Name: In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a visualizar e analisar a migração de neuroblastos no cérebro pós-natal de camundongos usando eletroporação in vivo e imagem de lapso de tempo. Este método permite o rastreamento celular em tempo real.

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MS e YZ são suportados pelo KCL e KCL-China bolseiros de doutoramento. MO foi financiado por uma Biotecnologia e PhD Ciências Biológicas Research Council studentship. Agradecemos Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki para o plasmídeo PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti para conselhos valiosos sobre eletroporação.

Este procedimento está de acordo com os Regulamentos do Reino Unido O Home Office (Lei procedimentos científicos animal, 1986). Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelos organismos reguladores animais institucionais e nacionais. 1. Pós-Natal Eletroporação 1.1. Preparação de capilares de vidro, solução de ADN e Electroporator <ol><li> Prepare capilares de vidro puxado (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) para injeção de DNA. (Configurações indicativos para um extrator capilar Sutter P-97 são: Heat 283; Puxe 50; Velocity 90; Tempo 50). Fazer uma marca no capilar que corresponde a um volume de cerca de 2 ul. </li><li> Ajuste a tensão da electroporador para 5 pulsos quadrados, 50 ms / pulso a 100 V, com 850 intervalos ms (100 V, pulso em 50 ms, pulso OFF 850 ​​ms, pulso 5). </li><li> Dilui-se de elevada pureza (OD 260/280&gt; 1.80) isenta de endotoxina plasmídeo de DNA para uma concentração final de 1-2 mg / mLcom endotoxina libertar tampão de Tris-EDTA, ou PBS. Recomenda-se adicionar 0,1% de Fast Green para a solução de ADN (o corante deve espalhar no ventrículo quando injectados com sucesso). </li><li> Prepare os eletrodos 5-7 mm, o gel do eletrodo e aquecer a almofada de aquecimento. </li></ol> 1.2. Eletroporação <ol><li> Retirar um dia pós-natal do rato 2 filhote de gaiola e anestesiar lo por inalação de isoflurano (a um caudal de ~ 0,6 L / min). </li><li> Após aproximadamente 1 min, determinar o estado de anestesia por meio da resposta pé pitada. Se ocorrer nenhum movimento, continue com injeção intraventricular. </li><li> Carregar agulha capilar com 1-2 ul de ADN, utilizando um tubo de aspirador ligado ao capilar. </li><li> Com uma fonte de luz fria, segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante. Ligeiramente puxar a pele para trás na cabeça para ajudar a identificação do ponto de injeção direita. </li><li> Considere uma linha virtual entre o olho ea tele craniométricas marco lambda (Figura 1A). Inserir a agulha capilar em cerca de um terço do comprimento da linha de lambda (cerca de 1 mm a partir do ponto médio linha 15). Insira o capilar de cerca de 2 mm de profundidade, tornando-se de evitar a penetração profunda no cérebro. </li><li> Injectar plasmídeo fundindo lentamente através da boca (uma seringa ligada ao capilar também pode ser utilizado). Durante este procedimento, certifique-se de que seus dedos não estão aplicando demasiada pressão sobre o cérebro, pois isso pode evitar injeção de sucesso plasmídeo. </li><li> Pare injecção, quando uma quantidade mínima de solução de ADN é deixado no capilar. É aconselhável administrar com menos do que 1 ml para evitar o aumento pernicioso da pressão intracraniana. </li><li> O revestimento de gel com os dois eléctrodos e colocá-las com o lado positivo sobre o lado lateral