Name: Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a realizar imagem de dois fótons em camundongos navegando em realidade virtual. Este método permite registrar atividade neural estável durante tarefas comportamentais com estímulos visuais controlados.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Friedrich Miescher de Pesquisa Biomédica, a Sociedade Max Planck, e do Programa Científico Fronteiras Humanas.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as diretrizes do Departamento de Cantão Basel-Stadt Veterinária. 1. Hardware e Software Setup <ol><li> Dois fótons configuração microscópio de varredura: <ol><li> Use um laser infravermelho pulsado como fonte de iluminação (largura de pulso &lt;120 FSEC). </li><li> Use uma cabeça de leitura composto por um scanner de ressonância 8 ou 12 kHz e um padrão galvanometer Nota:. Isso permite taxas de quadro de 40 ou 60 Hz em 750 x 400 pixels. A alta taxa de quadros é fundamental para minimizar a distorção da imagem de movimento do cérebro induzido. Além disso, a rápida varredura de ressonância resulta em um rendimento de sinal maior e reduz fotodegradação 16 e fototoxicidade. </li><li> Use uma alta velocidade z-passo piezo-eléctrico para sequencialmente imagens intercaladas tempo, adquirir em várias profundidades Nota:. Isto é opcional e utilizado para aumentar a produção de dados, em detrimento da taxa de quadros. </li><li> Use amecânica redutor para reduzir a exposição ao laser para o tecido. Ajustar a largura do redutor de acordo com a amplitude do scanner de ressonância Nota:. Devido à natureza sinusoidal do percurso de varrimento de um scanner de ressonância, o feixe de laser se move lenta comparativamente aos pontos de resposta de verificação. Para evitar danos do tecido nesses pontos de rotação em que a exposição do laser é maior, um redutor mecânico é introduzido no plano focal entre a verificação e lentes de tubo que interrompe o feixe de laser. </li><li> Para aquisição de dados usar um digitalizador de alta velocidade (800 MHz) em combinação com um gate array programável em campo (FPGA) Nota:. Os filtros passa-alta FPGA e escaninhos do sinal PMT em pixels. A combinação do filtro passa-alto em FPGA e o filtro de passagem baixa efectiva no resultado amplificador PMT em um filtro passa-banda centrado aproximadamente em torno da frequência de repetição do laser (80 MHz). FPGA código de exemplo é fornecido como um complemento. </li></ol></li><li> Instalação de esteira pneumática com base no design de Dombeck e colegas 2 <ol><li> Ligue o suporte da esfera para uma linha de fornecimento de ar usando um tubo de, pelo menos, 10 mm de diâmetro interno de alimentação de ar. Maximizar a seção transversal do titular bola de entrada de alimentação de ar e coloque uma ampla quantidade de tubulação entre o principal suprimento de ar e suporte a bola Nota:. Seção transversal aumentada e aumento do comprimento do tubo de alimentação de ar reduz a geração de ruído. </li><li> Coloque uma bola de espuma de poliestireno (20 cm de diâmetro) em um suporte de bola e 3D-impressos personalizados. </li><li> Se o paradigma comportamental requer apenas para a frente (ou para trás) a locomoção, para restringir o movimento da bola para o (tom) de eixo horizontal através da inserção de um pino (por exemplo, uma agulha hipodérmica 19 G), no lado da bola Nota:. Animais tipicamente adaptar a a configuração muito mais rápido neste reduzido paradigma rotação. </li><li> Movimento faixa da bola usando um ou dois ratos de computador ópticopara detectar o movimento em torno de dois ou todos os três eixos, respectivamente Nota:. Os ratos de computador deve idealmente operar com um diodo infravermelho para menos interferência com a imagem latente. </li></ol></li><li> Configuração do ambiente de realidade virtual <ol><li> Prepare o ambiente de realidade virtual Nota:. Um exemplo de ambiente baseado em Panda3D, um motor de jogo disponível gratuitamente, é fornecido como um complemento. Os objetos do ambiente virtual são gerados usando Wings3D, um modelador 3D de código aberto. O programa de exemplo lê informações de posição em um cartão de aquisição de dados e traduz isso em movimento no ambiente virtual. O código também realiza a transformação não-linear necessário para o ambiente a ser projetada em uma tela toroidal. A construção detalhada do ecrã toroidal tenha sido descrita em outro lugar 14,17. </li><li> Utilize projetores LED ou telas de computador LED backlit para apresentar o ambiente virtual. Integrar um cir gatingcuit para rápido cintilação dos LEDs durante o exame Nota:. Um problema inerente em dois fótons de imagem durante a estimulação visual é vazamento de luz proveniente do sistema de estimulação visual, que pode ser reduzido, protegendo o objetivo. No entanto, a fuga de luz do sistema de estimulação visual pode ser totalmente abolida por sincronizar a saída de luz do projetor para os pontos de rotação do scanner de ressonância (quando os dados não são adquiridos), como é feito com arenas de LED usados ​​para estimulação visual durante o exame em 18 de Drosophila. Isso resulta em uma alternância de alta velocidade efectiva de estimulação visual e de aquisição de dados (ver Figura 2). A frequência de cintilação (24 kHz) é ordens de magnitude acima do limiar de fusão de cintilação, acima do qual a cintilação não é mais percebida pelo animal. O diagrama de circuito electrónico da presente modificação de um projector de LEDs comerciais é mostrado na Figura 3. </li></ol></li><li> Filhoteil rastreamento <ol><li> Use uma câmera de vídeo baseado CMOS (30 fps) para rastreamento de posição da pupila. Certifique-se de que a câmara não contém um filtro de bloqueio de infravermelho Nota:. A pupila é visível em alto contraste durante as gravações, devido à luz difusa do laser de excitação de dois fótons de sair através do olho. Posição da pupila eo diâmetro é extraído em tempo real usando o software programado personalizado baseado no projeto de Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. A injeção de Indicador de cálcio Genética e Janela Implant A injecção de um indicador de cálcio 20 e o implante da janela craniana 21 são executadas como previamente descrito com as seguintes adições: <ol><li> Injectar o vírus na região de interesse, utilizando uma pipeta de injecção de vidro preenchido com uma solução de vírus e ligado a um sistema de injecção sob pressão. Regule a pressão em função da pipeta interna-diâmetro, tipicamente ca. 70-140 mbar, para injectar cerca de 100 nl de uma solução de vírus ao longo de 1-2 min. Pulsos de injeção de baixo volume entregue em baixa frequência (0,05 pulsos seg a 2 Hz) deve ser usado para evitar transbordamento do vírus ao longo da pipeta durante a injeção Nota:. A fim de controlar o volume de injecção, a pipeta pode ser marcada pelo pequeno , comprimentos uniformemente espaçados (por exemplo, 0,5 mm) sob um microscópio estéreo. O deslocamento do menisco entre as marcações podem, então, ser utilizado para estimar o volume injectado. </li><li> Várias semanas após a injecção o que deverá resultar num bolo de células densamente marcados com um diâmetro de aproximadamente 500 um. A eficácia da expressão GECI na região de interesse depende da escolha de GECI e combinação promotor, bem como o título infeccioso e do serotipo do AAV recombinante usado Nota:. Como um exemplo representativo, a injecção de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 com uma teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml para o córtex visual primário de um rato provoca a expressão satisfatória em aproximadamente duas semanas após a injecção (Figura 1). </li><li> A barra de cabeça não deve obstruir o campo visual do mouse, mas deve ser rígida o suficiente para permitir a imagem estável durante comportamento. Isso normalmente requer dois pontos de fixação em ambos os lados da barra de cabeça (ver figura 1). Para prender firmemente a barra de cabeça para o crânio, certifique-se de maximizar e secar a área do crânio exposta, onde o bar cabeça será anexado. Além disso, utilizando um bisturi ou uma seringa, riscar o crânio para criar ranhuras superficiais, aumentando assim a área da superfície de colagem. Cubra o osso com adesivo tecidual antes de colocar a barra de cabeça com cimento dental. </li></ol> 3. Procedimento Experimental <ol><li> Duas a três semanas após a injeção do vírus, verifique a janela implante craniano para maior clareza e expressão sob epiiluminação de fluorescência. Limites claramente visíveis e bem definidas de vasos sanguíneos superficiais são uma boa indicação de que o implante janela é adequado para a imagem (veja a Figura 1). </li><li> Medir e ajustar a potência do laser para um valor inferior a 50 MW na amostra. </li><li> Ligue o fluxo de ar para a esteira esférica. </li><li> Para a fixação da cabeça sob o microscópio, anestesiar brevemente o animal com isoflurano para reduzir o stress. Colocar o animal em um recipiente anestesia isoflurano e esperar até parar de animais em movimento (aproximadamente 10 segundos). Retire o animal e imediatamente cabeça corrigi-lo sob o microscópio. </li><li> Posicionar o sistema de exibição visual tão próximo quanto possível para que o animal ainda permitir o acesso ao animal. O contacto inferior visuais o animal tem com o experimentador, a menos salientou o animal será durante a fase inicial da experiência. </li><li> Certifique-se a janela de implante craniano é livre de poeira e sujeira. Limpe com águase necessário. </li><li> Aplique o gel de ultra-som claro como o meio de imersão entre a janela craniana e objetiva de imersão em água. Isto resolve problemas de degradação da imagem lenta, devido à evaporação de água ou vazamento e alivia a necessidade de montar um cone na barra de cabeça para reter a água Nota:. Centrífuga o gel antes do uso para remover todas as bolhas de ar, e tomar cuidado para não criar qualquer ar bolhas durante a aplicação do gel. As bolhas de ar podem prejudicar seriamente a qualidade de imagem. </li><li> Enrole um pedaço de fita preta em torno do bar objetiva e cabeça para proteção contra luz. </li><li> Mova a arena ambiente virtual para a sua posição final e ajustar a câmera de vídeo para monitoramento dos alunos. </li><li> Definir o redutor de laser para coincidir com a amplitude de varredura utilizado durante o experimento. </li><li> Iniciar a gravação de dados. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
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<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A chave para o sucesso do comportamento de imagem de dois fotões é a estabilidade da preparação de duas maneiras: <ol><li> No decurso da implantação janela dias pós, as respostas inflamatórias do tecido pode conduzir a uma melhoria da formação de tecido de granulação e cartilagem que vai dificultar, ou mesmo impedir imagiologia. </li><li> Durante o experimento, o cérebro tem que ser suficientemente estável para evitar artefatos de movimento a partir de corromper sinal de fluorescência atividade relacionada neural. <...

