In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e analisar a migração de Neuroblast ao longo do fluxo migratório rostral no cérebro de camundongos pós-natal. Isso é realizado pela primeira proteína fluorescente verde de revestimento ENC de plasmídeo de DNA eletroporado no ventrículo lateral dos pops do camundongo. O segundo passo é preparar fatias de cérebro dos camundongos eletroporados.

Em seguida, as fatias com o melhor sinal GFP são selecionadas para cultura. A etapa final é a imagem de lapso de tempo das fatias cerebrais contendo o neuroblasto migratório rotulado com GFP usando um microscópio confocal de disco giratório. Em última análise, os filmes de lapso de tempo são usados para rastreamento celular e análise quantitativa da migração de neuroblastos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese, como a forma como o movimento do neuroblasto derivado de células-tronco é guiado e regulado no cérebro pós-natal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a entrega de vetores virais, é que ela é mais fácil, mais barata e menos demorada. Além disso, permite a marcação esparsa de neuroblastos, permitindo assim uma análise detalhada de sua dinâmica de migração.

Comece este procedimento definindo a tensão do eletroporado para cinco pulsos quadrados, 50 milissegundos por pulso a 100 volts com intervalos de 850 milissegundos. Em seguida, carregue uma agulha capilar com um a dois microlitros de DNA usando um tubo aspirador conectado ao capilar. Em seguida, remova um filhote de camundongo pós-natal do segundo dia da gaiola e anestesiá-lo por inalação de flúor.

Depois disso, segure a cabeça do filhote entre o polegar e o indicador da mão menos dominante. Puxe levemente a pele para trás na cabeça para ajudar na identificação do ponto de injeção correto. Considere uma linha virtual entre o olho e o marco craniométrico Lambda.

Em seguida, insira a agulha capilar em cerca de um terço do comprimento desta linha do Lambda até cerca de dois milímetros de profundidade depois, injete o plasmídeo soprando lentamente pela boca. Durante este procedimento, certifique-se de que seus dedos não estejam aplicando muita pressão no cérebro. Pare a injeção quando uma quantidade mínima de solução de DNA for deixada no capilar.

Em seguida, cubra os dois eletrodos com gel e coloque-os com o lado positivo no lado lateral do hemisfério onde o DNA foi injetado. Para a incorporação do DNA na SVZ Rostral, coloque os eletrodos levemente rostral ao ponto de injeção. Em seguida, inicie a transferência de corrente pressionando o pedal do pedal de pulso.

Em seguida, limpe o gel da cabeça do filhote, reanime o filhote com oxigênio em uma almofada de aquecimento por alguns minutos. Em seguida, devolva-o à gaiola e coloque-o longe da mãe. Certifique-se de que a mãe recupere o filhote e o reúna com o resto da ninhada.

Neste procedimento, coloque as inserções de células milimétricas em uma placa de cultura com fundo de vidro de 35 milímetros contendo um mililitro de meio de filme. Em seguida, coloque a placa de cultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Depois de decapitar o filhote de rato, remova o couro cabeludo com um bisturi.

Em seguida, corte o crânio ao longo da sutura sagital média do cerebelo até o bulbo olfatório. Faça alguns cortes transversais adicionais no crânio e remova suavemente os retalhos cranianos usando uma pinça. Certifique-se de que todo o cérebro esteja exposto e disseque-o cuidadosamente usando uma espátula, tomando cuidado especial para não danificar o tecido.

Depois disso, dissecar o cérebro com uma lâmina de barbear e descartar o hemisfério injetado. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de fita adesiva no suporte vibram. Use a quantidade mínima de cola necessária para prender o hemisfério cerebral nele.

Comece a cortar o hemisfério cerebral em fatias de 300 mícrons. Em seguida, colete as fatias usando um pincel pequeno ou um laço de inoculação macio. Depois, verifique ambos os lados das fatias sob um microscópio fluorescente padrão para sinal GFP e escolha aqueles que mostram fluorescência brilhante ao longo da maior parte do fluxo migratório rostral.

Em um capuz de autocultura, corte o terço mais mimado da fatia do cérebro e remova quaisquer vestígios de cola. Em seguida, aspire a fatia usando uma pipeta de plástico e coloque-a no centro de uma inserção de células mili pré-aquecidas. Remova o excesso de solução de dissecção em cima do inserto com uma pipeta gilson.