do hemisfério, onde o ADN foi injectada (Figura 1A). Por incorporação de DNA no ZSV rostral, colocar eletrodos levemente rostral aoponto de injeção. Variando posição do eletrodo pode alcançar especificidade regional de eletroporação em diferentes áreas do ZSV 22,25. </li><li> Iniciar transferência atual, pressione o pedal de pulso pedal. Quando a eletroporação é completa, verifique a tensão no visor electroporador (valores de tensão não deve ser inferior a 90 V, uma vez que os valores mais baixos de tensão se correlacionam com baixa eficiência eletroporação). </li><li> Reanimar o filhote sob oxigênio na almofada de aquecimento por alguns minutos e devolvê-lo à gaiola, colocando-o para longe da mãe. Certifique-se de que a mãe recupera o cachorro e se reúne com o resto da ninhada. Depois de eletroporação, deixe os filhotes com a mãe para 4-7 dias antes da próxima etapa. </li></ol> 2. Preparação das Culturas aguda do cérebro Fatia 2.1. Preparação de soluções e ferramentas <ol><li> As soluções que se seguem são necessárias (isto é também possível a utilização de DMEM-elevado teor de glicose para dissecar e imagiologia17): Dissection Médio (500 ml) Mídia equilibrada de Gey - 500ml 45% de Glicose - 5ml Médio Filme (10 ml) 45% de Glicose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0,100 ml Pen / Strep - 0,100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0,100 ml Glutamina - 0.200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (vermelho de fenol-livre) - 8,89 ml </li><li> Meio de aquecimento filme a 37 ° C. </li><li> Coloque Millicell insere em um prato de cultura de fundo 35 milímetros de vidro contendo 1 ml de meio de filme e colocar num incubador humidificado a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Prepare vibratome acessórios (chave de fenda, câmara, lâminas de barbear, cola). </li><li> Prepare ferramentas de dissecação: tesouras, pequena espátula, pinça retas. </li><li> Preparar as ferramentas para lidar com fatias: pincel pequeno ou loop inoculação suave (tamanho: 10 mL), pipetas Pasteur de plástico, uma caixa de gelo e vários pratos de plástico 6 cm. </li><li> Pré-resfriar o meio de dissecçãoa 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Preparação de fatias do cérebro <ol><li> Encha um prato com seis centímetros médio dissecção resfriadas e colocá-lo em gelo (para manter fatias recém-cortadas). </li><li> Após deslocamento cervical, use uma tesoura para decapitar o filhote do rato. Remover o couro cabeludo com um bisturi, cortar o crânio, ao longo da sutura sagital médio do OB para o cerebelo e remover suavemente as abas cranianos utilizando fórceps. Certifique-se de todo o cérebro é exposto e dissecar cuidadosamente-lo usando uma espátula, tendo especial cuidado para não danificar o tecido. A dissecção tem de ser feito com cuidado, mas ao mesmo tempo muito rapidamente (menos do que um minuto, se possível). Deslocação cervical é o nosso método preferido porque anestesia terminais com anestésicos drogas / gás pode influenciar as propriedades migratórias dos neuroblastos eo estado de saúde das culturas fatia do cérebro, que precisam ser trabalhada de forma relativamente rápida após o sacrifício de animais. </li><li> Hemisect o cérebro com uma razou lâmina (Figura 2). Descarte hemisfério não injectado ou utilizar para outros experimentos. </li><li> Coloque um pequeno pedaço de fita adesiva no porta-vibratome e usar a quantidade mínima necessária de cola para fixar o hemisfério cerebral