Name: Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a fabricar ligas de proteínas de seda para aplicações biomédicas usando soluções regeneradas de casulos de bicho-da-seda. Este método demonstra a integração de circuitos eletrônicos em filmes compostos de proteínas.

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Os autores agradecem a Universidade Rowan para apoio a esta pesquisa. XH também graças Dr. David L. Kaplan, da Universidade Tufts e do NIH P41 Tissue Resource Center Engenharia (TERC) para treinamentos técnicos anteriores.

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<li>Teng, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+silk-elastin+like+protein+polymer+displays+elasticity+comparable+to+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin.</a> Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).</li>
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<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge-Tunable+Autoclaved+Silk-Tropoelastin+Protein+Alloys+That+Control+Neuron+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses.</a> Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+derived+from+silk-tropoelastin+protein+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems.</a> Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+elasticity+and+surface+roughness+on+myogenic+and+osteogenic-differentiation+of+cells+on+silk-elastin+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials.</a> Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+from+ultrasonication-induced+silk+fibroin-hyaluronic+acid+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels.</a> Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).</li>
<li>Gil, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+behavior+and+morphological+evolution+of+mixed+gelatin%2Fsilk+fibroin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+process+to+prepare+silk+fibroin%2Fgelatin+biomaterial+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds.</a> Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).</li>
<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+and+flexible+silk+films+containing+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Insoluble and flexible silk films containing glycerol.</a> Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).</li>
<li>Mandal, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+fibroin%2Fpolyacrylamide+semi-interpenetrating+network+hydrogels+for+controlled+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release.</a> Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).</li>
<li>Yeo, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+biomimetic+nanofibrous+scaffolds%2C+preparation+and+characterization+of+collagen%2Fsilk+fibroin+bicomponent+nanofibrous+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures.</a> Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+elasticity+provides+mechanical+signals+for+the+expansion+of+hemopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).</li>
<li>Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Opportunities+for+an+Ancient+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New Opportunities for an Ancient Material.</a> Science. 329, 528-531 (2010).</li>
<li>Qin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+resilin+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of resilin elasticity.</a> Nature Communications. 3, 1003(2012).</li>
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<li>Wise, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+tropoelastin+and+elastin-based+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials.</a> Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).</li>
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<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolvable+films+of+silk+fibroin+for+ultrathin+conformal+bio-integrated+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics.</a> Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+vaccines+and+antibiotics+in+silk+and+eliminating+the+cold+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).</li>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Um dos processos mais críticos na produção de proteínas do sistema &quot;liga&quot; é para verificar a miscibilidade das proteínas combinadas. Caso contrário, é apenas uma mistura de proteína ou proteína sistema composto imiscíveis sem propriedades estáveis ​​e ajustáveis. Um método de análise térmica experimental pode ser utilizado para este fim e para confirmar as suas propriedades da liga. Interacções proteína-proteína pode ser visualizada de acordo com o modelo de Flory-Huggins estrutura 48 como as intera...

Natureza criou estratégias para gerar matrizes biológicas sintonizáveis ​​e multifuncionais, utilizando um número limitado de proteínas estruturais. Por exemplo, a elastina e colagénio são sempre utilizados em conjunto in vivo para proporcionar as forças ajustáveis ​​e funções necessárias para tecidos específicos 1,2. A chave para esta estratégia é a mistura. Blending envolve a mistura de proteínas com proporções específicas e é uma abordagem tecnológica para gerar sistemas de materiais simples com sintonizável e propriedades variadas 3-5. Comparada com as estratégias de engenharia sintéticos 6,7, a mistura também pode melhorar a uniformidade de material e a capacidade de processamento do material, devido à facilidade de operação 8-16. Portanto, a concepção multifuncionais, biocompatíveis e ligas de proteína é uma área emergente de pesquisa médica. Esta tecnologia também proporcionará um conhecimento sistemático do impacto das matrizes proteicas naturais em funções das células e dos tecidos, tanto em vitro e in vivo 10,17. Ao optimizar as interfaces entre as proteínas moleculares diferentes, os materiais de liga à base de proteínas podem abranger uma gama de funções físicas, tais como a estabilidade térmica a temperaturas diferentes, a elasticidade para suportar diversos tecidos, sensibilidade eléctrica variável de órgãos, e propriedades ópticas para a regeneração do tecido da córnea 3, 18-27. O resultado desses estudos irá fornecer uma nova plataforma de proteína-materiais no campo da ciência biomédica com relevância direta para reparação de tecidos ajustáveis ​​e tratamentos de doenças e ainda levar a dispositivos de implantes biodegradáveis, onde suas características diagnósticas e terapêuticas inovadoras podem ser vislumbradas 3. Muitas proteínas estruturais naturais têm propriedades físicas e bioativos essenciais que podem ser exploradas como candidatos para as matrizes de biomateriais. Silks de diferentes espécies de vermes, queratinas dos cabelos e lãs, elastins e colágenos de tecidos diferentes, evárias proteínas de plantas são algumas das proteínas estruturais mais comuns utilizados para a concepção de materiais à base de proteínas variáveis ​​(Figura 1), 18-27. Em geral, estas proteínas podem formar diferentes estruturas moleculares secundários (por exemplo, folhas beta para sedas, ou bobinas enroladas para queratinas), devido às suas sequências únicas repetitivas amino primário de ácido 3,28-35. Estas características promovem a formação de estruturas macroscópicas auto-organizadas com funções originais em interfaces biológicas solicitando a sua utilidade como um recurso precioso de materiais biopolímeros. Aqui, foram utilizados dois tipos de proteínas estruturais (a partir de uma proteína de seda tussah selvagem e B a partir de proteína de seda amoreira domesticados como exemplo) para demonstrar os protocolos gerais de produção de vários biomateriais liga proteína. Os protocolos demonstradas incluem parte 1: previsões de interação proteína e simulações, Parte 2: produção de soluções de liga leve de proteínas e parte 3: fabricação de liga de proteínasistemas e para aplicações ópticas, elétricas e farmacêuticos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50891/50891fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: Matérias-primas de diversas proteínas estruturais que são comumente usados ​​em nosso laboratório para a concepção de materiais à base de proteínas, incluindo sedas de diferentes espécies de vermes, queratinas dos cabelos e lãs, elastins de tecidos diferentes, e várias proteínas vegetais.

