. No entanto, as definições utilizadas neste protocolo pode ser aplicado diretamente sobre a particular digitalização de hardware de um determinado laboratório, devido à interface comum do software VueScan. Consulte a lista de especificações em anexo para ver os parâmetros utilizados neste projeto, utilizando VueScan versão 9.0.20). </li><li> Sob a guia de entrada escolher contínua no repetição Auto: campo, ou escolher um intervalo de tempo maior entre as imagens, se desejar. O intervalo de tempo é o tempo em que o leitor faz uma pausa após guardar a última imagem e começando recolha da próxima imagem. No modo contínuo, 3-4 min resolução podem ser obtidas no 4800 dpi. </li><li> Repita os passos de 1,14-1,15 para o resto dos scanners ligados a um único computador. </li><li> Coloque placas preparados nos scanners corretas com mudas orientadas horizontalmente (não gravistimulate). </li><li> Temporariamente colocar um negro, sentiu fundo contra as placas para que eles não caem do modelo de Plexiglas. Repita o procedimento para todos varreduraparceiros. (Nota: Neste projeto, peças pretas de feltro foram anexados ao documento abrange fornecido com o equipamento para evitar o brilho e contraste para fornecer contra o tecido da raiz A cor de fundo específico usado dependerá da cor do tecido que está sendo trabalhada.). </li><li> Peça a uma pessoa transformar as placas de 90 ° (placas foram virou anti-horário neste protocolo) e imediatamente substituir o fundo de feltro. </li><li> A outra pessoa deve estar de pé em frente ao computador, para que possam imediatamente pressione o botão &#39;Scan&#39;. </li><li> Fixe o fundo para o scanner com uma corda elástica (Figura 3). Peça a uma pessoa segure o fundo no lugar enquanto outros cargos a corda elástica. (Nota: Imediatamente após gravistimulation (rotação das placas em 90 °) e colocação do fundo de feltro, &#39;Scan&#39; deve ser pressionado). </li><li> Repita os passos de 1,17-1,21 para o resto dos scanners num único computer. </li><li> Repita os passos 1,6-1,22 para o próximo conjunto de scanners se aplicável. </li><li> Não deixe os scanners até várias imagens foram coletadas para se certificar de que eles estão economizando corretamente. </li><li> É ideal para manter os scanners em uma área que vai ser livre de perturbações para o tempo de verificação designados. Também é prudente considerar as condições ambientais na área de varredura para assegurar respostas fenotípicas ideais. </li><li> Quando a coleta de dados estiver concluída, pressione o botão abort verde em cada janela VueScan que coincide com cada scanner. </li><li> Feche para fora de todos os programas no computador. </li><li> Reinicie o computador e desligue todos os scanners antes de iniciar uma nova rodada de coleta de imagem. </li></ol>

<ol><li>Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+gravitropism+phenotype+in+glutamate+receptor-like+3.3+mutants+of+Arabidopsis+thaliana+using+machine+vision+and+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation.</a> Genetics. 186, 585-593 (2010).</li>
<li>Clack, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Tracking+of+Whiskers+in+Videos+of+Head+Fixed+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents.</a> PLoS Comp. Biol. 8, (2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+approaches+to+phenotyping%3A+high-throughput+phenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thoracic+Soc%22%5BJournal%5D)">Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics.</a> Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).</li>
<li>Houle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloquium+Paper%3A+Numbering+the+hairs+on+our+heads%3A+The+shared+challenge+and+promise+of+phenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).</li>
<li>Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+parental+environment+from+seed+size+effects+on+next+generation+growth+and+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Env%22%5BJournal%5D)">Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis.</a> Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).</li>
<li>Silk, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Descriptions+of+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Descriptions of Development.</a> Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).</li>
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<li>Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-vision+analysis+of+seedling+responses+to+light+and+gravity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity.</a> Plant J. 52, 374-381 (2007).</li>
