Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar culturas de células-tronco neurais de diferentes áreas do cérebro de roedores adultos. Isso é conseguido colhendo tecido de uma região de interesse para examinar a presença e o potencial de células-tronco neurais. Como segunda etapa, processe o tecido em uma suspensão celular para plaqueamento como uma cultura de monocamada.

Em seguida, use condições de cultura definidas para propagar seletivamente as células-tronco neurais, validando seu potencial de auto-renovação. Resultados in vitro são obtidos mostrando que as células-tronco neurais são multipotentes com base em seu potencial de diferenciação e como vários fatores podem influenciar sua auto-renovação e destino. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da neurociência e da medicina regenerativa, como onde residem as células-tronco neurológicas endógenas e como manipulá-las.

Pensamos nessa técnica pela primeira vez quando descobrimos vias de redução de sinais. Isso nos permitiu identificar células-tronco neurológicas endógenas putativas, bem como regular seu número. Então, aplicamos esse conhecimento para estabelecer culturas robustas dessas células de diferentes áreas do cérebro.

Estude suas propriedades e faça a pergunta: elas são realmente células-tronco? A preparação adequada da placa de cultura é fundamental dois dias antes da dissecção programada, cubra as placas com poli L ornitina a 75 microgramas por mililitro. Em seguida, incubar as placas durante a noite no dia seguinte, aspirar a poli L ornitina e lavar cada poço duas vezes com três mililitros de PBS por cinco minutos por lavagem.

As placas podem então ser armazenadas em uma incubadora por até três semanas Após remover a lavagem final, adicione nin de fibra diluído um a 250 em PBS por pipetagem suave. Tenha cuidado para não agitar demais a solução. Em seguida, incube as placas durante a noite no dia da dissecação.

Aspire a fibronectina e lave a louça duas vezes com PBS. Retorne as placas com a lavagem final do PBS para a incubadora e aguarde o tecido dissociado. As placas não utilizadas podem ser armazenadas na incubadora por até uma semana, mas não as deixe secar e não as agite.

A demonstração deste protocolo é dimensionada para três ratos adultos. Primeiro, certifique-se de resfriar o bloco de corte do cérebro no gelo antes de sacrificar o primeiro rato. Em seguida, prepare um tubo cônico de 15 mililitros no gelo com cinco mililitros de N, dois FGF médio e básico.

Depois de remover o cérebro de um rato sacrificado, coloque o cérebro em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo PBS gelado. Em seguida, transfira o cérebro para um segundo prato de PBS sem nenhum resíduo de cabelo ou sangue. Agora coloque o cérebro no bloco de corte resfriado e insira uma nova lâmina de barbear limpa no bloco próximo à região de interesse a partir da qual as células serão geradas.

Em seguida, insira uma segunda lâmina de barbear limpa. Três milímetros mimam a primeira lâmina de barbear. Levante cuidadosamente as lâminas do bloco levando consigo a seção de interesse.

Flutue a seção para fora da lâmina imergindo-a em PBS. Agora colha a área de interesse usando uma pinça número cinco. Neste exemplo, a seção contém a comissura anterior. Certo.

Colete a seção no tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de N dois meios com FGF básico. Em seguida, reduza o volume da solução para um a dois mililitros. Em seguida, em uma capa de cultura de células, mergulhe uma ponta de pipeta de um mililitro no fundo do cônico e use cerca de 20 fluxos de solução para dissociar mecanicamente o tecido.

Pare a tação quando a solução se tornar homogênea e deixe-a descansar por alguns minutos para que os tecidos maiores não associados se depositem no fundo. Agora transfira o sobrenadante homogêneo sem pedaços de tecido para um tubo cônico contendo 8,5 mililitros de suplementado e dois meios. Misture o conteúdo do tubo e prepare um seis preparado.

Placa de poço. Remova o PBS dos poços e, em seguida, adicione três mililitros de mistura de células por poço em três poços nos próximos 10 a 14 dias de cultivo. Substitua o meio por N dois suplementados frescos em dias alternados, começando 24 horas após o plaqueamento em dias alternados, adicione um novo volume de suplementos em N dois.

Meio para o meio já nas células. A diligência com as condições do meio é essencial para manter as células indiferenciadas e permitir sua expansão. Após a primeira mudança do meio, uma grande quantidade de detritos celulares permaneceu junto com os vasos sanguíneos.

No entanto, nos dias seguintes, colônias de células-tronco em proliferação distintas tornaram-se visíveis. Também estavam presentes populações de células semelhantes a fusos mais alongados. Estas não são células-tronco neurais e acabaram sendo ultrapassadas à medida que as células-tronco neurais proliferaram.

Ao longo das duas semanas seguintes, as células-tronco neurais cresceram mais densamente até atingirem a confluência. Essas culturas coraram positivo para vários marcadores de células-tronco, incluindo SOX dois, hesi e ninho. Assim, fornecendo confiança de que as populações de células que foram selecionadas e expandidas são de fato células-tronco neurais.

Outra confirmação veio após a retirada do FGF do meio, o que permitiu que as células se diferenciassem por 10 dias em neurônios, astrócitos e todos os citos de endra. Para induzir a diferenciação. Substitua o meio N dois suplementado por N dois suplementado e cultive as células desta forma por 10 dias, substituindo o N dois a cada 48 horas após 10 dias, aspire o meio e fixe as células com dois mililitros de 4% para formaldeído por poço por 20 minutos.

Lave o fixador com três mililitros de PBS duas vezes por cinco minutos por lavagem. Depois de aspirar a segunda lavagem, adicione dois mililitros de PBS contendo 5% de soro de burro normal e 0,1% de tritton X 100 para permear e bloquear as células enquanto as células incubam em temperatura ambiente por 20 minutos. Prepare a mistura de anticorpos primários em PBS contendo 5% NDS.

Neste exemplo, o anticorpo anti T UJ um é aplicado para identificar neurônios, enquanto os anticorpos GFAP e CPA são usados para visualizar astrócitos e oligodendrócitos, respectivamente. Após 20 minutos, aspire a solução de bloqueio e adicione 1,5 mililitros da mistura de anticorpos primários a cada um. Bem, incube as células.

Adicione a temperatura ambiente por 90 minutos após 90 minutos, lave as células com dois banhos de PBS, seguido de uma aplicação de PBS contendo 5% de NDS, use três mililitros de solução e banhos de cinco minutos. Após remover a lavagem final, aplique 1,5 mililitros de anticorpos secundários em PBS contendo 5% NDS em cada um. Bem, então coloque o prato no escuro, adicione a temperatura ambiente e espere 40 minutos.

Após 40 minutos, substitua o secundário por dois mililitros de uma mancha de DPI recém-preparada e aguarde três minutos. Após aspirar a solução de DPI, lave as células três vezes com três mililitros de PBS por cinco minutos por lavagem. As células estão então prontas para microscopia Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como western blots, podem ser realizados para observar as mudanças na expressão e fosforilação de proteínas resultantes de tratamentos farmacológicos ou ao longo da diferenciação celular. Após o desenvolvimento dessa técnica, ela abriu caminho para pesquisadores da área de neurociência testarem novos métodos que implementaram na pesquisa em várias espécies diferentes, incluindo camundongos, ratos e até primatas.