Name: A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a suplementar ácidos graxos poliinsaturados na dieta de Caenorhabditis elegans para estudar função lipídica e regulação metabólica. Este método permite analisar efeitos fisiológicos em nematoides.

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Agradecemos a Chris Webster para a realização dos experimentos preliminares apresentadas na Figura 3 dos resultados representativos e Jason Watts e Chris Webster pelos comentários úteis sobre o manuscrito. O financiamento para este estudo foi fornecido por uma concessão do National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) para JLW. Algumas cepas de nematóides utilizados neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo Escritório de Investigação NIH Programas de Infra-estrutura (P40 OD010440).

Os ácidos graxos poliinsaturados são sensíveis ao calor, luz e oxigênio. Portanto, é preciso ter cuidado ao preparar pratos de suplementação de ácidos graxos de tal forma que os ácidos graxos não estão expostos ao excesso de calor e luz. Meios de NGM contendo 0,1% de Tergitol (NP-40) é esterilizado e parcialmente arrefecida, após o que os sais de sódio de ácido gordo são adicionados com agitação constante. As placas são deixadas a secar no escuro. A absorção de ácidos gordos por C. elegans cultivadas nestas placas podem então ser monitorizado por cromatografia em fase gasosa. 1. Preparação de Ácidos Graxos Supplemented Mídia <ol><li> Medir componentes de mídia em um frasco de tamanho adequado. Por 1 L, adicionar 17 g de Bacto-ágar, 2,5 g de triptona, 3 g de NaCl, 1 mL de 5 mg / ml de colesterol dissolvido em etanol, e 10 ml de 10% de Tergitol dissolvido em água. </li><li> Adicionar 80% do volume final pretendido de água Millipore e autoclave os meios de comunicação, juntamente com os frascos de vidro vazio (igual ao número de diferenteAs concentrações de ácido gordo a ser testado), bem como apropriado provetas. </li><li> Frescos mídia em um banho-maria regulado a 55 ° C. Enquanto a mídia está esfriando preparar a solução estoque de trabalho do sal sódico do ácido graxo por quebrar aberto o frasco de vidro, utilizando-se as precauções de segurança e garantindo partículas de vidro não se misturam com os ácidos graxos. Pesar ácido graxo suficiente para fazer um estoque de trabalho de 100 mm. </li><li> Levar a solução de ácido gordo para uma concentração final de 100 mM com a água purificada. Totalmente dissolvendo o sal de sódio de ácido gordo, tipicamente leva cerca de 20-30 minutos. Purga-se o estoque de trabalho de ácido gordo com de árgon ou de azoto, porque o contacto com um gás inerte, impede a oxidação. Tapar o frasco e armazenar o material a trabalhar, no escuro, até meios de ter arrefecido. </li><li> (Opcional) Se o material de RNAi é desejado, medir a ampicilina e isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) soluções aqui. </li><li> Quando o agar foi arrefecida a 55 ° C adicionar por 1 L: 1ml de 1 M de MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl2, e 25 ml de tampão fosfato (108,3 g de KH 2 PO 4 e 35,6 g de K 2 HPO 4 por 1 L autoclavado). Adicionar o filtro ampicilina esterilizados e soluções IPTG se fazer placas de RNAi. Para todos os tipos de placas, adicionar água estéril para levar o volume do meio final a 1 L. </li><li> Perto de uma chama, a transferência de mídia a uma autoclave e adequadamente dimensionado cilindro graduado e adicione água estéril morna para volume desejado. Mídia de transferência de volta ao frasco inicial e misturar por agitação. </li><li> Perto de uma chama, transferir mídia para um número de garrafas igual ao número de concentrações a serem testadas através da medição com um autoclavado e dimensionado adequadamente cilindro graduado. Manter os meios de comunicação distribuídos em alíquotas como líquido usando um banho de água até que o estoque de trabalho de ácido gordo foi totalmente dissolvida. </li><li> Coloque uma garrafa em uma placa de agitação e mexa até que a mídia é quente ao toque, mas não quente. Certifique-se de deixar-se suficientetempo para mexer na solução estoque de ácidos graxos e despeje placas perante a mídia começa a solidificar. Se placa de agitação tem controle de temperatura, ajuste-o a 55 ° C. </li><li> Diluir o estoque trabalhando ácido graxo 100 mM na mídia para a concentração final desejada. Mídia Agitar até o precipitado branco é, em solução (aproximadamente um minuto). Mídia pode ainda estar um pouco nublado depois. </li><li> (Opcional) Se o material de RNAi é desejado adicionar ampicilina para 0,1 mg / mL e IPTG a 2 mM de concentração