Dois fótons de imagem de cálcio (indicadores geneticamente codificados como GCaMP5 7 ou R-GECO 8 ou corantes sintéticos como OGB ou Fluo4) emergiu como um poderoso método de medir a atividade neuronal em ratos comportando 1-6. Ele permite a medição simultânea da actividade de centenas de células de acção quase único potencial resolução, até cerca de 800 um abaixo da superfície do cérebro 9,10. Além disso, por meio de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) atividade neuronal pode ser medido cronicamente 5,11,12, e em tipos de células geneticamente definidas 13. Juntos, estes métodos proporcionam um grau de resolução temporal e espacial, que abre um grande número de novas possibilidades para o estudo de computação neuronal in vivo. A intervenção cirúrgica é necessária para expor e rotular o cérebro do rato para a imagem latente. As células são tipicamente transfectados utilizando um recombinante vir adeno-associado<html> nos sistema (AAV) para entrega GECI e uma janela craniana é implantado no local da injecção para ter acesso óptico ao cérebro. Uma barra de cabeça é então ligado ao crânio para fixação da cabeça sob o microscópio de dois fotões. A concepção e implementação dessas medidas é fundamental, como a maioria dos problemas com a imagem acordado surgem de instabilidades na preparação. Idealmente o procedimento descrito aqui deve permitir a imagem crônica de até vários meses após a cirurgia. Para ativar o comportamento visualmente guiado durante dois fótons de imagem, o rato fixo cabeça fica em um ar apoiado esteira esférica, que ele pode usar para navegar em um ambiente de realidade virtual. Locomotion do mouse sobre a esteira é acoplado ao movimento no ambiente virtual que é exibido em uma tela toroidal em torno do 14,15 mouse. Variáveis ​​comportamentais, tais como locomoção, estímulo visual, e posição da pupila podem ser gravadas 6. t &quot;&gt; Nós descrevemos os procedimentos envolvidos em dois fótons de imagem crônica em camundongos explorando um ambiente de realidade virtual Os principais pontos abordados são:. redução de artefatos de movimento, a redução do vazamento de luz, a maximização do número de células gravadas simultaneamente, e minimização de danos foto. Nós também fornecemos detalhes sobre como configurar a esteira apoiada pelo ar, controle de aluno eo ambiente de realidade virtual. Os procedimentos descritos aqui pode ser usado para geração de imagens de populações de células marcadas com fluorescência em camundongos fixos na cabeça em um potencialmente grande variedade de paradigmas comportamentais .

