Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar os principais aspectos da imagem crônica de dois fótons em camundongos, explorando um ambiente de realidade virtual. Isso é conseguido modificando um microscópio de dois fótons para imagens rápidas e estáveis em camundongos que se comportam. Em seguida, uma esteira com suporte de ar capaz de rastrear a locomoção é montada.

Em seguida, é preparado um ambiente de realidade virtual que utiliza um projetor LED sincronizado com o microscópio para minimizar o vazamento de luz. Como resultado, gravações de imagem boas e estáveis são obtidas devido à redução de artefatos de movimento, à redução do vazamento de luz e à minimização da borda de danos fotográficos. Embora esse método possa ser usado para medir a neuroatividade durante a navegação em um ambiente de realidade virtual, ele também pode ser facilmente adaptado a uma ampla variedade de paradigmas comportamentais diferentes que requerem estimulação visual.

Todos os procedimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do departamento veterinário do Cantão de Basílio. O microscópio de dois fótons usado nesses experimentos consiste em uma cabeça de varredura composta por um scanner ressonante de oito ou 12 kilohertz e um galvanômetro padrão. Isso permite taxas de quadros de 40 ou 60 hertz a 750 vezes 400 pixels e reduz a distorção de imagem induzida pelo movimento cerebral, fotobranqueamento e fototoxicidade.

Um passo Z piezoelétrico de alta velocidade é usado para adquirir sequencialmente imagens intercaladas no tempo em várias profundidades. Um blanker mecânico é usado para reduzir a exposição do laser ao tecido nos pontos de retorno do caminho de varredura, o blanker deve ser ajustável para definir sua largura. Dependendo da amplitude do scanner ressonante, conecte um tubo de suprimento de ar com pelo menos 10 milímetros de diâmetro interno ao suporte de esferas da esteira e coloque uma quantidade de tubo BLE entre o suprimento de ar principal e o suporte de bola para reduzir o ruído.

Coloque uma bola de espuma de poliestireno, com 20 centímetros de diâmetro, em um suporte de bola personalizado e impresso em 3D. Se o paradigma comportamental requer apenas locomoção para frente e para trás, insira um alfinete como uma agulha hipodérmica de calibre 19 na lateral da bola. Para restringir o movimento da bola no eixo horizontal, use um ou dois mouses ópticos de computador para rastrear o movimento da bola em torno de dois ou todos os três eixos, respectivamente.

Para preparar o ambiente de realidade virtual, use projetores de LED ou telas de computador retroiluminadas por LED para a tela. Integre um circuito de passagem para cintilação rápida dos LEDs durante a geração de imagens. A frequência de cintilação de 24 kilohertz é ordens de magnitude acima do limiar de fusão de cintilação, acima do qual a cintilação não é mais percebida pelo animal.

Ajuste a frequência exata de cintilação e o ciclo de trabalho para sincronizar a saída de luz do projetor com os pontos de resposta do scanner ressonante para rastreamento da pupila, use uma câmera de vídeo baseada em CMOs. Certifique-se de que a câmera não contenha um filtro de bloqueio infravermelho. Aproximadamente duas a três semanas após a injeção do indicador genético de cálcio e o implante de uma janela craniana, use a iluminação de epifluorescência para verificar a clareza e a expressão do implante da janela craniana.

Claramente visível e bem definido. Os limites dos vasos sanguíneos superficiais são uma boa indicação de que o implante de janela é adequado para imagens um a dois dias depois. Para realizar o experimento de dois fótons, meça e ajuste a potência do laser para um valor abaixo de 50 miliwatts na amostra.

Em seguida, ligue o fluxo de ar para a esteira esférica. Em seguida, fixe o animal na esteira esférica. Nas primeiras vezes, o mouse é fixado na cabeça.

Este processo pode ser facilitado sedando brevemente o animal com flúor iso. Uma vez que o animal tenha se acostumado com o procedimento, a montagem normalmente pode ser realizada sem sedação. Observe que é fundamental minimizar o estresse do animal durante este procedimento.

Em seguida, posicione o sistema de exibição visual o mais próximo possível do animal para permitir o acesso ao animal. Certifique-se de que o implante da janela craniana esteja livre de sujeira e limpe-o com água, se necessário, aplique gel de ultrassom transparente como meio de imersão entre a janela craniana e a objetiva de imersão em água para proteção contra a luz. Enrole um pedaço de fita preta ao redor da objetiva e da barra de cabeça.

Mova a arena do ambiente virtual para sua posição final e ajuste a câmera de vídeo para rastreamento de alunos. Por fim, defina o blanker de laser para corresponder à amplitude de varredura usada durante o experimento e comece a registrar os dados quando os experimentos forem concluídos. Eutanasiar o animal de acordo com as diretrizes da sua instituição.

A qualidade da imagem em imagens de cálcio de dois fótons de populações de células marcadas com um indicador genético de cálcio depende em grande parte da qualidade do implante da janela craniana, conforme demonstrado aqui ao verificar a clareza da janela craniana após a injeção do vírus, não deve haver tecido de granulação ou crescimento ósseo visível. Além disso, o padrão dos vasos sanguíneos superficiais deve permanecer inalterado e os limites da vasculatura devem ser bem definidos. Ao mesmo tempo, o BOI das células marcadas deve ser claramente visível sob um microscópio de epifluorescência.

Idealmente, a preparação é estável o suficiente para que as distorções das duas imagens de fótons induzidas pela locomoção do mouse não sejam visíveis na imagem após o registro do quadro. O vazamento de luz do sistema de estimulação visual pode ser totalmente abolido cronometrando corretamente a saída de luz do projetor para os pontos de resposta do scanner de ressonância. Quando os dados não são adquiridos, a frequência de cintilação da fonte de luz deve ser o dobro da frequência de varredura.

Neste exemplo, o blanker foi removido para ilustrar o efeito do vazamento de luz mostrado nas caixas laranja durante a estimulação visual. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer o dobro em imagens, camundongos comportados, navegando em um ambiente de realidade virtual. Além de configurar os sistemas de imagem e realidade virtual conforme descrito aqui, a chave para o sucesso nesses experimentos é dominar a técnica de implante de janela craniana.

Um implante limpo é um pré-requisito para imagens de alta qualidade e gravações estáveis.