final. </li><li> Despeje mídia usando uma ajuda pipeta automática e uma estéril 25 ml pipeta, adicionando 8 ml de meio por placa de 60 mm ou 25 ml de mídia por placa de 100 mm. Repetir a adição de ácido gordo e de placa de derramamento passos para as garrafas restantes. </li><li> Após o ágar se ter solidificado, cobrir as placas com suplemento de ácidos graxos com uma caixa ou armazenar em temperatura ambiente em uma gaveta bem ventilada para proteger da oxidação luz. </li><li> Semente E. coli OP50 em placas de dois dias depois de ter placas secas.Para placas de 60 mm, uma pipeta 300 uL de uma cultura durante a noite OP50 (cultivados a 37 ° C). Se as placas de ARNi foram vertidas, semear com 300 uL de bactérias de RNAi depois as placas foram secas durante quatro dias. Placa tempo de secagem pode precisar de ser ajustado devido a diferenças de umidade em vários ambientes de laboratório. </li><li> Incubar as placas num ambiente escuro a temperatura ambiente, enquanto a camada de bactérias é a secagem. </li></ol> 2. Induzir a destruição das células germinativas por suplementação de ADGL <ol><li> C. elegans cultivadas em placas contendo 0,3 mM de DGLA (20:3 n-6) se tornar estéril devido à destruição das células germinais em ambos os estágios larvais e adultas nemátodos. <ol><li> Prepara-se uma população de larvas L1 sincronizado por tratamento hermafroditas grávidas com solução de hipoclorito alcalino (para uma solução de 10 ml: 0,5 ml de NaOH a 5M, 2,5 ml de lixívia doméstica, e 7 mL de H2O). Agite suavemente os hermafroditas grávidas nesta solução até que o verme adultos dissolver. Os ovos serão preservados, e pode ser sedimentado por centrifugação a baixa velocidade. </li><li> Lavar a preparação de ovo 3 vezes em tampão M9 (3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 mL de 1 M de MgSO4, H 2 O a 1 L. Adicionar MgSO4 após autoclavagem). Para fornecer oxigénio suficiente, ressuspender os ovos em um tubo de 15 ml de plástico para um volume final de 5 ml de tampão M9 e rocha num agitador durante a noite. </li><li> Larvas L1 devem ser adicionados às placas suplementadas dois dias após a sementeira com OP50, ou um dia após o plaqueamento das bactérias de RNAi. Incubar vermes a 20 ° C durante três dias, ou até se alcançar o estágio adulto. </li></ol></li><li> Os vermes adultos podem ser marcados para a esterilidade, utilizando um microscópio de dissecação com suficientemente alta ampliação para visualizar os embriões em desenvolvimento no útero. Perda de células germinativas de sucesso aparecerá como um vazio útero clara de ovos. </li><li> Worms também pode ser marcado por fixação e coloração com um nucleicocid corante diamindinophenylindole (DAPI), o que facilita a visualização de núcleos de células germinais e de embriões em desenvolvimento. Uma mancha DAPI rápida é conseguida seleccionando vermes em uma gota de tampão M9 sobre um vidro de relógio 9. <ol><li> Flood relógio de vidro com 1 ml de 0,2 ng / m. DAPI em solução de etanol a 95%, deixar repousar durante aproximadamente 5 min. </li><li> Escolha vermes em uma gota de Vectashield em um slide, e depois cobrir com uma lamela. </li><li> Lamela Seal e armazenar a 4 ° C no escuro durante a noite para a coloração ideal, no entanto slides podem também ser vistos imediatamente. Marcar a presença ou ausência de núcleos de células germinativas, utilizando um microscópio de fluorescência equipado com uma lâmpada de UV e um filtro. </li></ol></li></ol> 3. Confirmando Ácidos Graxos Captação por Cromatografia Gasosa Composição geral de ácidos graxos do C. elegans pode ser determinado através da produção de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAMEs), que são então separados e quantificados usando gás chromatography 4. <ol><li> Colete 500-1.000 vermes adultos, lavando-as fora das placas com água e transferir para um 13 milímetros x 100 mm parafuso de vidro tubo superior silanizada. </li><li> Vamos resolver vermes pela gravidade, e, em seguida, remover o máximo de água possível com uma pipeta Pasteur de vidro. </li><li> Lave vermes uma vez com água, e depois novamente remover o máximo de água possível. </li><li> FAMEs são formados por adição de 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4, em metanol, e, em seguida, o aquecimento a 70 ° C durante 1 hora em um banho de água. </li><li> Retire os tubos do banho-maria e deixe esfriar por 1 min. </li><li> Extrair EMAGs pela adição de 1,5 ml de água e 0,25 ml de hexano. </li><li> Recap tubos e agitar vigorosamente. </li><li> Tubos de centrifugação numa centrífuga clínica de mesa durante 1 min na velocidade máxima para separar o