Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response
25 de janeiro de 2014
Este protocolo descreve um processo para cobrança rápida de imagens de plântulas de Arabidopsis que respondem a um estímulo gravidade usando scanners de mesa disponíveis comercialmente. O método permite a baixo custo, a captura de grandes volumes de imagens de alta resolução passíveis de algoritmos de análise a jusante.
O objetivo geral deste vídeo é ilustrar um método baseado em scanner de captura de imagem de alta resolução da resposta trópica da raiz na planta modelo. Para iniciar este protocolo, as sementes do estoque de sementes designado são plantadas em placas de Petri contendo um meio transparente Depois que as sementes germinaram pelo período de tempo designado, as placas de Petri são removidas da câmara de crescimento, preparadas para varredura e, em seguida, colocadas em scanners de mesa orientados verticalmente. As placas são então giradas 90 graus e digitalizadas por um período de tempo designado.
As imagens são salvas no computador ou em um dispositivo de armazenamento de dados e usadas posteriormente para processamento de imagens. Antes da aquisição da imagem, prepare placas de aga contendo os dois tecidos vegetais digitalizados B. Primeiro, absorva qualquer condensação coletada na tampa e nas laterais da placa AGA com um pano de limpeza.
Em seguida, aplique uma quantidade generosa de Triton X 100 para evitar condensação futura. Por fim, finalize esse processo envolvendo a placa com fita micropore para prender a tampa e permitir que a ventilação inicie a aquisição da imagem. Configure pastas para salvar as imagens no local desejado.
Cada nome de pasta consiste em uma compilação de metadados relacionados às informações a serem verificadas. Neste exemplo, a idade da ID exclusiva, o tamanho e o estoque de sementes foram dados incluídos nos nomes das pastas. Esses metadados podem ser copiados e colados em um nome de pasta.
Este protocolo pressupõe que mais de um scanner está sendo usado para coletar imagens e fornece instruções para conectar vários scanners a um computador. Por esse motivo, três pastas são configuradas para salvar imagens. A próxima etapa é definir os cronômetros para um tempo de coleta designado.
Como ainda há um pouco de preparação a ser feita neste momento, certifique-se de definir os cronômetros para um pouco mais de tempo. Em seguida, ligue o primeiro scanner e abra o programa de verificação de visualização. Na guia de entrada, defina a origem para o scanner correto e a caixa suspensa de repetição automática para nenhum na guia de corte.
Defina a área de visualização como Máximo e pressione visualizar. Escolha uma caixa de corte que capture a região de interesse e defina a área de visualização como caixa de corte. Em seguida, visualize a imagem novamente.
Para salvar os dados coletados no local desejado, pressione a guia de saída e encontre os nomes de pastas criados anteriormente que correspondem a cada scanner. Ligue o próximo scanner E repita a verificação de visualização. Configure as instruções para os outros dois scanners, certificando-se de escolher as pastas corretas nas quais salvar os dados.
Também é importante passar por cada guia e certificar-se de que todas as configurações do scanner estejam conforme desejado. Nosso laboratório descobriu que as configurações a seguir funcionam melhor para o tipo de coleta de imagens que está sendo feita. No entanto, diferentes tipos de coleta de imagens podem exigir outras configurações.
Depois que todas as configurações estiverem marcadas, escolha a guia de entrada e defina a caixa suspensa de repetição automática como contínua em todos os três scanners. Coloque as placas preparadas nos scanners com as mudas orientadas horizontalmente e coloque temporariamente o lado de feltro do fundo contra as placas para garantir a estabilidade do scanner. Se realizar este protocolo com um parceiro, peça a uma pessoa que gire as placas 90 graus e imediatamente o fundo com visão de feltro, a outra pessoa pressiona o botão de varredura e ambos prendem o fundo ao scanner com uma corda elástica.
Repete esse processo para os scanners dois e três. Cada imagem deve levar cerca de dois a três minutos para ser completamente digitalizada. As imagens finais aparecerão conforme mostrado. É uma boa ideia verificar as pastas nas quais as imagens estão sendo salvas para garantir que todas estejam salvas corretamente.
É ideal manter os scanners em uma área livre de perturbações durante o tempo de varredura designado. Também é prudente considerar as condições ambientais na área de varredura para garantir respostas fenotípicas ideais. As imagens a seguir são exemplos daquelas coletadas usando o método descrito neste vídeo.
Os painéis A e B e C e D são a primeira e a última imagem de um único período de varredura. A e B mostram a área de digitalização completa. Enquanto C e D são uma região recortada da área digitalizada mostrando uma única placa, várias inconsistências podem ser observadas.
A Figura A mostra a variação na germinação e na trajetória de crescimento. A imagem B mostra que as placas podem acumular condensação, enquanto as imagens C e D são consideradas bons resultados devido ao crescimento robusto das mudas e à qualidade da imagem ao longo da execução. O procedimento descrito neste artigo se encaixa em seu próprio nicho no mundo da imagem de raízes, pois é de alto rendimento e alta resolução, embora ainda seja relativamente acessível.
Um benefício adicional dessa abordagem é que ela pode ser facilmente personalizada para acomodar as necessidades de imagem de um determinado grupo de pesquisa. O método também está sendo customizado para imageamento de outros.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para capturar imagens de alta resolução de plântulas de Arabidopsis em resposta à gravidade utilizando scanners de mesa. A abordagem é economicamente viável e permite a coleta de grande volume de imagens adequadas para análises posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Análise de imagem
- Resposta trópica da raiz
Antecedentes
- Arabidopsis atua como organismo modelo na pesquisa vegetal.