em cima dela (Figura 2). Isso evita danos da superfície do suporte devido a repetidas aplicações de cola. </li><li> Deixe a cola secar por alguns segundos. </li><li> Coloque o suporte na bandeja do vibratome preenchido com solução dissecção pré-resfriado. O ponto do bolbo olfactivo em direcção da lâmina (Figura 2). </li><li> Comece cortando o hemisfério cerebral usando as configurações apropriadas. Os parâmetros a seguir são recomendadas: espessura do corte 300 mm, a velocidade ~ 3-5; freqüência ~ 9. De alta freqüência e baixa velocidade são recomendados para evitar danos à fatia. </li><li> Colete fatias usando um pincel pequeno ou um loop inoculação macio. Apenas manter fatias com OB visível (geralmente 2-3 fatias / cérebro). Tipicamente, a fatia contendo a maior parte dos ca RMSn ser encontrada em ~ 300 mm a partir da superfície de fundo. </li><li> Verifique fatias sob um microscópio fluorescente padrão para o sinal GFP (certificando-se para lançá-los ao longo de verificar fluorescência em ambos os lados), e escolha os que apresentaram fluorescência ao longo da maioria dos RMS. </li></ol> 2.3. Cultivar fatias do cérebro do <ol><li> Em uma capa de cultura celular, cortar o terceiro mais caudal da fatia do cérebro e eliminar quaisquer vestígios de cola usando uma pinça reta finas ou um bisturi microdissection. </li><li> Delicadamente aspirar a fatia usando uma pipeta Pasteur de plástico (corte a ponta da pipeta para criar uma abertura maior, isso vai evitar danos a fatia) e colocá-lo no centro de um pré-aquecido Millicell inserção. </li><li> Certifique-se de lado, com o sinal fluorescente brilhante é colocado em contacto com o Millicell inserir (para imagens com um microscópio invertido). </li><li> Remover o excesso de solução de dissecção no topo do inserto com uma pipeta. </li><li> Deixe culturas fatia paraestabelecer-se a 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 1 hr antes de imagem. </li></ol> 3. Time-lapse de imagens de Migração neuroblasto <ol><li> Pelo menos 2 horas antes de imagem, ligue o sistema de Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal fiação, invertido Nikon Ti-E microscópio, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), arrefecido câmera CCD digital, e sistema de aquecimento (Solent Scientific), fixado em constante temperatura de 37 ° C. </li><li> Abra o módulo de aquisição de software Volocity e clique no botão &quot;Viz&quot; e selecione o laser (s) para a imagem latente. </li><li> Dentro de 2 horas de cérebro preparação fatia, coloque o prato fundo de vidro que contém a fatia do cérebro na câmara de imagem no palco microscópio. </li><li> Utilize uma objectiva Nikon CFI Super Plano Fluor ELWD 20X/0.45 sob a luz fluorescente apropriado para selecionar e focar a área da fatia que vai ser trabalhada (por exemplo, a primeira parte descendente dos RMS logo após o local da injeção, ou o Elbow região das RMS, ou logo após o cotovelo antes neuroblastos entrar no OB). </li><li> Configure a imagem time-lapse com as seguintes ações: <ol><li> No microscópio, clique no botão L100 para permitir a digitalização a laser da amostra. </li><li> Em Volocity, abra o UltraView Laser Changer, selecionando o laser adequado (por exemplo, 488 nm laser para GFP). </li><li> Ajustar o tempo de exposição (normalmente entre 100-500 ms) e a intensidade do laser (geralmente 20-30%) em função da intensidade do sinal fluorescente. </li><li> Ajuste o ganho digital de imagem para melhorar a visualização