hexano a partir de um solvente aquoso. </li><li> Transferir hexano (camada superior) para uma inserção de GC frasco dentro de um frasco de GC, tomando cuidado para não transferir qualquer da fase aquosa. Para GC umnálise, 1-2 ul de FAMEs em hexano é injectada numa coluna capilar de cromatografia gasosa polar adequado para análise EMAGs. O Agilent 7890 GC injector é de 250 ° C, com uma taxa de fluxo de 1,4 ml / min, e o forno do GC foi programado para uma temperatura inicial de 130 ° C, que é mantida durante 1 min. Subsequentemente, a temperatura é em rampa de 10 ° C / min até 190 ° C, e, em seguida, em rampa novamente a 5 ° C / min até 210 ° C e mantida durante mais 1 min. </li><li> Para assegurar que a absorção de DGLA ocorreu, analisar EMAGs por detecção de ionização de chama (FID) ou espectrometria de massa (MS) de detecção, utilizando-se padrões autênticos para a identificação de C. elegans ácidos graxos. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos um método de suplementação de C. elegans com ácidos gordos insaturados na dieta. Como mencionado acima, é preciso ter cuidado na preparação dos pratos PUFA suplementados porque a natureza reativa das ligações duplas em PUFAs faz com que esses ácidos graxos para ser sensível à oxidação através do calor e da luz 11. Para evitar a oxidação, é importante adicionar o AGPI para o meio de agar depois de os meios de comunicação de líquido tenha arrefecido para 55 ° C e armazena placas em um...

Os ácidos gordos são componentes estruturais essenciais das membranas, bem como moléculas de armazenamento de energia eficiente. Além disso, os ácidos gordos podem ser clivada a partir das membranas celulares por lipases e ser enzimaticamente modificada para produzir uma sinalização efectores. De ocorrência natural de ácidos gordos poli-insaturados (PUFAs) contêm duas ou mais ligações duplas cis. Os ômega-3 os ácidos gordos e os ácidos graxos ômega-6 são distinguidos um do outro com base nas posições de ligações duplas em relação ao final de metila do ácido graxo. Dietas saudáveis ​​exigem tanto de ômega-3 os ácidos graxos ômega-6 e. No entanto, as dietas ocidentais são particularmente ricas em ômega-6 ácidos graxos e pobre em ômega-3 ácidos graxos. Uma alta ómega-6 para ácidos gordos ómega rácio-3 está associada com um risco aumentado de doenças cardiovasculares e inflamatórias, no entanto, as funções benéficas e prejudiciais precisas de ácidos gordos específicos não são bem compreendidos 2. Os lombriga elega Caenorhabditisns é útil no estudo de função ácido graxo porque sintetiza todas as enzimas necessárias para produzir uma gama de ácidos graxos ômega-6 e ômega-3, incluindo um omega-3 dessaturase, uma atividade que está ausente na maioria dos animais 3,4. Mutantes sem enzimas dessaturases de ácido gordo não produzem PUFA específicos, que conduz a uma variedade de defeitos do desenvolvimento e neurológicas 4-6. Para estudar os efeitos fisiológicos dos ácidos gordos alimentares, temos desenvolvido um ensaio bioquímico compatível com a análise genética utilizando tanto mutante e RNAi técnicas knock-down em C. elegans. A suplementação com PUFA específicos é conseguida por adição de uma solução de sal de sódio de ácido gordo para o meio de agar antes do vazamento. Isto resulta em PUFA absorção pela E. fonte de alimento coli, onde se acumula nas membranas bacterianas. C. elegans ingerir a bactéria contendo PUFA, e essa suplementação alimentar é suficiente para resgatar a defecst de mutantes PUFA com deficiência. A suplementação da maioria dos ácidos graxos não tem efeitos prejudiciais para os animais selvagens, no entanto, ômega-6 ácidos graxos específicos, especialmente o ácido gama-linolênico dihomo (DGLA, 20:3 n-6) causam uma destruição permanente de C. células germinativas elegans 7,8. Cromatografia em fase gasosa é usado para monitorar a absorção do ácido gordo completada na fonte alimentar bacteriana (ou OP50 ou HT115), bem como nos nemátodes. A adição do Tergitol detergente (NP-40) nos meios permite a distribuição uniforme de ácidos gordos através de toda a placa e uma absorção mais eficiente dos ácidos gordos pela E. coli e os nemátodos. Verificou-se que os ácidos gordos insaturados são facilmente absorvido pelas bactérias e C. elegans, mas a absorção de ácidos gordos saturados, é muito menos eficiente. Este artigo irá descrever passo a passo a forma de complementar o ágar com ácidos graxos, bem como a forma de controlar a absorção de ácidos graxos em poe nematóide utilizando cromatografia gasosa.