Em seguida, deixe as culturas de fatias assentarem em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5% por pelo menos uma hora. Antes da imagem dentro de duas horas após a preparação da fatia cerebral. Coloque o prato de fundo de vidro contendo a fatia de cérebro na câmara de imagem no microscópio stage.

Em seguida, use uma objetiva de 20 x 0,45 sob a luz fluorescente apropriada para selecionar e focar a área da fatia que será fotografada. Para configurar a imagem de lapso de tempo no microscópio, clique no botão L 100 para permitir a varredura a laser da amostra. Em seguida, abra o ultra view trocador de laser selecionando o laser apropriado.

Defina o ganho de tempo de exposição e a intensidade do laser. Em seguida, selecione o intervalo Zack para obter imagens dentro do cérebro. Depois, selecione o espaçamento entre cada imagem de pilha ZS.

Escolha o intervalo de tempo entre cada captura de pilha ZS e a duração total da imagem. Em seguida, clique no ícone salvar para salvar as alterações nos parâmetros de imagem. No final, pressione o botão de gravação para iniciar a geração de imagens no módulo de quantificação de velocidade.

Abra a biblioteca desejada criada. Depois de concluir um experimento de lapso de tempo, selecione o foco estendido na caixa superior esquerda. Clique na guia de medições para exibir a janela de medição.

Uma lista de tarefas é visível na parte inferior esquerda da tela. Arraste a faixa no espaço acima. Isso solicitará a abertura de uma nova janela chamada track.

Na seção superior esquerda da tela, selecione pontos na guia de entrada na janela de trilha. Clique na ferramenta de ponto, clique na guia de ferramentas e selecione a opção rastrear objetos manualmente, uma janela aparecerá para permitir que o operador comece a rastrear as células. Comece a rastrear o neuroblasto migratório clicando com o mouse na área central do corpo celular e continue rastreando o movimento celular até que o último ponto do lapso de tempo seja alcançado.

Para obter dados, selecionar fazer item de medição. No menu de medidas, uma janela aparecerá no centro da tela. Nesta janela, selecione um novo item de medida chamado e digite um nome para um item de medida.

O arquivo contendo parâmetros para análise quantitativa aparecerá no arquivo de lapso de tempo. Clique duas vezes neste arquivo de item de medição para abri-lo como uma janela para visualizar as trilhas únicas das células analisadas. Escolha o ponto rastreado nas opções de exibição e selecione as células que precisam ser visualizadas para seu caminho migratório.

Para analisar os parâmetros de migração, clique com o botão direito do mouse no arquivo do item de medição e exporte-o como um arquivo de texto, que pode ser importado em programas como o Excel. Estas são as imagens de lapso de tempo de disco giratório de neuroblasto tiradas de uma fatia de cérebro sagital de camundongo. Cinco dias após a eletroporação de imagens de plasmídeo que expressam A GFP têm uma hora de intervalo.

Cada painel é uma projeção Zack de 28 imagens consecutivas separadas por quatro mícrons. As pontas das setas indicam quatro neuroblastos representativos migrando ao longo do RMS em direção ao bulbo olfatório. Estas são as rotas migratórias representativas obtidas a partir da imagem de lapso de tempo de quatro neuroblastos.

Este gráfico mostra a distância migrada com o tempo de dois neuroblastos representativos. Essas células exibem um comportamento móvel saltatório típico. Este filme mostra uma seção do mouse RMS com GFP rotulado migrando.

Neuroblasto obtido cinco dias após a eletroporação do plasmídeo expressor de A GFP. O bulbo olfatório está localizado fora de vista no canto inferior direito. As pilhas Z confocais foram capturadas em um disco giratório confocal.

Com uma objetiva de 20 x a cada três minutos por três horas em um intervalo de 120 mícrons, a velocidade de reprodução é de 10 quadros por segundo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de praticar a eletroporação antes de iniciar os experimentos e também preparar cuidadosamente as culturas de fatias cerebrais agudas no menor tempo possível. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar e analisar a migração de neuroblastos no cérebro de camundongos pós-natal.