Name: Picoinjection de Microfluidic Drops sem metal Eletrodos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda picoinjeção em gotículas microfluídicas sem eletrodos metálicos para injeção precisa de reagentes. Este método simplifica a fabricação de dispositivos e permite controle de volume em resoluções de picolitros.

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Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Bioengenharia e Ciências Terapêuticas da UCSF, o instituto de Califórnia para Quantitativos Biociências (QB3), eo Bridging the Gap Prêmio da Fundação Rogers Família.

1. Projeto do dispositivo Dimensões e Topologias Baseado Experimental necessidades usando Computer Aided Design (CAD) Software Nota: Selecção diâmetros dos canais de emulsão mais pequenas do que as das gotículas esféricas. Isso força as gotículas para um cilíndrico ou &quot;salsicha&quot; forma e permite picoinjection mais eficaz. Para os nossos propósitos, nós projetamos 30 x 30 mm canais de gotículas que eram de 50 m de diâmetro. <ol><li> Local picoinjection Modelo (s) depois de os descritos por Abate et al. 3 com a excepção de que os canais para os eléctrodos de metal são removidas, como eles são desnecessários. </li><li> Adicionar canais para servir como o fosso de Faraday (Figura 1), que funcionam entre o local picoinjection (s) e a emulsão a montante de tal forma que eles protegem as gotículas do campo eléctrico. Nota: Este impede fusão não intencional. </li></ol> 2. Dispositivos Fabricar com SOFT fotolitoTécnicas ographic <ol><li> Gerar uma máscara de transparência fotolitografia com base no arquivo CAD usando serviços comerciais existentes. </li><li> Com a foto-mascara, curar fotorresistente em bolachas de silício para produzir um dispositivo mestre, tal como descrito anteriormente 4. </li><li> Despeje PDMS misturado com agente de cura (proporção 11:1) sobre o mestre dispositivo contido em um cinco centímetros de poliestireno placa de Petri. </li><li> Colocar o mestre com PDMS em um exsicador de vácuo durante cerca de 15 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Curar o dispositivo de PDMS, colocando-o num forno de 95 ° C durante 1 hora. Em alternativa, o PDMS irá curar à RT após 24 horas. </li><li> Remova o dispositivo, cortando todo o perímetro com uma lâmina cirúrgica e descascando cuidadosamente o dispositivo com o mestre. </li><li> Soco entrada e saída buracos nas PDMS usando uma biópsia de 0,5 mm. </li><li> Ligar o dispositivo a uma lâmina de vidro usando um bonder plasma 4. </li></ol> 3. Prepare uma pressão de arPump Control para pressurizar um reservatório contendo o Fluido <ol><li> Modificar a saída da bomba de tal modo que as saídas de ar comprimido através de um comprimento de tubo de polietileno de 2,7 milímetros de diâmetro interno. </li><li> Construí-la de modo a que a tubagem termina numa seringa de ponta luer-lock ajustando a luz sobre o mamilo na parte traseira do luer. </li><li> Selar preenchendo o espaço entre os fios de luer-lock e a tubagem com epóxi. </li><li> Coloque uma agulha 27,5 G. </li></ol> 4. Preparar uma Monodisperse emulsão aquosa de Gotículas (água-em-óleo) em suspensão em um portador inerte fluorado óleo com 2% (p / p) dissolvido biocompatível Surfactante 7 Os reagentes específicos contidos nestas gotas dependem da aplicação <ol><li> Em preparação para a reinjecção, carregar a emulsão para uma seringa de 1 ml com uma agulha G 27,5. </li><li> Fixe a seringa em uma bomba de seringa e orientar a bomba vertical (agulha para cima). NotaEsta orientação faz com que as gotículas de embalar numa camada acima do óleo veicular. Quando a bomba está a funcionar, as gotículas irá ser empurrado para fora da seringa na fracção de elevado volume da camada de óleo por baixo deles. </li></ol> 5. Prepare Reagentes para Introdução ao chip microfluídico <ol><li> Perfurador três furos 0,5 milímetros para dentro da tampa de um tubo de centrífuga de 15 ml (um recipiente com uma tampa de rosca é suficiente) utilizando um perfurador de biópsia de agulha, ou broca. </li><li> Inserir um eléctrodo de arame de diâmetro de 0,5 mm e um cm de comprimento de tubagem de PE-2 ~ 20 através de dois dos furos de modo a que eles cheguem ao fundo do tubo. </li><li> No buraco restante, passe um ~ 2,5 centímetros de comprimento cm de tubos PE ~ 20 de tal forma que ele vai descansar acima do nível do fluido. </li><li> Vede todas as aberturas na parte superior da tampa com epóxi UV-curado. </li><li> Encha o tubo com o fluido picoinjection e parafuso na tampa. </li><li> Ligue a saída a partir da bomba de controle de pressão de ar com o comprimento mais curto de tubagem por inserçãoção da agulha para dentro do lúmen. A agulha deve caber confortavelmente. </li><li> Encher uma seringa de 1 ml com 1 M de NaCl para servir como o fosso de Faraday. </li><li> Conecte um G agulha 27,5 e segura a seringa em uma bomba de seringa. </li><li> Encha uma outra seringa de 1 ml com óleo do portador / espaçador, conecte uma agulha G 27,5, e fixá-lo em uma bomba de seringa. </li></ol> 6. Prepare o dispositivo micro