<li>Iyer-Pascuzzi, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+Analysis+Platform+for+Automatic+Phenotyping+and+Trait+Ranking+of+Plant+Root+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems.</a> Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).</li>
<li>Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+Drosophila+wings%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of Drosophila wings.</a> BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).</li>
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<li>Perrin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+signal+transduction+in+primary+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Gravity signal transduction in primary roots.</a> Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).</li>
<li>Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+root+gravity+sensing+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction.</a> Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).</li>
<li>Harrison, B. R., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARL2%2C+ARG1+and+PIN3+define+a+gravity+signal+transduction+pathway+in+root+statocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes.</a> Plant J. 53, 380-392 (2007).</li>
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<li>Granier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENOPSIS%2C+an+automated+platform+for+reproducible+phenotyping+of+plant+responses+to+soil+water+deficit+in+Arabidopsis+thaliana+permitted+the+identification+of+an+accession+with+low+sensitivity+to+soil+water+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit.</a> New Phytol. , 169-623 (2006).</li>
<li>Walter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+seedling+growth+acclimation+towards+altered+light+conditions+can+be+quantified+via+GROWSCREEN%3A+a+setup+and+procedure+designed+for+rapid+optical+phenotyping+of+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species.</a> New Phytol. 174, 447-455 (2007).</li>
<li>Gregory, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+roots+with+high+resolution+X-ray+micro-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography.</a> Plant Soil. , 255-351 (2003).</li>
<li>Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+X-ray+imaging+of+plant+root+growth+and+water+uptake+in+thin-slab+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems.</a> Plant Soil. 255, 361-373 (2003).</li>
<li>Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+feature+counting+and+measurement+of+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">High-throughput feature counting and measurement of roots.</a> Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Observação fenotípica preciso é fundamental para a compreensão das manifestações da função do gene dentro de um organismo. Uma maneira de adquirir informação fenotípica é através da captura de dados de imagem de alta resolução. A plataforma baseada na do scanner desenvolvido permitiu coleção de muitas imagens (200 imagens / período scan) em alta resolução (4800 dpi) durante um número de horas. Além disso, a plataforma pode ser facilmente adaptado para uma variedade de ambientes de laboratório e em sala de aula, devido à flexibilidade do software VueScan para executar milhares de diferentes leitores que utilizam uma interface comum 18. O método aqui apresentado preenche um vazio em alto rendimento de captura de imagem, que se estende a partir de grandes instalações de fenotipagem de escala e sistemas automatizados implementáveis ​​em um único laboratório. As plataformas de alto rendimento disponíveis atualmente tendem a usar hardware de imagem especializada, incluindo câmeras montadas em suportes robóticos, para capturar imagens de alta resolução de primarily acima tecidos vegetais solo (por exemplo, centro de Planta Integrativa Tecnologia e da Scanalyzer HTS por LemnaTec) 20,21. Sistemas de imagem especializados utilizando raios-X e de ressonância magnética tecnologias também têm sido desenvolvidos para a imagem abaixo tecidos de terra com uma notável resolução à medida que crescem no ambiente do solo (por exemplo, Centro de Plantas Integrativa Tecnologia) 11,22,23. Este desenvolvimento de tecnologia mais especializada é geralmente o custo de produção, fazendo estudos fenotípicos dinâmicas mais difícil. É importante ressaltar que as necessidades de custo e de infra-estrutura para essas plataformas high-end fazê-los principalmente inviável para aplicação em laboratórios menores. Plataformas também têm sido desenvolvidos que usam a tecnologia de captura de imagem mais padrão e são bem adequados para a medição das respostas dinâmicas, como a resposta a um estímulo raiz gravidade. Por exemplo, as câmaras CCD têm sido