<table><tbody><tr><td>Lamínulas (diâmetro = 3-5 mm)</td><td>Implante de janela</td> <td>Menzel</td><td></td></tr><tr><td>Laser InSight DeepSee</td><td>Microscópio Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 kHz Scanner de ressonância</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Digitador</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Cartão de aquisição</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Filtro de emissão 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Piezo-elétrico z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Controlador para Piezoelétrico drive</td><td>Microscópio Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva 16X, 0.8NA</td><td>Microscópio Nikon</td><td>CFI75</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de corrente</td><td>Microscópio Femto</td><td>DHPCA-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador Microscópio</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera USB sem filtro IR</td><td>ImagingSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>rastreamento</td></tr> <tr><td>de pupilaObjetiva 50 mm</td><td>Rastreamento de pupila</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td></tr><tr><td>Anéis adaptadores macro</td> Rastreamento de <td>pupila</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td></tr><tr><td>Mouse óptico de computador</td><td>Rastreamento de movimento</td><td>Logitech</td><td>G500</td></tr><tr><td>Bola de isopor 20 cm</td><td>, por exemplo, idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>ambiente virtual</td></tr><tr><td>Projetor LED</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtual ambiente</td></tr><tr><td>Cartão de aquisição</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>ambiente virtual</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>ambiente virtual</td></tr><tr><td>Biblioteca Numpy para Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>ambiente virtual</td></tr><tr><td>Scipy biblioteca para Python</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>ambiente virtual</td></tr><tr><td>driver NI-DAQmx</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>ambiente virtual</td></tr><tr><td>Gel de ultrassom</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td></td></tr></tbody></table>