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td> <td>(5 mg/mL em etanol)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Linolenato de dihomogama de sódio</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Água</td> <td>Millipore estéril morna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água estéril para coleta de vermes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease para solução estoque DGLA</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml em água (para placas de RNAi)</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M em água (para placas de RNAi)</td></tr><tr><td>HSO4</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher</td><td>Scientific H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinofenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de vidro autoclaváveis com barras de agitação</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado de vidro autoclavável</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitação</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria a 55+ &deg; C</td><td>Precision Scientific Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro marrom com tampa de rosca</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td><td></td><td></td>de gás argônio</tr><tr><td>Auxiliar de pipeta automatizado</td><td>Pipeta-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas estéreis (25 ml)</td><td>Bico de Bunsen Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Leica</td><td></td><td></td>TLB3000</tr><tr><td>Tubo de vidro silanizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>para derivitização FAMEs</td></tr><tr><td>PTFE Tampas de rosca</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa clínica</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Crimp Vial</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Inserção do frasco</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Tampa do frasco</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Cromatógrafo Gasoso</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Detector de Espectrometria de Massa</td><td>Coluna Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>para cromatografia gasosa</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0,25 mm coluna capilar de sílica fundida</td></tr></tbody></table>

a suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Os ácidos graxos são essenciais para inúmeras funções celulares. Eles servem como moléculas de armazenamento de energia eficientes, compõem o núcleo hidrofóbico das membranas, e participe de várias vias de sinalização. Caenorhabditis elegans sintetiza todas as enzimas necessárias para produzir uma gama de ácidos graxos ômega-6 e ômega-3. Isto, combinado com a anatomia simples e variedade de ferramentas genéticas disponíveis, torná-lo um modelo atraente para estudar a função de ácidos graxos. A fim de investigar as vias genéticas que medeiam os efeitos fisiológicos dos ácidos gordos alimentares, temos desenvolvido um método para complementar a C. elegans dieta com ácidos gordos insaturados. A suplementação é um meio eficaz para alterar a composição de ácidos gordos de vermes e também pode ser usado para recuperar defeitos de mutantes deficientes em ácidos gordos. O nosso método utiliza nematóide de meio de crescimento de ágar (NGM), suplementado com sais acidsodium gordo. Os ácidos graxos nas placas suplementadas se tornar incorporaçãoted nas membranas da fonte alimentar bacteriana, a qual é então feita pela C. elegans que se alimentam de bactérias suplementados. Os requerentes também descrevem um protocolo de cromatografia em fase gasosa para monitorar as alterações na composição de ácidos gordos que ocorrem em vermes suplementados. Esta é uma maneira eficiente para complementar as dietas de grandes e pequenas populações de C. elegans, permitindo uma gama de aplicações para este método.

A suplementação de C. elegans dieta é limitada pela capacidade da fonte de alimentação das bactérias a absorção e incorporação de ácidos gordos na membrana bacteriana. Para determinar a capacidade de E. coli OP50 assimilar vários ácidos gordos nas suas membranas, OP50 foram semeados em meios sem suplemento, 0,1 mM e 0,3 mM, concentrações de ácido esteárico (18:00), oleato de sódio (18:1 n-9), e DGLA de sódio (20 : 3n-6). As placas foram secas à temperatura ambiente durante 2 dias no escuro, e incubados...

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; é um modelo útil para explorar as funções de ácidos graxos poliinsaturados em desenvolvimento e fisiologia. Este protocolo descreve um método eficiente de complementar o &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; dieta com ácidos graxos poliinsaturados.