celular. </li><li> Selecione o intervalo de z-stack de imagem dentro da fatia do cérebro (geralmente ao longo de um intervalo de 100-120 mm). Escolha de um intervalo com um número adequado de células isoladas a fim de evitar possível sobrepor tanto quanto possível (isto irá facilitar a análise subsequente de rastreamento). </li><li> Seleccione o espaçamento entre cada imagem z pilha (geralmente 2-4 mm) entre. </li><li> Escolha o tempo intErval entre cada captura z pilha (por exemplo, 3 min) e a duração de imagem total (por exemplo três horas). </li><li> Clique no ícone &quot;salvar&quot; para salvar as alterações nos parâmetros de imagem. </li><li> Pressione o botão de gravação para iniciar a imagem. </li></ol></li><li> Imagiologia alternativo de amostras de controlo e experimentais (por exemplo, tratamento do veículo / fármaco ou diferentes plasmídeos electroporadas) ao longo do mesmo dia. </li></ol> 4. Analisando neuroblasto Migração <ol><li> No módulo Volocity quantificação, abra a biblioteca desejada criado depois de completar um experimento de time-lapse. Selecione &quot;Focus prolongado&quot; da caixa superior esquerdo (Figura 4A, passo 1). </li><li> Clique na aba &quot;Medidas&quot; para exibir a janela de medição (Figura 4A, passo 2). </li><li> Uma lista de tarefas é visível no canto inferior esquerdo da tela. Arraste &quot;Track&quot; (presente no âmbito do &quot;Diversos&quot; título na parte inferior daa lista) no espaço acima. Isto irá pedir a abertura de uma nova janela chamada &quot;Track&quot; no topo seção esquerda da tela (Figura 4A, etapa 3). </li><li> Selecione &quot;Pontos&quot; na guia &quot;Input&quot; na janela Track (Figura 4A, passo 4). </li><li> Clique na ferramenta Ponto (Figura 4A, passo 5). </li><li> Começar a controlar a migração de neuroblastos, clicando com o mouse sobre a área central do corpo celular e manter o acompanhamento do movimento das células até o último instante do lapso de tempo é atingido (por exemplo ponto número 61 para um filme de longa hr-3) . </li><li> Para obter os dados, escolha &quot;Fazer item Medição&quot; no menu Medidas (Figura 4B, os passos 6-7). Uma janela irá aparecer no centro da tela. </li><li> Nesta janela, selecione &quot;Um novo item de medição chamado:&quot; e digite um nome (Figura 4C, passo 8). Lembre-se de selecionar a opção &quot;Todos os pontos temporais&quot; antes de pressing OK (Figura 4C, passo 9). Um arquivo de item de medição aparecerá sob o arquivo time-lapse e conterá os parâmetros de análise quantitativa (por exemplo, a distância de migração, velocidade, deslocamento, e de taxa de deslocamento). </li><li> Dê um duplo clique no arquivo do item de medição para abri-la como uma janela (Figura 4D, passo 10). </li><li> Para visualizar as faixas individuais de células analisadas, escolha &quot;Ponto de rastos&quot; entre as opções &quot;Display&quot; (Figura 4D, etapa 11). </li><li> Botão direito do mouse sobre o arquivo do item Medição e exportá-lo como um arquivo de texto, que pode então ser importado em programas como o Excel para analisar parâmetros de migração. </li><li> Para medir movimentos entre quadros consecutivos e pausas feitas por cada célula durante o período de filmagens, no arquivo do item de medição selecionar a opção &quot;Exibir&quot; opções &quot;Ponto&quot; ou &quot;populações&quot; e clique no ID (cada faixa tem uma identificação única). Exportar o arquivo resultante de procederção, tal como explicado no passo 4.10. </li></ol>