para Picoinjection <ol><li> Ligar o tubo de saída (mais de comprimento) a partir do recipiente de fluido de injecção para a porta de entrada do fluido picoinjection no chip de microfluidos. </li><li> Ligar a seringa contendo a 1 M de NaCl para a porta de entrada para o fosso de Faraday no chip de microfluidos com um comprimento de tubagem de PE. </li><li> Ligar a seringa contendo o óleo do portador para a porta de entrada do chip de microfluidos com um comprimento de tubagem de PE. </li><li> Inserir tubos PE na porta de saída de emulsão sobre o chip de microfluidos. A tubulação deve terminar em um reservatório de recolha de emulsão, nemmalmente um tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Insira o tubo PE na porta de saída para o Faraday Moat no chip microfluídico. A tubulação deve terminar em um não-condutor e recipiente isolado eletricamente para evitar um curto-circuito. </li><li> Ligue a saída do amplificador de alta voltagem (HV) através de jacaré ao eléctrodo de metal submergido no fluido picoinjection. </li><li> Conecte o eletrodo de aterramento do amplificador HV via jacaré para o metal da agulha da seringa contendo o 1 M NaCl. </li></ol> 7. Infundir Reagentes para Microfluidic Chip <ol><li> Introduzir a 1 M de NaCl (Moat Faraday) para o dispositivo, a uma taxa de 100 il / hr. </li><li> Introduzir a emulsão de gotas e transportadora de petróleo a preços adequados para as dimensões do dispositivo. Para o nosso dispositivo de demonstração, apresentamos as gotas de óleo e de 200 e 400 mL / h, respectivamente. As taxas de fluxo deve permitir que as gotas para passar o picoinjector em intervalos regulares separadaspor um intervalo de óleo do portador. </li><li> Ajustar a pressão aplicada ao fluido picoinjection tal que a pressão do fluido no orifício picoinjection está em equilíbrio mecânico com o canal de gotícula. Nota: A esta pressão (a pressão de Laplace), o fluido de injecção deve inchar dentro do canal de gotículas sem brotando e formando as suas gotas (Figura 2). A estas taxas de fluxo acima descritas, que se aplica uma pressão de ~ 13 psi para o fluido de injecção para atingir o equilíbrio no local da injecção. </li></ol> 8. Comece Picoinjection <ol><li> Como as gotas passam pelo orifício de injecção, aplica um 0-10 V, 10 kHz, o sinal AC amplificada 1000 x por HV-amplificador (Figura 3). </li><li> Modular o volume de injecção, alterando a amplitude da tensão aplicada. Nota: As tensões mais elevadas deve permitir mais fluido a ser introduzido para as gotículas. Em nossos testes, observamos injeção estável e consistente com tensões serentre 100 e 3000 V usando soluções de injecção de NaCl variando 10-500 mM (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Kritikou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+cheaper+in+the+Picolab%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">It's cheaper in the Picolab.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).</li>
<li>Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+of+drops+synchronized+by+size-dependent+flow+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).</li>
<li>Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+injection+with+microfluidics+using+picoinjectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+device+for+the+compartmentalization+of+neuron+soma+and+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons.</a> J. Vis. Exp. (7), (2007).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li>
<li>O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode-free+picoinjection+of+microfluidic+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrode-free picoinjection of microfluidic drops.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+dynamics+passing+through+obstructions+in+confined+microchannel+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow.</a> Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).</li>
<li>Herminghaus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+instability+of+thin+liquid+films+between+conducting+media%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamical instability of thin liquid films between conducting media.</a> Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).</li>
<li>Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+electrocoalescence+in+microfluidics%3A+Targeting+a+single+lamella%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella.</a> Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).</li>
<li>Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrowetting-controlled+droplet+generation+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device.</a> J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
</ol>

Nós não entendemos completamente mecanismo físico exato por trás da relação entre a tensão aplicada eo volume de injeção observado em nossos experimentos. Os interesses do laboratório e áreas relevantes do conhecimento não são bem adequados para a prossecução desta pergunta persistente. Nós encorajamos aqueles com mais física e perspicácia de engenharia para explorar este fenômeno.