utilizadas para capturar respostas plântulas individuais à luz e a gravidade em alta1,8,12 resolução espacial e temporal. Outros sistemas foram desenvolvidos permitindo a medição da orientação ponta da raiz de múltiplas raízes de uma única imagem (por exemplo, RootTipMulti pelo iPlant Collaborative) 17,24. No primeiro caso, o rendimento é relativamente baixo uma vez que só uma das plântulas é trabalhada por cada câmara de cada vez, enquanto que no segundo caso o rendimento é mais elevado, mas geralmente à custa da resolução. O procedimento descrito neste artigo apresenta uma plataforma para a captura de imagens de alta resolução em alto rendimento, com equipamentos e softwares que estão prontamente disponíveis e relativamente acessível. Usando esta configuração, 1.080 respostas de raiz individuais podem ser coletadas a cada semana em um único laboratório equipado com um banco de seis scanners. Em 15 meses de coleta uma média de 864 respostas individuais por semana, num total de 41.625 mudas foram digitalizadas para um estudo de genômica. Cerca de 15% das coleções individuais falhou devido a um erro de configuração, network falha ou mau funcionamento do equipamento. Outras respostas de 22% de falha, devido à falta de germinação ou crescimento da raiz insuficiente para provocar uma resposta de crescimento. O conjunto final de dados consiste de 27.475 respostas de mudas individuais a um estímulo gravidade das 163 linhagens recombinantes, mais 99 linhas isogênicas. Os dados foram coletados em um único laboratório, tornando esta uma abordagem muito de alto rendimento. Mesmo tendo em conta que o equipamento utilizado para a aquisição é relativamente barato, ele tem funcionado de forma confiável por mais de dois anos, mesmo com uso pesado. Embora este protocolo tem sido muito útil para os objetivos deste grupo de pesquisa, algumas limitações ainda existem. Devido à taxa de transferência de cerca de 50 GB de dados da imagem não comprimida por dia, era evidente que uma grande quantidade de espaço necessário para as imagens foi de casa, a menos que esquemas de compressão eficaz poderia ser desenvolvido. O problema foi temporariamente resolvido armazenamento através da compra de discos rígidos externos para cada computador. Além disso, dois 1Dispositivos de armazenamento de rede associadas 0 TB foram comprados. Mais tarde, os algoritmos de compressão foram desenvolvidos, como descrito acima, que pode ajudar a reduzir o tamanho dos dados em até 60% (figura 8). É importante notar que a velocidade à qual os dados podem ser guardados num dispositivo de armazenamento associado com a rede depende da velocidade da conexão de rede. Sistemas de compressão, também têm sido limitada devido ao desejo de evitar a perda de dados de imagem. Outras limitações específicas a um sistema de imagens baseado em scanner também estão sendo considerados. Por exemplo, em uma abordagem baseada no scanner de plântulas são expostos a luz de alta intensidade nas faixas brancas e potencialmente infravermelhos durante cada varrimento. Isso provavelmente afectando o crescimento de plântulas, embora mudas ainda pode ser observada a sofrer fortes respostas a um estímulo da gravidade (Figura 7). A melhoria futura poderia envolver programação scanners tais que apenas LEDs infravermelhos estão ativos. Uma área em developmen ativot é a criação de algoritmos de análise bem adaptado para a resolução e taxa de transferência de estes dados de imagem. O grande conjunto de dados gerados usando esse método baseado em scanner foi ideal para o desenvolvimento de ferramentas robustas para high-throughput fenotipagem de imagens de plântulas. O algoritmo de compressão empregada nestas imagens mostradas na Figura 7 é compatível com a afirmação de que eles são passíveis de aplicações de análise de imagem. Além disso, as imagens geradas podem ser analisados ​​pelo algoritmo publicado anteriormente, RootTrace 17,24, se forem coletadas em resolução mais baixa (menos de 1.200 dpi), e mudas individuais são segmentados a partir da imagem usando o algoritmo de compressão descrito acima antes da análise. Dados de crescimento da raiz pode ser extraído a partir de imagens reduzidas a 1.200 dpi, enquanto os dados de ângulo de ponta poderia ser extraído de imagens reduzidas para 900 dpi (observação não publicada). O procedimento descrito neste artigo se encaixa em seu próprio nicho no mundo do root imagem em que é alto rendimento e alta resolução, enquanto continuam sendo relativamente acessível. Uma vantagem adicional desta abordagem é que ele pode ser facilmente personalizado para acomodar as necessidades de imagem de um grupo de investigação particular.