dois fótons de imagem de cálcio em camundongos navegando um ambiente da realidade virtual

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Nos últimos anos, dois fótons de imagem tornou-se uma ferramenta valiosa na neurociência, uma vez que permite a medição crônica da atividade de células geneticamente identificados durante comportamento 1-6. Aqui nós descrevemos métodos para realizar imagem de dois fótons em rato córtex enquanto o animal navega um ambiente de realidade virtual. Nós nos concentramos nos aspectos dos procedimentos experimentais, que são fundamentais para a imagem em um animal se comportar em um ambiente virtual iluminado. Os principais problemas que surgem nesta configuração experimental que nós aqui endereço são: minimizar artefatos de movimento do cérebro relacionada, minimizando luz vazamento do sistema de projeção de realidade virtual, e minimizando o dano tecidual induzida por laser. Nós também fornecemos software de amostra para controlar o ambiente de realidade virtual e fazer o acompanhamento dos alunos. Com estes processos e os recursos que deveria ser possível converter um microscópio de dois fotões convencional para uso em comportando ratinhos.

A qualidade da imagem em dois fotões imagiologia de cálcio de populações de células marcadas com um GECI depende em grande parte a qualidade da janela craniana do implante. Duas semanas após a injeção do vírus da janela craniana devem ser inspecionados para maior clareza. Não deve haver nenhum tecido de granulação ou crescimento do osso visível (Figura 1A). Além disso, o padrão de vasos sanguíneos superficiais deverão permanecer inalterados e limites da vasculatura deve ser bem definida. Ao mesmo tempo,...

Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual.