<table><tbody><tr><td>Calorímetros Exploratórios Diferenciais (DSC) Q100</td> <td>Instrumentos TA, New Castle, DE, EUA </td><td>N/A</td><td>Você pode usar qualquer tipo de DSC com um software para calcular a capacidade térmica.</td></tr><tr><td>Sistema de pulverização catódica a vácuo SS30T&nbsp;</td><td>T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, EUA</td><td>N/A</td><td>Com peças personalizadas; você pode usar qualquer tipo de sistema de pulverização catódica para revestir.</td></tr><tr><td>VWR 1415M Forno a vácuo</td><td>VWR International, Bridgeport, NJ, EUA</td><td>N/A</td><td>Pode utilizar qualquer tipo de forno a vácuo para reticular fisicamente as amostras.</td></tr></tbody></table>

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Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

As proteínas fibrosas exibir diferentes seqüências e estruturas que têm sido utilizados para diversas aplicações em áreas biomédicas, tais como biossensores, nanomedicina, regeneração de tecidos e entrega da droga. Concepção de materiais com base nas interações em escala molecular entre estas proteínas irá ajudar a gerar novos biomateriais liga proteína multifuncional com propriedades ajustáveis. Tais sistemas de materiais de liga também proporcionar vantagens em relação aos polímeros sintéticos tradicionais devido à biodegradabilidade materiais, biocompatibilidade, e Viabilidade no corpo. Este artigo usou as misturas de proteína de seda selvagem tussah (Antheraea pernyi) e doméstico amoreira seda (Bombyx mori) como um exemplo para fornecer protocolos úteis em relação a esses temas, incluindo como prever as interações proteína-proteína por métodos computacionais, como para a produção de ligas de proteína soluções, como verificar sistemas de ligas por análise térmica, e como fabricar ligas variáveisincluindo materiais ópticos com redes de difração, materiais elétricos com revestimentos circuitos e materiais farmacêuticos para liberação da droga e entrega. Estes métodos podem fornecer informações importantes para a concepção de a próxima geração de biomateriais multifuncionais baseados em ligas diferentes de proteínas.

Interacções proteína-proteína típica (por exemplo, entre a proteína A e proteína B) podia conter carga (charge-electrostáticas) atracções, a formação de ligações de hidrogénio, interacções hidrofóbicas-hidrofílicas, bem como dipolo, solvente, contra-ião, e efeitos entrópicos entre o específico os domínios de duas proteínas (Figura 2) 3. Portanto, fundamentalmente, podemos prever os efeitos dessas interações por meio de simulações computacionais. <p class="jove_content" fo:keep-to...

A mistura é uma abordagem eficiente para gerar biomateriais com uma ampla gama de propriedades e as características combinadas. Ao prever as interações moleculares entre diferentes proteínas da seda natural novas silk-seda plataformas liga proteína com resiliência ajustável mecânica, resposta elétrica, transparência óptica, processamento químico, biodegradabilidade ou estabilidade térmica pode ser projetado.

Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como fabricar diversos materiais de ligas proteicas utilizando filmes compostos de seda com circuitos eletrônicos. Como exemplo, isso é realizado primeiramente regenerando soluções proteicas individuais a partir de casulos de duas espécies diferentes de bichos-da-seda.O segundo passo é misturar duas soluções proteicas com diferentes proporções e gerar uma série de soluções de mistura. Em seguida, utiliza-se uma técnica de fabricação de filmes finos para fabricar circuitos eletrônicos sobre substratos de vidro. O passo final é revestir as soluções de mistura sobre os substratos de vidro e transferir os circuitos eletrônicos para a proteína seca.Os filmes compostos em comparação com os materiais poliméricos sintéticos tradicionais. Os materiais proteicos podem oferecer maior biocompatibilidade, biodegradabilidade e maleabilidade no corpo humano. A mistura de proteínas em diferentes proporções é uma abordagem tecnológica simples para gerar materiais ligados com propriedades físicas, químicas ou biológicas ajustáveis.Ampliar esta técnica para sistemas biomédicos implantáveis pode proporcionar monitoramento eletrônico, aprimorando o diagnóstico e a terapia em tratamentos médicos. Além disso, a técnica pode ser usada para desenvolver dispositivos que podem ser absorvidos pelo corpo após não serem mais necessários. Neste vídeo, utilizaremos as misturas proteicas da seda selvagem TOSA, bem como da seda doméstica de amoreira, como exemplo para fornecer protocolos úteis sobre este tema, incluindo como produzir soluções de ligas proteicas e fabricar materiais de liga utilizando circuitos eletrônicos.A principal vantagem da nossa técnica de revestimento de circuitos em comparação com outros métodos, como evaporação, é que os materiais proteicos não são submetidos diretamente a altas temperaturas nem à radiação durante o nosso processo de revestimento. Para iniciar este procedimento, corte casulos de seda tssa selvagem cru num peso de três gramas. Encha um béquer de vidro de dois litros com água destilada e, em seguida, coloque o béquer sobre uma placa aquecedora.Cubra com papel alumínio e aqueça até a fervura. Remova a tampa de papel alumínio e adicione lentamente três gramas de bicarbonato de sódio na água fervente, permitindo que se dissolva completamente. Uma vez que o bicarbonato de sódio tenha se dissolvido completamente, adicione os casulos de seda selvagem na água fervente e deixe a mistura ferver por duas a três horas.Após a fervura, remova cuidadosamente as fibras proteicas da solução com uma espátula e comprima-as para eliminar o excesso de água. Em seguida, mergulhe as fibras em um béquer de dois litros contendo água destilada fria e lave-as duas vezes, por 30 minutos cada, para remover completamente os resíduos impuros da superfície das fibras. Após a lavagem, seque as fibras em uma cabine de exaustão por pelo menos 12 horas.Derreta 48,784 gramas de nitrato de cálcio em um recipiente de vidro para formar um líquido a 65 graus Celsius, destinado à dissolução das fibras proteicas da seda selvagem. Em seguida, combine as fibras e o solvente na proporção de um grama de fibra para 10 mililitros de solvente. Após permitir que as fibras se dissolvam a 95 graus Celsius por cinco a 12 horas, despeje a solução de seda selvagem em um tubo de diálise de 12 mililitros e realize a diálise contra dois litros de água destilada.Altere a água destilada com frequência para remover os solventes de nitrato de cálcio da solução. Após três dias, colete as soluções proteicas das caixas de diálise e coloque-as em tubos classificados para 13.000 RPM. Em seguida, centrifugue as soluções por uma hora a 3.500 RPM a quatro graus Celsius.Três vezes para remover os depósitos ao finalizar. Armazene as soluções finais em uma geladeira a quatro graus Celsius após coletar outra proteína natural, como a seda de amoreira domesticada. Repita o processo descrito com um sabão apropriado e solvente de dissolução até obter a solução aquosa final de proteína com concentração medida.Em seguida, misture lentamente uma solução de seda selvagem a um por cento em peso com uma solução de seda domesticada a um por cento em peso usando um pipetador. Mantenha a solução final a quatro graus Celsius. Para evitar agregação proteica, para fabricar um padrão de circuito elétrico sobre um substrato de vidro, primeiramente limpe uma lâmina de vidro utilizando um solvente desengordurante, como hinox, e um limpador ultrassônico por cinco minutos. Em seguida, limpe a lâmina de vidro por cinco minutos em acetona e cinco minutos em metanol.Sopre o lâmina de vidro seco usando gás nitrogênio seco, gerado pela evaporação de um tanque de 180 litros de nitrogênio líquido. Neste momento, introduza os materiais do substrato na câmara de deposição e evacue a câmara de carga até uma pressão de 30 militar. Em seguida, abra a válvula de comporta entre a câmara de carga e a câmara principal de deposição e introduza o substrato na câmara.Ligue o gás argônio e o regulador de pressão e controle a pressão até a pressão de