Recolha de dados fenotípicos de alta resolução é útil em estudos que visam compreender a interacção da genética e do ambiente na mediação função do organismo 1,2. Estudos dessa natureza também são inerentemente grande escala, tornando-se necessário que, adicionalmente, métodos empregados para medir fenótipos neste contexto ser alta na taxa de transferência de 3,4. Ao estabelecer métodos para a investigação phenomics escala, trocas entre o throughput e resolução de entrar em jogo. Métodos que são superiores na taxa de transferência também tendem a ser mais baixos em resolução, tornando-o mais difícil de detectar pequenos efeitos da genética ou o ambiente 5. Alternativamente, os métodos que medem com mais cuidado um fenótipo desejado também tendem a ser mais baixos no rendimento, o que torna difícil fazer um levantamento efeitos genéticos e ambientais de forma ampla. Além disso, os métodos manuais para fenótipos quantificar, incluindo inspeção visual, pode estar sujeita a variações devido a diferenças nas per humanopercepção 6. Tecnologias de imagem pode fornecer uma ponte útil entre rendimento e resolução na obtenção de observações fenotípicas 7-9. Em geral, uma imagem é relativamente fácil para capturar, facilitando a produção, e quando feita com resolução suficiente, subtis fenótipos podem ser detectados 1,2,7. Tecnologias de imagem tendem a ser modificável para caber um sistema ou processo de interesse e são geralmente escalável 10-12. Devido a isso, as tecnologias de imagem são ideais para o desenvolvimento de trabalhos em larga escala de função do organismo. A resposta da raiz principal de um estímulo gravidade é um processo fisiológico complexo que ocorre dentro de um órgão morfologicamente simples. A resposta envolve a ativação de vias de sinalização que se propagam através do órgão de raiz e sua progressão é determinada por fatores genéticos e ambientais, incluindo fatores genéticos influenciados pelo ambiente 12-14 </sup&gt;. A resposta da raiz primária a um estímulo gravidade tem sido estudada pelo menos desde Darwin, ainda há muito a aprender sobre como ele funciona, particularmente nos primeiros eventos de sinalização e nos fatores mediadores resposta plasticidade 12,14,15. Ganhar uma compreensão detalhada da dinâmica de esta resposta é importante para encontrar maneiras de melhorar a capacidade de mudas para tornar-se estabelecida com sucesso dentro de um determinado ambiente 16. Além disso, a forma da raiz torna favorável para aplicações de processamento de imagem 8,12,17. Tomados em conjunto, a resposta gravitrópico raiz é um sistema ideal para o desenvolvimento de tecnologia de imagem de alto rendimento com a finalidade de realização de estudos de genômica de nível de função do organismo. Neste relatório, uma alta taxa de transferência, método de alta resolução para captura de imagem da resposta gravitrópico root usando baratos, scanners de mesa comercialmente disponíveis é apresentada. A visão geral doprotocolo é demonstrado na Figura 1. Mudas plantadas em placas de ágar foram posicionados em scanners de mesa orientados verticalmente equipados com suportes de acrílico personalizados placa. As imagens foram coletadas a cada poucos minutos a 4.800 dpi e salvas em uma unidade local ou servidor de dados. Metadados associados a cada série de imagens são armazenadas em um banco de dados e as imagens armazenadas são processados. A abordagem utiliza o software VueScan para captura de imagem. VueScan pode ser usado para executar mais de 2.100 scanners diferentes em Windows, Mac, ou sistemas operacionais Linux (ver Tabela Materiais). A resolução do scanner de 4800 dpi foi utilizada nesta aplicação para corresponder à resolução alcançada em estudos anteriores usando câmeras CCD fixos 1,8,12. A flexibilidade do software VueScan juntamente com a interface comum que utiliza para qualquer scanner é executado permite que os usuários adotem prontamente praticamente qualquer hardware digitalizador de resolução suficiente para o protocolo apresentado neste artigo. Rendimento atual permite a recolha de216 respostas individuais por dia. A tecnologia é adaptável e escalável para uso em instituições que vão desde escolas a universidades de pesquisa. Além disso, as imagens recolhidas são de qualidade suficiente para aplicações de análise de imagem.