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar os principais aspectos da imagem crônica de dois fótons em camundongos, explorando um ambiente de realidade virtual. Isso é conseguido modificando um microscópio de dois fótons para imagens rápidas e estáveis em camundongos que se comportam. Em seguida, uma esteira com suporte de ar capaz de rastrear a locomoção é montada.Em seguida, é preparado um ambiente de realidade virtual que utiliza um projetor LED sincronizado com o microscópio para minimizar o vazamento de luz. Como resultado, gravações de imagem boas e estáveis são obtidas devido à redução de artefatos de movimento, à redução do vazamento de luz e à minimização da borda de danos fotográficos. Embora esse método possa ser usado para medir a neuroatividade durante a navegação em um ambiente de realidade virtual, ele também pode ser facilmente adaptado a uma ampla variedade de paradigmas comportamentais diferentes que requerem estimulação visual.Todos os procedimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do departamento veterinário do Cantão de Basílio. O microscópio de dois fótons usado nesses experimentos consiste em uma cabeça de varredura composta por um scanner ressonante de oito ou 12 kilohertz e um galvanômetro padrão. Isso permite taxas de quadros de 40 ou 60 hertz a 750 vezes 400 pixels e reduz a distorção de imagem induzida pelo movimento cerebral, fotobranqueamento e fototoxicidade.Um passo Z piezoelétrico de alta velocidade é usado para adquirir sequencialmente imagens intercaladas no tempo em várias profundidades. Um blanker mecânico é usado para reduzir a exposição do laser ao tecido nos pontos de retorno do caminho de varredura, o blanker deve ser ajustável para definir sua largura. Dependendo da amplitude do scanner ressonante, conecte um tubo de suprimento de ar com pelo menos 10 milímetros de diâmetro interno ao suporte de esferas da esteira e coloque uma quantidade de tubo BLE entre o suprimento de ar principal e o suporte de bola para reduzir o ruído.Coloque uma bola de espuma de poliestireno, com 20 centímetros de diâmetro, em um suporte de bola personalizado e impresso em 3D. Se o paradigma comportamental requer apenas locomoção para frente e para trás, insira um alfinete como uma agulha hipodérmica de calibre 19 na lateral da bola. Para restringir o movimento da bola no eixo horizontal, use um ou dois mouses ópticos de computador para rastrear o movimento da bola em torno de dois ou todos os três eixos, respectivamente.Para preparar o ambiente de realidade virtual, use projetores de LED ou telas de computador retroiluminadas por LED para a tela. Integre um circuito de passagem para cintilação rápida dos LEDs durante a geração de imagens. A frequência de cintilação de 24 kilohertz é ordens de magnitude acima do limiar de fusão de cintilação, acima do qual a cintilação não é mais percebida pelo animal.Ajuste a frequência exata de cintilação e o ciclo de trabalho para sincronizar a saída de luz do projetor com os pontos de resposta do scanner ressonante para rastreamento da pupila, use uma câmera de vídeo baseada em CMOs. Certifique-se de que a câmera não contenha um filtro de bloqueio infravermelho. Aproximadamente duas a três semanas após a injeção do indicador genético de cálcio e o implante de uma janela craniana, use a iluminação de epifluorescência para verificar a clareza e a expressão do implante da janela craniana.Claramente visível e bem definido. Os limites dos vasos sanguíneos superficiais são uma boa indicação de que o implante de janela é adequado para imagens um a dois dias depois. Para realizar o experimento de dois fótons, meça e ajuste a potência do laser para um valor abaixo de 50 miliwatts na amostra.Em seguida, ligue o fluxo de ar para a esteira esférica. Em seguida, fixe o animal na esteira esférica. Nas primeiras vezes, o mouse é fixado na cabeça.Este processo pode ser facilitado sedando brevemente o animal com flúor iso. Uma vez que o animal tenha se acostumado com o procedimento, a montagem normalmente pode ser realizada sem sedação. Observe que é fundamental minimizar o estresse do animal durante este procedimento.Em seguida, posicione o sistema de exibição visual o mais próximo possível do animal para permitir o acesso ao animal. Certifique-se de que o implante da janela craniana esteja livre de sujeira e limpe-o com água, se necessário, aplique gel de ultrassom transparente como meio de imersão entre a janela craniana e a objetiva de imersão em água para proteção contra a luz. Enrole um pedaço de fita preta ao redor da objetiva e da barra de cabeça.Mova a arena do ambiente virtual para sua posição final e ajuste a câmera de vídeo para rastreamento de alunos. Por fim, defina o blanker de laser para corresponder à amplitude de varredura usada durante o experimento e comece a registrar os dados quando os experimentos forem concluídos. Eutanasiar o animal de acordo com as diretrizes da sua instituição.A qualidade da imagem em imagens de cálcio de dois fótons de populações de células marcadas com um indicador genético de cálcio depende em grande parte da qualidade do implante da janela craniana, conforme demonstrado aqui ao verificar a clareza da janela craniana após a injeção do vírus, não deve haver tecido de granulação ou crescimento ósseo visível. Além disso, o padrão dos vasos sanguíneos superficiais deve permanecer inalterado e os limites da vasculatura devem ser bem definidos. Ao mesmo tempo, o BOI das células marcadas deve ser claramente visível sob um microscópio de epifluorescência.Idealmente, a preparação é estável o suficiente para que as distorções das duas imagens de fótons induzidas pela locomoção do mouse não sejam visíveis na imagem após o registro do quadro. O vazamento de luz do sistema de estimulação visual pode ser totalmente abolido cronometrando corretamente a saída de luz do projetor para os pontos de resposta do scanner de ressonância. Quando os dados não são adquiridos, a frequência de cintilação da fonte de luz deve ser o dobro da frequência de varredura.Neste exemplo, o blanker foi removido para ilustrar o efeito do vazamento de luz mostrado nas caixas laranja durante a estimulação visual. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer o dobro em imagens, camundongos comportados, navegando em um ambiente de realidade virtual. Além de configurar os sistemas de imagem e realidade virtual conforme descrito aqui, a chave para o sucesso nesses experimentos é dominar a técnica de implante de janela craniana.Um implante limpo é um pré-requisito para imagens de alta qualidade e gravações estáveis.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Fonte: Lee, H. et. al., Imagem de cálcio in vivo bem-sucedida com um microscópio miniaturizado montado na cabeça na amígdala de um camundongo que se comporta livremente. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de cálcio in vivo em um camundongo usando um índice de refração gradiente, ou lente GRIN, e um microscópio miniaturizado. A configuração combina a fixação da cabeça dentro de um sistema de gaiola móvel sem atrito, estimulando os neurônios e desencadeando o influxo de íons de...