- Compreender as respostas das raízes à gravidade é fundamental para estudos de desenvolvimento vegetal.
- Técnicas de imagem de alta resolução aprimoram a coleta de dados para análise fenotípica.
- Escâneres de mesa oferecem uma solução acessível para imageamento de alto rendimento.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método baseado em scanner para capturar respostas tropicas das raízes.
- Facilitar a coleta de imagens para análise subsequente.
- Fornecer um protocolo de imageamento personalizável para grupos de pesquisa.
Métodos Utilizados
- As sementes são germinadas em meio transparente em placas de Petri.
- As placas são digitalizadas utilizando scanners de mesa com orientação vertical.
- Vários scanners podem ser conectados a um único computador para maior eficiência.
- As configurações de aquisição de imagem são ajustadas para obter resultados ideais.
Resultados Principais
- As imagens capturadas mostram variações nas trajetórias de germinação e crescimento.
- Foram observados problemas de condensação nas placas, afetando a qualidade das imagens.
- Foram obtidas imagens de alta qualidade, demonstrando crescimento vigoroso das plântulas.
- O método permite imagens de alto rendimento e personalizáveis.
Conclusões
- O protocolo fornece um meio eficaz para o imageamento das respostas da raiz.
- É adaptável a diversas necessidades de imageamento em ambientes de pesquisa.
- A abordagem equilibra custo e eficiência na coleta de dados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem fenotípica de alta resolução da resposta gravitrópica da raiz permite a redução mecanicista de riscos na validação inicial de alvos para a descoberta de terapêuticas baseadas em plantas. Esta abordagem de imagem de baixo custo e alto rendimento sustenta a confiança preditiva em estudos de função gênica ao gerar dados quantitativos e com registro temporal adequados para pipelines de análise de imagem em etapas posteriores. O método enfrenta os desafios de escalabilidade na biologia de descoberta, mantendo a integridade dos dados para continuidade translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da medição quantitativa de trajetórias de crescimento radicular como leitura fenotípica da função gênica.
- Valor Operacional: Oferece desvio biológico por meio da aquisição em alto rendimento de 216 respostas individuais por dia com resolução de 4.800 dpi.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao gerar dados de imagem de alta qualidade em abundância para aplicações de análise de imagem que esclarecem variações nas trajetórias de crescimento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados (plântulas de Arabidopsis em meio transparente) para fluxos de trabalho padronizados e reproduzíveis de triagem de compostos ou genética.
- Valor Operacional: Garante a prontidão do ensaio por meio da aquisição automatizada de imagens com intervalo de tempo a cada poucos minutos, utilizando scanners planos de baixo custo.
- Valor de Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma e adaptação entre diferentes grupos devido ao design personalizável do protocolo e à conectividade de múltiplos scanners a um único computador.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Mantém a continuidade do sistema relevante para a doença, desde a descoberta até a quantificação fenotípica da resposta trópica da raiz, um mecanismo conservado em organismos modelo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz a ambiguidade na validação de alvos ao isolar a variável independente (deslocamento do vetor gravitacional) e medir a variável dependente (crescimento corretivo) com alta resolução temporal.
- Confiabilidade Preditiva: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer resultados quantitativos que permitem análise estatística das variações na germinação e na trajetória de crescimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses até a identificação de compostos líderes, fornecendo dados fenotípicos quantitativos padronizados que orientam decisões de avançar/não avançar na validação precoce de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a observação do crescimento corretivo em raízes de plântulas deslocadas do alinhamento com o vetor gravitacional.
- Triagem: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio da preparação controlada das placas (prevenção de condensação com Triton X-100 e fita microporosa) e protocolos consistentes de salvamento de imagens.
- Análises: Gera conjuntos de dados de imagens com intervalos de tempo em resolução de 4.800 dpi, adequados para medições quantitativas de trajetórias de crescimento e consistência da germinação.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer leituras fenotípicas relevantes para doenças em um sistema modelo passível de perturbações genéticas e farmacológicas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma capacidade de imagem reutilizável, e não como uma técnica de uso único, devido ao baixo custo, alta produtividade e facilidade de personalização entre grupos de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista na fenotipagem da resposta gravitrópica.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade alcançadas por meio de protocolos automatizados de digitalização e nomenclatura de pastas orientada por metadados para organização de dados.
- Valor Estratégico: Decisões mais assertivas de prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas por meio da desconsideração precoce de riscos fenotípicos utilizando imagens de alto volume e alta resolução.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, possibilitadas por dados imagéticos de alta qualidade em abundância, que apoiam aplicações de análise de imagens.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em biologia vegetal e protocolos de aquisição de imagens para imagem de raízes de Arabidopsis.
- Os equipamentos necessários incluem scanners de mesa com orientação vertical, capazes de resolução de 4.800 dpi e conectividade a um único computador para operação com múltiplos scanners.
- A padronização entre equipes exige preparação consistente das placas (controle de condensação com Triton X-100 e fita microporosa) e nomenclatura de pastas baseada em metadados para salvamento reprodutível de dados.
- As considerações para adaptação em diferentes sistemas modelo envolvem o ajuste da orientação do scanner e da preparação das placas para diferentes tamanhos de plântulas e condições de crescimento.
- As limitações práticas incluem o controle da condensação nas placas e a garantia de orientação estável das plântulas durante a rotação de 90 graus para indução da resposta gravitrópica.