<table><tbody><tr><td>Scanners de Foto Epson Perfection V700</td><td>Modelo</td> de Scanner <td>Epson</td><td></td></tr> <tr><td>B11B178011-Plexiglas</td> <td>-</td><td></td> <td>Feito sob medida. Veja a Figura 2.</td></tr><tr><td>Smart Strap Bungee Cords</td><td>SmartStraps</td><td>Wal-Mart 1079478</td><td></td></tr><tr><td>Brinks Digital Outdoor Timers</td><td>Brinks</td><td>Wal-Mart 42-1014-2</td><td></td></tr><tr><td>Software VueScan</td><td>Hamrick Software</td><td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a>Software de</td><td></td></tr> <tr><td>Segmentação</td><td>Chris Wentworth, Doane College</td><td></td><td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td></tr><tr><td>Fita Micropore 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-061-655-Suportes</td><td></td></tr> <tr>de <td>retenção</td> <td>-</td><td></td> <td>Feito sob medida colando dois suportes para biscoitos juntos.</td></tr></tbody></table>

usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da arabidopsis root gravitrópico response

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Os esforços de pesquisa em biologia exigem cada vez mais o uso de metodologias que permitem a coleta de grandes volumes de dados de alta resolução. Um desafio laboratórios podem enfrentar é o desenvolvimento ea consecução desses métodos. Observação de fenótipos em um processo de interesse é um objectivo típico de laboratórios de pesquisa que estudam a função do gene e isso muitas vezes é conseguido através de captura de imagem. Um processo especial, que é passível de observação usando abordagens de imagem é o crescimento corretiva de uma raiz de mudas que foi deslocado de alinhamento com o vetor de gravidade. Plataformas de imagem usado para medir a resposta gravitrópico raiz pode ser caro, relativamente baixa na taxa de transferência, e / ou de trabalho intensivo. Estas questões foram abordadas através do desenvolvimento de um método de captura de imagem de alto rendimento com baixo custo, mas de alta resolução, scanners de mesa. Usando este método, as imagens podem ser capturadas a cada poucos minutos a 4.800 dpi. A configuração atual permite a coleta de 216 indivíduo responses por dia. Os dados de imagem coletados são de ampla qualidade para aplicações de análise de imagem.