A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é usar meios dietéticos para alterar a composição de ácidos graxos da elegância do mar, a fim de estudar a função e regulação dos ácidos graxos. Isso é conseguido cultivando a fonte de alimento do nematóide na presença de ácidos graxos insaturados. Em seguida, a elegância do mar é alimentada com as bactérias suplementadas, permitindo a absorção do ácido graxo e sua incorporação no verme.Os lipídios então mudam na elegância do mar. A composição de ácidos graxos é confirmada por análise de espectrometria de massa por cromatografia gasosa. Finalmente, depois de se alimentarem de ácidos graxos insaturados, os vermes são pontuados quanto à esterilidade.São obtidos resultados que mostram os efeitos fisiológicos da composição alterada de ácidos graxos por meio do comportamento de desenvolvimento e mudanças na expressão gênica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de desenvolvimento e fisiologia da elegância do mar, porque podemos usar tanto a manipulação genética quanto as contribuições dietéticas para alterar a composição de ácidos graxos e monitorar as consequências. Geralmente, os indivíduos novos neste método devem ser cuidadosos e cautelosos, pois é difícil obter resultados consistentes devido à sensibilidade dos ácidos graxos insaturados ao oxigênio e às altas temperaturas.Para preparar um litro de meio suplementado com ácidos graxos, meça os seguintes componentes em um frasco. Adicione água milipore de até 800 mililitros e autoclave o meio junto com uma garrafa de vidro vazia para cada concentração de ácido graxo a ser testada, bem como cilindros graduados apropriados enquanto o meio esfria a 55 graus Celsius. Prepare a solução de estoque de trabalho do sal de sódio de ácido graxo quebrando cuidadosamente o frasco de vidro para não colocar partículas de vidro no pó e pesando o suficiente para fazer uma solução de estoque de 100 milimolares adicionar a quantidade necessária de água purificada.Em seguida, usando argônio ou gás nitrogênio, purgue a solução para evitar a oxidação de ácidos graxos. Em seguida, tampe o frasco e guarde-o no escuro enquanto o ácido graxo, o sal de sódio, está se dissolvendo. Quando o agri esfriar a 55 graus Celsius no seguinte, perto de uma chama, transferiu a solução para um cilindro graduado estéril.Antes de adicionar água estéril até um litro, transfira o meio de volta para o frasco e continue a misturar. Utilizar um cilindro graduado estéril para transferir uma alíquota do meio para um frasco autoclavado para cada concentração de ácidos gordos a ensaiar. Em seguida, mantenha as garrafas aquecidas em uma placa de mistura.Misture a concentração apropriada de solução estoque de ácidos graxos antes de usar uma pipeta estéril de 25 mililitros para despejar as placas depois que as placas tiverem solidificado a tampa e armazene-a em temperatura ambiente em uma área bem verificada no escuro. Dois dias depois, use e coli OP 50 para semear as placas e, em seguida, incube as placas em um ambiente escuro em temperatura ambiente enquanto o gramado bacteriano está secando. Prepare uma população sincronizada de larvas de L one tratando Ravi Hermafroditas com solução alcalina de hipoclorito.Agite suavemente os hermafroditas GR nesta solução até que os vermes adultos se dissolvam. Em seguida, centrifugue em baixa velocidade para pellet os ovos. Use tampão M nove para lavar os ovos três vezes.Em seguida, em um tubo de 15 mililitros, ressuspenda-os em cinco mililitros de tampão M nove e agite durante a noite. Adicione as larvas L one às placas semeadas OP 50 que foram suplementadas com ácido di homo gammalin 0,3 milimolar ou DGLA e incube-as a 20 graus Celsius por três dias ou até que as larvas atinjam o estágio adulto. Use um microscópio de dissecação para marcar a esterilidade de vermes adultos.A perda bem-sucedida de germes aparecerá como um útero claro e desprovido de ovos. Como alternativa, marque minhocas pegando-as em uma gota de M nove buffer em um vidro de relógio. Em seguida, use um mililitro de 0,2 nanogramas por mililitro de solução delicada para inundar o vidro do relógio e incubar por cerca de cinco minutos.Após a incubação, pegue os vermes em uma gota de meio de montagem em uma lâmina antes de cobrir com uma lamínula, sele a lamínula e armazene a quatro graus Celsius no escuro durante a noite ou veja imediatamente sob um microscópio fluorescente para produzir ésteres