A relação entre o volume de injecção e a tensão aplicada dependem de muitos factores, incluindo as dimensões do dispositivo, o comprimento do tubo que transporta o fluido picoinjection para o dispositivo, a molaridade de fluido picoinjection, e a velocidade das gotas, quando passam eles injector. Por este motivo, recomendamos que a relação de volume / tensão ser caracterizado antes de cada execução de picoinjection medindo volumes de injecção nas bordas das faixas de trabalho da tensão e molaridade. Além disso, com tens...

Em microfluídica baseada em gotículas, gotículas aquosas escala mícron são usados ​​como &quot;tubos de ensaio&quot; para reações biológicas. A vantagem para a realização de reacções nas gotículas é que cada gota usa somente um poucos pl de reagente e, com a microfluidos, as gotas podem ser formadas e processadas em taxas kilohertz 1. Em conjunto, estas propriedades permitem que milhões de reacções com células individuais, moléculas de ácidos nucleicos, ou compostos a serem realizadas numa questão de minutos, com ul de material total. Para usar gotas para aplicações como estas, são necessárias técnicas para a adição de volumes controlados de reagentes para as gotas; tais operações são análogas às pipetando em tubos de ensaio. Um método para realizar isto é electrocoalescence, em que uma gota de reagente é fundida com a queda alvo através da aplicação de um campo eléctrico. O campo eléctrico perturba o arranjo de moléculas de surfactante sobre os interfaces das gotas, inducing uma instabilidade de película fina e provocando a coalescência em emulsões que são de outra maneira estável 2. Fusão induzidos electricamente é igualmente explorada no design do picoinjector, um dispositivo que injecta os reagentes em gotas à medida que fluem através de um canal pressurizado 3. Para aplicar o campo eléctrico, dispositivos picoinjector utilizar eléctrodos metálicos, mas a integração de eléctrodos metálicos em chips de microfluidos é geralmente um processo complexo e propenso a erros como os fios de líquido da solda são facilmente comprometidos por bolhas de ar ou poeira e outros detritos no canal , bem como fraturas de estresse ou flexão durante a configuração do dispositivo. Aqui é apresentado um método para realizar picoinjection sem a utilização de eléctrodos de metal, tornando o fabrico mais simples e mais robusto. Para acionar picoinjection, nós em vez usar o próprio fluido de injeção como um eletrodo, uma vez que a maioria dos reagentes biológicos contêm eletrólitos dissolvidos e são condutores. Nós também adicionar um &quot;Faraday Moat &quot;para proteger as regiões sensíveis do dispositivo e actuam como uma base universal (Figura 1). O fosso isola electricamente as gotículas a montante do local picoinjection proporcionando um solo, impedindo fusão gotícula não intencional. Um benefício adicional da nossa técnica é que o volume injectado nas gotas depende da magnitude da tensão aplicada, permitindo-lhe ser ajustado por meio do ajuste do sinal aplicado. Nós fabricamos os nossos dispositivos de poli (dimetilsiloxano) (PDMS), utilizando técnicas de fotolitografia suave 4,5. Nossa abordagem é compatível com dispositivos fabricados em outros materiais, como resinas, plásticos e epóxis. Os canais têm alturas e larguras de 30 mm, que são óptimas para o trabalho com gotas de 50 mm de diâmetro (65 pl). Nós introduzimos reagentes através de tubos polietileno (0.3/1.09 mm de diâmetro interno / externo) inserido portos criados durante fabricação de dispositivos com 0,50 milímetros socos biópsia, semelhantes aos métodos described anteriormente 5. A composição exacta do fluido de injecção, depende da aplicação específica. O fluido só necessita conter electrólitos dissolvidos em concentrações suficientemente elevadas para produzir condutividade suficiente para o sinal eléctrico a ser transmitido para o picoinjector. No teste de bancada, verificou-se que as concentrações iónicas superiores a 10 mm deve ser suficiente 6, embora este valor e condutividades fluido dependem das dimensões dos dispositivos específicos e magnitude da tensão aplicada.