Imagens representativas Esta abordagem permite a produção rápida de alta resolução de séries temporais de Arabidopsis crescimento das plântulas. Primeiras imagens e último de uma corrida de scanner são mostrados nas Figuras 7A e 7B. Figuras 7C e 7D mostrar os melhores resultados a partir de metade de uma imagem de um scanner completo. Alguns problemas que podem afectar a qualidade da imagem são mostrados nas Figuras 7A e 7B. Essas questões incluem variação na germinação, variação na trajetória de crescimento das mudas no início da corrida, e acúmulo de condensação durante a digitalização. A condensação pode em grande parte ser resolvido pelo aumento da quantidade de Triton X-100 aplicada ao interior da tampa do prato. Outros fatores que podem inibir a coleção de imagens precisas são configuração incorreta da caixa de corte com relação às placas de posição da placa e posicionamento de tal forma que eles estão distorcidos em relação a caixa de corte. Aplicação Análise de Imagem: Compressão de Imagem Uma vez que uma seqüência temporal de imagens de scanner foi obtido, ele deve ser armazenado com segurança em uma forma acessível de rede para facilitar a análise de imagem. Os arquivos de imagem associados a um prazo de scanner indivíduo ocupar uma quantidade significativa de espaço no disco rígido. Um único arquivo TIFF coletadas em 4.800 dpi é de cerca de 220 MB e uma corrida típica do scanner gera 200 arquivos de imagem. Portanto, cerca de 44 GB de espaço em disco rígido é necessária por corrida. Para reduzir os custos de armazenamento e de transmissão de rede associados com a análise da imagem, é desejável reduzir a quantidade de espaço necessário para armazenar dados de imagem e, ao mesmo tempo, minimizando a perda de dados. Análise Downstream envolverá a identificação de cada muda em arquivos de imagem subseqüentes associadas com uma corrida experimental. Portanto, segmentando a única plântula a partir da imagem do scanner pode facilitar a análise a jusante. Porque a segmentação da plântula longe do resto dos poimagem e também pode reduzir significativamente o armazenamento de desnecessários pixels de fundo, esta abordagem também leva a uma redução significativa no tamanho dos dados. Além disso, se a análise a jusante é focado sobre o tecido da raiz, pode não ser necessário para reter a informação de cor desde que os pixels da raiz são relativamente estreitos no seu espaço de cor. Um protocolo de processamento de imagem de computador e código para reduzir o tamanho de dados, tanto segmentar fora mudas individuais e converter imagens para escala de cinza tem sido desenvolvido. A abordagem resulta em uma redução de 60% nos requisitos de espaço de armazenamento. O fluxo de trabalho usado para atingir esta compressão de dados é descrita nos seguintes passos: <ol><li> Comece com uma série de tempo de arquivos de imagem do scanner em uma única pasta. </li><li> Para cada imagem, converte a partir de uma escala de cinzentos para RGB (Figura 8, em cima). </li><li> Dividir a imagem em lados esquerdo e direito. </li><li> Extraia cada muda a partir da imagem em seu próprio arquivo (Figura 8).Isto é feito através da aplicação de um limiar para converter pixels de preto ou de branco e, em seguida, calcular a intensidade total de pixels de cada linha da imagem. A linha com a maior intensidade é identificado e cada pixel é classificado como &#39;planta&#39; ou &#39;nonplant&#39; com base na intensidade de seus vizinhos. O centro de cada &#39;planta&#39; dentro desta linha é encontrado ea partir desse ponto uma caixa de colheita de um tamanho pré-determinado é desenhada (Figura 8, abaixo). </li><li> Crie uma pasta separada para cada um dos lados da imagem (esquerda e direita) com subpastas separadas para cada muda para o armazenamento de arquivos de imagem séries de tempo individual. </li><li> Arquivar as pastas resultantes em um arquivo compactado. </li></ol> Um código que realiza essas etapas foi desenvolvido utilizando a linguagem de programação Python 20. O algoritmo permite uma redução de aproximadamente 60% no tamanho dos dados e é bem sucedido na identificação de todas as plântulas individuais em 90% do imag digitalizadorarquivos e analisados ​​até agora. Os códigos estão disponíveis gratuitamente para download sob a licença GNU General Public License versão 3 (ver Tabela Materiais). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. O procedimento de digitalização começa com o plantio de sementes (até nove sementes de Arabidopsis por placa) e termina com o armazenamento de dados e processamento de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> Emplate Figura 2. T para construção de suporte placa de Petri. Ple<html> xiglas foi cortada de tal forma que a largura de encaixar a base de cópia (neste caso 227 milímetros) e o comprimento foi de 128 mm. Dois círculos com um diâmetro de 88 milímetros foram cortadas a parte restante de modo a que eles foram distribuídos uniformemente ao longo da largura e comprimento do suporte. O apoio foi afixada à mesa com tiras 3M comando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> Configuração Scanner Figura 3. Após mudas foram gravistimulated ea tampa documento posicionado. Esta é a configuração do scanner na etapa 1.21 de configuração do scanner e coleção de imagens.&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Captura de tela de configurações selecionadas para a etapa 1.8 do programa de instalação de scanner e coleção de imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Captura de tela do software VueScan durante os passos 1.9 e 1.10 do programa de instalação de scanner e coleção de imagens. A caixa vermelha destaca o tamanho do corte, enquanto a caixa azul destaca configurações específicas fo<html> r-x e utilizado a fim de capturar mudas e informações rótulo distância y. A região da mesa a ser digitalizada é mostrada como uma linha pontilhada na área de pré-visualização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> Figura 6. Seleção de pasta de destino para a etapa 1,12 de configuração do scanner e coleção de imagens. Ao pressionar o botão @ ao lado da caixa de diálogo Default Folder (seta vermelha) permite que o usuário selecione a pasta de destino apropriado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . re 7 &quot;fo: content-width =&quot; 5 polegadas &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Figura 7 (AD). As imagens acima são exemplos de que o coletado usando o método descrito neste trabalho. Painéis A, B e C, D são as primeiras imagens e finais, respectivamente, a partir de um único período de verificação. A, B mostram a completa área digitalizada, enquanto C, D são uma região recortada da área digitalizada, mostrando uma única chapa. Várias inconsistências podem ser observados. O painel A mostra variação na germinação e na trajetória de crescimento. Painel B (as mesmas mudas como uma imagem; 9 horas posteriores) mostra que as placas podem se acumular condensação. Os painéis C e D são consideradas como bons resultados devido a um crescimento robusto of mudas e qualidade de imagem em toda a corrida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> Figura 8. O algoritmo de compressão de imagem desenvolvida converte uma imagem do scanner à escala cinzenta (em cima). A imagem é dividida em metades direita e esquerda e das fronteiras da imagem são removidos (não mostrado). Os cargos de mudas individuais em cada metade são identificados por encontrar a linha com a maior intensidade total de pixels. Essas posições são usadas para definir uma nova área da cultura, aplicada a todas as mudas na placa (em baixo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Este protocolo descreve um processo para cobrança rápida de imagens de plântulas de Arabidopsis que respondem a um estímulo gravidade usando scanners de mesa disponíveis comercialmente. O método permite a baixo custo, a captura de grandes volumes de imagens de alta resolução passíveis de algoritmos de análise a jusante.

Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

O objetivo geral deste vídeo é ilustrar um método baseado em scanner de captura de imagem de alta resolução da resposta trópica da raiz na planta modelo. Para iniciar este protocolo, as sementes do estoque de sementes designado são plantadas em placas de Petri contendo um meio transparente Depois que as sementes germinaram pelo período de tempo designado, as placas de Petri são removidas da câmara de crescimento, preparadas para varredura e, em seguida, colocadas em scanners de mesa orientados verticalmente. As placas são então giradas 90 graus e digitalizadas por um período de tempo designado.As imagens são salvas no computador ou em um dispositivo de armazenamento de dados e usadas posteriormente para processamento de imagens. Antes da aquisição da imagem, prepare placas de aga contendo os dois tecidos vegetais digitalizados B. Primeiro, absorva qualquer condensação coletada na tampa e nas laterais da placa AGA com um pano de limpeza.Em seguida, aplique uma quantidade generosa de Triton X 100 para evitar condensação futura. Por