metílicos de ácidos graxos ou fames. Para quantificar a absorção de ácidos graxos, colete de 500 a 1000 vermes adultos usando água para lavá-los das placas e transferi-los para siliconizados. Tubos de rosca de vidro de 13 por 100 milímetros.Deixe os vermes assentarem por gravidade e, em seguida, use uma pipeta de vidro para remover o máximo de água possível. Adicione um mililitro de ácido sulfúrico a 2,5% em metanol e aqueça os tubos em banho-maria a 70 graus Celsius por uma hora após esfriar por um minuto sob o capô, extraia as molduras adicionando 1,5 mililitros de água e 0,25 mililitros de hexano. Volte a tapar os tubos e agite vigorosamente.Em seguida, centrifugue os tubos em uma centrífuga clínica de mesa por um minuto para separar o hexano do solvente aquoso. Transfira a camada superior de hexano para uma cromatografia gasosa ou inserção de frasco de GC dentro de um frasco de GC. Para analisar por gc, injete de um a dois microlitros de fames em uma coluna de cromatografia gasosa capilar polar adequada para análise de fame.Defina o injetor a 250 graus Celsius com uma vazão de 1.4 mililitros por minuto. Programe o forno para uma temperatura inicial de 130 graus Celsius mantida por um minuto. Em seguida, aumente a temperatura em 10 graus Celsius por minuto até atingir 190 graus Celsius e, em seguida, aumente novamente em cinco graus Celsius por minuto até 210 graus Celsius e, em seguida, segure por mais um minuto para garantir que a absorção de DGLA ocorreu.Analise quadros por detecção de ionização de chama ou espectrometria de massa ou detecção de MS usando padrões autênticos para a identificação da elegância do mar. A suplementação de ácidos graxos da dieta da elegância do mar é limitada pela capacidade da fonte de alimento bacteriano de absorver e incorporar ácidos graxos na membrana bacteriana para determinar a capacidade da e coli OP 50 de assimilar vários ácidos graxos em suas membranas. O OP 50 foi semeado em meio sem suplemento, concentrações de 0,1 milimolar e 0,3 milimolar de ácido estérico, ato de sódio e DGLA de sódio, como visto nesta figura A análise de fama por GCMS demonstra que os ácidos graxos insaturados, incluindo OLEATE e DGLA, incorporam-se ao OP 50 em níveis mais altos do que o ácido estérico de ácido graxo saturado.Além disso, a medição das quantidades de ácidos graxos em vermes em estágio adulto revela que a suplementação com ácidos graxos saturados não tem efeito sobre a quantidade relativa de ácidos graxos saturados nos tecidos dos vermes. No entanto, a suplementação com ácidos graxos insaturados aumentou as quantidades relativas dessas gorduras em conjunto. Esses dados indicam que o acúmulo relativo de ácidos graxos suplementados na elegância se correlaciona diretamente com o acúmulo relativo de ácidos graxos na dieta e coli.Como demonstramos anteriormente, este gráfico ilustra a resposta à dose da indução de esterilidade DGLA na elegância do mar. A concentração de DGLA em lipídios de vermes em que 50% da população será estéril é de aproximadamente 12% E, curiosamente, a resposta ao DGLA pode ser alterada por mutações genéticas nos vermes. Com base em uma descoberta recente de que as vias de estresse dependentes do fator de crescimento da insulina podem influenciar a destruição das células germinativas induzidas por DGLA.Suplementarmos a dieta de vermes contendo mutações deletérias no receptor de IGF de insulina DAF dois ou no fator de transcrição DAF 16 FOXO Com DGLA, uma pontuação de esterilidade em cada cepa mostrou que os mutantes DAF dois eram férteis com pouca ou nenhuma perda de células germinativas induzida em comparação com vermes do tipo selvagem em ambas as concentrações de DGLA. Em contraste, os vermes suplementados com DGLA com vox O inativo exibiram uma porcentagem maior de vermes estéreis em comparação com o tipo selvagem quando alimentados em placas contendo 0,15 milimolar do ácido graxo. Após este procedimento, os pesquisadores podem realizar vários ensaios com a elegância do mar suplementada, como estudos de expressão gênica, ensaios comportamentais ou análises de desenvolvimento ou reprodução.Esses ensaios revelarão papéis para ácidos graxos específicos nesses processos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar consistentemente meios suplementados com ácidos graxos que podem ser usados para alterar a composição de ácidos graxos da elegância do mar.

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