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<li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Migração eficiente de progenitores neurais ao longo das RMS garante sua maturação posterior em neurônios funcionais 10. Fluxos importantes de progenitores neurais voltadas para o OB são visíveis na infância humana e são susceptíveis de desempenhar um papel importante no início de pós-natal o desenvolvimento do cérebro humano 27. Além disso, essas células são capazes de atingir locais do cérebro afetadas por lesões e neurodegeneração 4,28. Ser capaz de monitorar em tempo real o efeito de ...

No cérebro de mamíferos, a geração de novos neurónios (neurogénese) ocorre após o nascimento, principalmente em duas regiões, da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular no giro dentado do hipocampo 1. Evidências consideráveis ​​se reuniram nos últimos anos suporta um papel crítico para a neurogênese pós-natal em funções de memória do hipocampo e bulbo olfatório 1-3. É importante ressaltar que a neurogênese pós-natal também tem potencial terapêutico por causa de sua relação com doenças neurológicas degenerativas, bem como a capacidade de neuroblastos para migrar para locais feridos no cérebro 4-6. A zona subventricular (SVZ) surgiu recentemente como um nicho neurogênico crucial. Neuroblastos ZSV derivados migram para o bulbo olfatório (OB) através do fluxo migratório rostral (RMS), tornando este o processo de migração mais longa do 1,7,8 cérebro pós-natal. A / RMS / sistema OB mamíferos ZSV tornou-se ummodelo útil para estudar os diferentes passos de neurogênese, como proliferação, migração e diferenciação 1,8. Muitos fatores de crescimento e sinais extracelulares regulam a neurogênese ZSV e migração ao longo das RMS, mas os mecanismos moleculares intracelulares estão longe de ser totalmente compreendida 1,9. Migração adequada ao longo das RMS é crucial para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos 10. Além disso, alguns estudos têm mostrado que neuroblastos ZSV derivados podem migrar para fora da RMS para locais de lesão cerebral 4-6,11-13. Assim, investigar a migração neuroblastos mecanismos de sinalização de regulação é fundamental não só para entender a neurogênese, mas também para potenciais aplicações terapêuticas. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para rotular progenitores neurais SVZ por eletroporação in vivo pós-natal e acompanhar sua migração ao longo das RMS em culturas agudos fatia cérebro usando time-lapse confocal disco giratório microscopiapy. A electroporação é amplamente utilizado em estudos de desenvolvimento embrionário a partir de fases adultas 14-18. É uma ferramenta poderosa para direcionar e manipular progenitores neurais SVZ e representa uma alternativa mais barata e consideravelmente mais rápido a injeção estereotáxica de vetores virais ou geração de modelos transgênicos 1,15,19,20. É um procedimento relativamente simples que não precisa de cirurgia e tem altas taxas de sobrevivência. Eletroporação de shRNA ou CRE plasmídeos expressando recombinase em modelos genéticos de mouse que utilizam o sistema LoxP pode ser usado para alvejar genes de interesse ou para alcançar marcação permanente de progenitores SVZ, representando, portanto, uma ferramenta útil para os estudos de neurogênese adulta 21,22. Imagem RMS neuroblasto migração no cérebro intacto ainda é um desafio devido a limitações técnicas atuais. No entanto, este processo pode ser monitorado usando disco confocal fiação microscopia de lapso de tempo de fatias cerebrais agudas, que proporcionam um sist adequadolos muito parecidas com a condição in vivo também passível de manipulação farmacológica 23,24. Acoplamento em electroporação pós-natal in vivo com imagiologia de lapso de tempo irá facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblastos e contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Prato de cultura com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mídia balanceada Gey's</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicose, 45%</td> <td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pen/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>suplemento B27</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (sem fenol vermelho)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro para injeção</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de aspiração</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 extrator capilar</td><td>Sutter Instrumento</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Eletroporador de onda quadrada</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrodes 7 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Pedal Modelo 1250F</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Gel para eletrodos</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Cola</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>UltraViEW VoX sistema de disco giratório</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Configuração personalizada (podem ser utilizadas várias fontes de laser) equipado com Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B Câmera CCD</td></tr><tr><td>Software Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Módulos de Aquisição, Quantificação, Visualização Câmara</td></tr><tr><td>ambiental para microscopia</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Ti-E</td> feito à medida <td>Nikon</td><td></td><td>A objetiva CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0,45 NA é recomendada para a aplicação descrita neste artigo</td></tr></tbody></table>