Imagem microendoscópica de cálcio em tempo real em um camundongo que se move livremente

Fonte: Thapa, R., et. al., Injeção Viral Estereotáxica e Implante de Lente de Índice de Gradiente para Imagem de Cálcio Cerebral Profundo In Vivo.  J. Vis. Exp. (2021)O vídeo demonstra imagens de cálcio em tempo real usando um miniscópio em um camundongo transduzido, correlacionando a atividade neuronal com o comportamento.

Imagem de cálcio em tempo real de um córtex pré-frontal medial de camundongo usando um miniscópio

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Miniscópio em imagem de cálcio vivo é uma técnica poderosa para estudar dinâmica neuronal e microcircuitos em camundongos que se comportam livremente. Este protocolo descreve a realização de cirurgias cerebrais para obter uma boa imagem in vivo de cálcio usando um miniscópio.

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Aqui, apresentamos uma configuração simplificada de hardware e software de código aberto para investigar o aprendizado espacial de mouse usando realidade virtual (RV). Este sistema exibe uma trilha linear virtual para um mouse com restrição de cabeça rodando em uma roda utilizando uma rede de microcontroladores e um computador de placa única executando um pacote de software gráfico Python fácil de usar.

Um Sistema de Realidade Virtual de Código Aberto para a Medição da Aprendizagem Espacial em Camundongos Contidos na Cabeça

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Aprenda a realizar imagem de dois fótons em camundongos navegando em realidade virtual. Este método permite registrar atividade neural estável durante tarefas comportamentais com estímulos visuais controlados.

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

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