<table><tbody><tr><td>Seringas Luer-Lok&trade; de 1 ml</td><td>BD Medical</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>LocTite Adesivo curado por UV</td><td>Tubulação Henkel</td><td>35241</td><td></td></tr><tr><td>PE-2</td><td>Scientific Commodities</td><td>BB31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td> <td>de centrífuga de 1,5 mlEppendorf</td><td>22363531</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de controle de pressão de ar</td><td>Control Air Inc.</td><td></td><td>Recomendamos um sob o controle do DAQ e do software de controle</td></tr><tr><td>Bombas de seringa</td><td>New Era</td><td></td><td>Deve ser capaz de conter seringas de 1 ml e fluir a taxas tão baixas quanto 100 &#956; l/hr</td></tr><tr><td>HV-amplfier</td><td></td><td></td><td>Deve ser capaz de amplificação de 1.000x de sinais entre 0,01 e 10 V</td></tr><tr><td>Bonder/limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" wafers de silício</td><td>Sigma Aldrich</td><td>647535</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 com agente de cura deve ser incluído</td></tr><tr><td>SU-8 fotorresistente</td><td>MicroChem</td><td></td><td>A viscocidade depende das dimensões do dispositivo</td></tr></tbody></table>

picoinjection de microfluidic drops sem metal eletrodos

Picoinjection of Microfluidic Drops Without Metal Electrodes

Métodos para picoinjecting reagentes em gotas microfluídicos existentes requerem eletrodos metálicos integrados ao chip microfluídico. A integração destes eletrodos acrescenta passos pesados ​​e propensos a erros no processo de fabricação do dispositivo. Desenvolvemos uma técnica que elimina a necessidade de eléctrodos metálicos durante picoinjection. Em vez disso, ele usa o próprio fluido de injeção como um eletrodo, uma vez que a maioria dos reagentes biológicos contêm eletrólitos dissolvidos e são condutores. Ao eliminar os eletrodos, que reduzem o tempo de fabricação de dispositivos e complexidade, e tornar os dispositivos mais robustos. Além disso, com a nossa abordagem, o volume de injecção depende da tensão aplicada à solução picoinjection; isso permite ajustar rapidamente o volume injectado por modulação da voltagem aplicada. Nós demonstramos que a nossa técnica é compatível com os reagentes que incorporam compostos biológicos comuns, incluindo tampões, enzimas e ácidos nucleicos.

As imagens microscópicas feita no local picoinjection mostram que a electrificação do fluido picoinjection é suficiente para desencadear a injecção (Figura 2). O volume injectado pode ser controlada por meio da modulação da amplitude da voltagem aplicada, com tensões mais elevadas que permitam a volumes de injecção mais elevadas. Marcamos o volume de injecção contra a magnitude da voltagem aplicada durante três molaridades representativos de fluido de injecção na (Figura 3). Para demons...

Desenvolvemos uma técnica para picoinjecting gotas de microfluidos que não necessitam de eléctrodos metálicos. Como tal, os dispositivos que incorporem a nossa técnica é mais simples de fabricar e de utilizar.

Picoinjection de Microfluidic Drops sem metal Eletrodos

Existing methods for picoinjecting reagents into microfluidic drops require metal electrodes integrated into the microfluidic chip. The integration of ...

O objetivo geral deste procedimento é projetar, fabricar e utilizar chips microfluídicos capazes de injetar com precisão e controle reagentes em gotículas de água em óleo, um processo conhecido como pico-injeção. Isso é alcançado primeiramente projetando um dispositivo com um canal de emulsão que se estreita até um diâmetro menor que o das gotículas esféricas e as espaça uniformemente dentro de um óleo transportador inerte. Como segundo passo, as gotículas de água e óleo são introduzidas no dispositivo e fluem até o local de injeção.Um canal perpendicular contendo os reagentes a serem injetados. Em seguida, uma alta tensão é aplicada ao fluido de injeção enquanto gotículas passam pelo local de injeção, a fim de provocar a fusão entre as gotículas e o fluido de injeção. Os resultados obtidos demonstram que, ajustando a magnitude da tensão aplicada, o volume do reagente injetado pode ser controlado com precisão em resoluções de picolitros. Esta técnica surgiu da necessidade de simplificar a fabricação de nossos dispositivos, eliminando a necessidade de eletrodos metálicos.As vantagens em relação às técnicas existentes, como a facilidade e simplicidade no design, fabricação e uso do d

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