in vivo eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto migração na aguda fatias do cérebro do rato

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

A zona subventricular (SVZ) é um dos principais nichos neurogénicos no cérebro pós-natal. Aqui, células progenitoras neurais proliferam e dão origem a neuroblastos, capazes de se mover ao longo do fluxo migratório rostral (RMS) em direcção ao bolbo olfactivo (OB). Esta migração de longa distância é necessário para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos no OB, mas os mecanismos moleculares que regulam este processo ainda não são claras. Investigando as vias de sinalização que controlam a motilidade neuroblasto não só pode ajudar a entender um passo fundamental para a neurogênese, mas também têm potencial regenerativo terapêutico, dada a capacidade desses neuroblastos atacar sites do cérebro afetadas por uma lesão, acidente vascular cerebral, ou degeneração. Neste artigo descrevemos um protocolo detalhado para eletroporação in vivo pós-natal e posterior de imagens de lapso de tempo de migração neuroblastos na RMS do mouse. Eletroporação pós-parto pode eficientemente transfecção ZSV progenitorcélulas, que por sua vez geram neuroblastos que migram ao longo da RMS. Usando microscopia confocal girando time-lapse disco em culturas fatia agudas do cérebro, a migração neuroblastos pode ser monitorado em um ambiente que se assemelha de perto a condição in vivo. Além disso, a motilidade neuroblasto podem ser rastreados e analisados ​​quantitativamente. Como exemplo, descrevemos como usar in vivo pós-natal eletroporação de um plasmídeo expressando GFP para rotular e visualizar neuroblastos que migram ao longo das RMS. Electroporação de shRNA ou plasmídeos que expressam CRE recombinase em ratinhos knockout condicionais que empregam o sistema LoxP também pode ser utilizado para alvejar genes de interesse. Manipulação farmacológica de culturas de fatias cerebrais agudas pode ser realizada para investigar o papel de diferentes moléculas de sinalização em migração neuroblastos. Ao unir em eletroporação vivo com imagens de lapso de tempo, esperamos compreender os mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblasto e contribuir para o desenvolvimentomento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.

Etiquetagem de neuroblastos migratórias SVZ derivados podem ser observadas ao longo da RMS, normalmente 4-8 dias depois de um bem sucedido electroporação (Figura 1B). Os pontos de tempo mais longos, também pode ser escolhido, mas menos células serão encontrados na RMS vez que a maioria terá entrado no OB. Os neuroblastos iniciar a aquisição de morfologia típica e características de células granulares maduros no OB de cerca de 2-3 semanas após a electroporação (não mostrado). Depois de cultura para ~ 1 h...

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e analisar a migração de Neuroblast ao longo do fluxo migratório rostral no cérebro de camundongos pós-natal. Isso é realizado pela primeira proteína fluorescente verde de revestimento ENC de plasmídeo de DNA eletroporado no ventrículo lateral dos pops do camundongo. O segundo passo é preparar fatias de cérebro dos camundongos eletroporados.Em seguida, as fatias com o melhor sinal GFP são selecionadas para cultura. A etapa final é a imagem de lapso de tempo das fatias cerebrais contendo o neuroblasto migratório rotulado com GFP usando um microscópio confocal de disco giratório. Em última análise, os filmes de lapso de tempo são usados para rastreamento celular e análise quantitativa da migração de neuroblastos.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese, como a forma como o movimento do neuroblasto derivado de células-tronco é guiado e regulado no cérebro pós-natal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a entrega de vetores virais, é que ela é mais fácil, mais barata e menos demorada. Além disso, permite a marcação esparsa de neuroblastos, permitindo assim uma análise de

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://dx.doi.org/10.3791/55886-v'&gt; Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Este vídeo demonstra a microscopia confocal de lapso de tempo para observar a migração radial do neurônio cortical da zona subventricular para a placa cortical por meio de andaimes gliais radiais em fatias de cérebro embrionário de...

Imagem de lapso de tempo da migração radial de neurônios corticais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas

Migração neuroblastos é um passo crucial na neurogênese pós-natal. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para investigar o papel dos reguladores de candidatos de migração neuroblastos empregando DNA / RNA pequeno hairpin (shRNA) nucleofection e um ensaio de migração 3D com neuroblastos isolados do roedor pós-natal fluxo migratório rostral.

Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração<em&gt; In vitro</em

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

Aprenda a visualizar e analisar a migração de neuroblastos no cérebro pós-natal de camundongos usando eletroporação in vivo e imagem de lapso de tempo. Este método permite o rastreamento celular em tempo real.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

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