fim, finalize esse processo envolvendo a placa com fita micropore para prender a tampa e permitir que a ventilação inicie a aquisição da imagem. Configure pastas para salvar as imagens no local desejado.Cada nome de pasta consiste em uma compilação de metadados relacionados às informações a serem verificadas. Neste exemplo, a idade da ID exclusiva, o tamanho e o estoque de sementes foram dados incluídos nos nomes das pastas. Esses metadados podem ser copiados e colados em um nome de pasta.Este protocolo pressupõe que mais de um scanner está sendo usado para coletar imagens e fornece instruções para conectar vários scanners a um computador. Por esse motivo, três pastas são configuradas para salvar imagens. A próxima etapa é definir os cronômetros para um tempo de coleta designado.Como ainda há um pouco de preparação a ser feita neste momento, certifique-se de definir os cronômetros para um pouco mais de tempo. Em seguida, ligue o primeiro scanner e abra o programa de verificação de visualização. Na guia de entrada, defina a origem para o scanner correto e a caixa suspensa de repetição automática para nenhum na guia de corte.Defina a área de visualização como Máximo e pressione visualizar. Escolha uma caixa de corte que capture a região de interesse e defina a área de visualização como caixa de corte. Em seguida, visualize a imagem novamente.Para salvar os dados coletados no local desejado, pressione a guia de saída e encontre os nomes de pastas criados anteriormente que correspondem a cada scanner. Ligue o próximo scanner E repita a verificação de visualização. Configure as instruções para os outros dois scanners, certificando-se de escolher as pastas corretas nas quais salvar os dados.Também é importante passar por cada guia e certificar-se de que todas as configurações do scanner estejam conforme desejado. Nosso laboratório descobriu que as configurações a seguir funcionam melhor para o tipo de coleta de imagens que está sendo feita. No entanto, diferentes tipos de coleta de imagens podem exigir outras configurações.Depois que todas as configurações estiverem marcadas, escolha a guia de entrada e defina a caixa suspensa de repetição automática como contínua em todos os três scanners. Coloque as placas preparadas nos scanners com as mudas orientadas horizontalmente e coloque temporariamente o lado de feltro do fundo contra as placas para garantir a estabilidade do scanner. Se realizar este protocolo com um parceiro, peça a uma pessoa que gire as placas 90 graus e imediatamente o fundo com visão de feltro, a outra pessoa pressiona o botão de varredura e ambos prendem o fundo ao scanner com uma corda elástica.Repete esse processo para os scanners dois e três. Cada imagem deve levar cerca de dois a três minutos para ser completamente digitalizada. As imagens finais aparecerão conforme mostrado. É uma boa ideia verificar as pastas nas quais as imagens estão sendo salvas para garantir que todas estejam salvas corretamente.É ideal manter os scanners em uma área livre de perturbações durante o tempo de varredura designado. Também é prudente considerar as condições ambientais na área de varredura para garantir respostas fenotípicas ideais. As imagens a seguir são exemplos daquelas coletadas usando o método descrito neste vídeo.Os painéis A e B e C e D são a primeira e a última imagem de um único período de varredura. A e B mostram a área de digitalização completa. Enquanto C e D são uma região recortada da área digitalizada mostrando uma única placa, várias inconsistências podem ser observadas.A Figura A mostra a variação na germinação e na trajetória de crescimento. A imagem B mostra que as placas podem acumular condensação, enquanto as imagens C e D são consideradas bons resultados devido ao crescimento robusto das mudas e à qualidade da imagem ao longo da execução. O procedimento descrito neste artigo se encaixa em seu próprio nicho no mundo da imagem de raízes, pois é de alto rendimento e alta resolução, embora ainda seja relativamente acessível.Um benefício adicional dessa abordagem é que ela pode ser facilmente personalizada para acomodar as necessidades de imagem de um determinado grupo de pesquisa. O método também está sendo customizado para imageamento de outros.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aprenda a capturar imagens de alta resolução da resposta gravitropica de raízes de Arabidopsis usando scanners de mesa. Este método econômico permite coleta em alta vazão para análises fenotípicas em biologia vegetal.

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