deposição desejada, a fim de remover camadas de óxido e contaminantes do alvo por pré-sputtering durante vários minutos. Após abrir o obturador, realize o sputtering do metal sobre o substrato utilizando uma taxa de deposição adequada para atingir a espessura desejada. Quando o processo de sputtering for concluído, remova a lâmina de vidro revestida da câmara.Usando uma centrífuga, aplique por centrifugação uma fotoresistência positiva sobre a superfície do filme. Após a aplicação da resistência no filme, realize uma pré-secagem a 90 graus Celsius por cinco minutos para secar a resistência. Ao finalizar, posicione firmemente contra a resistência uma máscara de contato com a imagem do dispositivo.Exponha a resina fotossensível a uma fonte de luz UV de 1000 watts por 10 segundos. Em seguida, coloque o filme no revelador da resina fotossensível até que a imagem projetada apareça. Imediatamente após a aparência da imagem, mergulhe o filme em água desionizada para interromper a ação do revelador sobre a resina fotossensível não exposta.Em seguida, seque o filme com gás nitrogênio seco. Coloque o filme em uma estufa a 120 graus Celsius por 15 minutos para endurecer o fotoresiste. Após o resfriamento do filme, coloque-o em uma solução de ataque até que o metal não protegido pelo fotoresiste se desprenda.Mergulhe o filme na água para interromper a gravação. Em seguida, lave o filme com acetona para remover a foto endurecida. Remova a resistência, depois lave o filme com metanol e seque com nitrogênio seco.Uma vez que o vidro revestido esteja pronto, coloque diferentes soluções de liga proteica sobre a superfície do vidro. Utilizando uma pipeta, seque-o por pelo menos 12 horas na câmara de exaustão para obter filmes de liga proteica no vidro. Em seguida, retire os filmes de liga proteica com os padrões metálicos finos do substrato de vidro utilizando pinças. Para obter materiais de liga proteica insolúveis, coloque o filme seco em uma estufa a vácuo a 60 graus Celsius e 25 quilopascal, com um recipiente contendo água no fundo da câmara.Retire o ar do forno, permitindo que os vapores de água atinjam todas as amostras por pelo menos duas horas. Após a liberação do vácuo e a remoção das amostras do forno, desprenda o filme insolúvel em água do substrato utilizando pinças. Por fim, teste a resistência elétrica do padrão metálico nos filmes de liga proteica e compare-a com o padrão original sobre o vidro.Interações típicas entre proteínas podem incluir atrações eletrostáticas, ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e hidrofílicas, bem como dipolos, solventes e contra-íons, e efeitos entrópicos entre domínios específicos da proteína. Os efeitos dessas interações podem ser previstos por meio de simulações computacionais durante a simulação de alongamento. Uma proteína pode formar uma rede elástica semelhante a molas, conferindo superelasticidade aos materiais, enquanto outra pode atuar como partículas com ligantes cruzados físicos fortes para os materiais.Transições estruturais dinâmicas podem ser induzidas em diferentes domínios para armazenar e liberar energia ou fornecer suporte mecânico adicional. As soluções de ligas proteicas podem ser transformadas em diversos biomateriais com propriedades ajustáveis, incluindo matrizes materiais para aplicações térmicas, mecânicas, ópticas, elétricas, químicas ou biomédicas. Nesta demonstração, a resistividade elétrica à temperatura ambiente dos circuitos elétricos sobre as películas proteicas foi medida utilizando técnicas de dois terminais e quatro terminais.Nas medições com dois terminais, os filmes apresentaram uma resistividade de 3,6 vezes 10 à potência de menos sete ohm metros, aproximadamente 20 vezes maior do que a do material em massa. Uma resistividade mais elevada medida em filmes em comparação com o material em massa é típica, devido ao caminho da corrente já restrito e à incapacidade dos portadores de carga de evitarem defeitos. Ao alterar a proporção dos componentes proteicos, podemos controlar propriedades biofísicas dos materiais finais, como sua elasticidade, resistência, rugosidade superficial ou carga superficial.Essas propriedades afetariam, em última instância, as funções e comportamentos dos tecidos ligados ao material. Portanto, o sistema de ligas proteicas nos oferece uma nova via para produzir dispositivos médicos implantáveis ou materiais com funções ajustáveis no futuro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar circuitos nesses materiais, e esperamos que os protocolos que fornecemos no artigo beneficiem tanto cientistas pesquisadores quanto médicos clínicos em diversos campos biomédicos no futuro.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Filmes de seda são uma nova classe de biomateriais facilmente personalizáveis ​​para uma vasta gama de aplicações biomédicas. O sistema de cultura de seda apresentado filme é altamente adaptável a uma variedade...

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Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

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