Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

O objetivo geral deste procedimento é aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vias neuronais direcionadas em preparações de fatias in vitro. Isso é feito expressando primeiro o bastonete do canal Dossin nas linhas celulares neuronais de interesse. A segunda etapa do procedimento é fazer preparações agudas das estruturas cerebrais relevantes a serem estudadas.

O próximo passo é registrar as respostas dos neurônios na preparação da fatia em resposta à fotoestimulação do canal, bastonete Dossin expressando fibras. A etapa final é obter imagens da distribuição do canal opsina expressando neurônios e fibras. Em última análise, essa abordagem permite uma avaliação da topografia funcional e das propriedades sinápticas dos circuitos neurais usando fotoestimulação por varredura a laser de componentes neurais optogeneticamente direcionados.

As principais vantagens desta técnica sobre os métodos tradicionais de estimulação elétrica são a capacidade de direcionar e estimular especificamente tipos específicos de células neuronais e examinar suas projeções de longo alcance in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência de sistemas, como a organização funcional de soquetes de guerra complexos. Prepare uma seringa e uma agulha para injetar a solução viral, que contém quatro microgramas por mililitro de poli para melhorar a transfecção.

Em seguida, injete sob pressão 200 nanolitros da solução usando a bomba de seringa, duas a três semanas depois, haverá expressão adequada da fatia de dossina da haste do canal. A preparação deve ser realizada o mais rápido possível Após remover o cérebro injetado, faça um bloco do cérebro na orientação desejada usando uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, fixe a superfície bloqueada do cérebro no estágio de corte usando cola adesiva instantânea.

Em seguida, transfira o estágio para uma câmara de corte vibram refrigerada com freezer e despeje um LCR gelado na câmara de corte. Corte as seções do cérebro usando um vioma em seções de quatro a 500 mícrons de espessura. Transfira as fatias do cérebro para uma câmara de retenção oxigenada e deixe-as incubar a 30 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de prosseguir com o experimento.

Quando estiver pronto para iniciar o experimento, transfira a fatia do cérebro para o estágio do equipamento de registro eletrofisiológico. Registre um neurônio usando técnicas padrão de patch clamp de célula inteira. Posicione brevemente a pipeta de registro pelo neurônio enquanto aplica pressão positiva à pipeta.

Após o contato com a célula, libere a pressão e aplique sucção para formar a vedação giga. Em seguida, aplique uma breve sucção para quebrar a membrana para a configuração de toda a célula e faça gravações nos modos de pinça de tensão ou corrente. Opere o scanner a laser com o software de aquisição de dados de ondas de maré ou EFAs.

O software deve ser calibrado para o fotodiodo antes do uso para controlar a potência do laser. Uma roda de densidade neutra variável é colocada em seu caminho. Girar a roda ajusta a potência do laser medindo no plano focal traseiro.

A potência é normalmente definida entre 25 e D miliwatts. O parâmetro de pulso do obturador controla a duração e o tempo de estimulação no software. Uma imagem da região a ser estimulada pode ser feita a partir da função de captura de vídeo.

Em seguida, defina a grade de estimulação, como uma grade de 16 por 16 com espaçamento de 80 mícrons. Em seguida, sobreponha a grade na imagem adquirida e ajuste as coordenadas XY e o grau de deslocamento para otimizar a orientação para iniciar a estimulação. Ative a função de mapa.

Os dados são retidos e podem ser analisados usando o programa de análise offline no maremoto ou podem ser analisados usando o programa de análise de mapa no software EFAs. Depois de completar os registros fisiológicos na fatia, o padrão de expressão da opsina do canal marcado com YFP pode ser documentado. Primeiro, fixe a fatia durante a noite em 4% de PFA em 0,01 molar PBS a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, transfira a fatia para solução de sacarose a 4% PFA a 30% para proteção criogênica durante a noite. No dia seguinte, corte seções de 50 mícrons da fatia em um criostato. Enxágue as fatias em PBS e monte-as para imagem com um meio antidesbotamento no microscópio confocal.

Depois de encontrar a região de interesse na luz branca, use um comprimento de onda excitatório de 514 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 527 nanômetros. Para a construção viral da imagem YFPA que impulsiona a expressão da haste do canal Dobson, EYFP. Em neurônios glutamatérgicos excitatórios foi injetado no córtex visual primário de um camundongo BSY.

A expressão viral foi encontrada em trilhas entre os córtices visuais primário e secundário, e nas fibras corticotalâmicas do grampo de patch de células inteiras LGN o registro de um neurônio no córtex visual secundário marcado pela estrela revelou e PSCs. Após a fotoestimulação de varredura a laser do canal, bastonete Dossin expressando fibras nas camadas inferiores de V duas projeções cortico talâmicas da camada seis do córtex somatossensorial primário. O núcleo posterior ventral foi estudado usando uma abordagem CRE LAX para expressar a dossina do bastonete do canal na camada seis neurônios cortico talâmicos, e em suas projeções, como esperado, a transfecção por uma construção aa V reunida em um camundongo transgênico CRE resultou na expressão da dosina do bastonete do canal nos neurônios da camada seis alvo e suas fibras se estendendo até a camada quatro.

Bastonete de canal Dobson, a expressão de EYFP também foi observada em fibras que se projetam para registros fisiológicos de VP de um neurônio VP. O uso do patch clamp de células inteiras revelou que as PSCs podem ser provocadas após a fotoestimulação perto do neurônio registrado, que é marcado pela estrela. A análise off-line mostra a amplitude média de resposta à fotoestimulação em VP Fatias resseccionadas de 50 mícrons de neurônios cortico talâmicos da camada seis expressando o canal Rodin EYFP revelaram um padrão fino de fibras marcadas atravessando da camada seis para a camada quatro, onde terminavam e arborizavam extensivamente.

Além disso, fibras corticotalâmicas foram observadas entrando na substância branca e atravessando em direção ao tálamo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar técnicas optogenéticas modernas para estimular vias neuronais direcionadas em preparações de fatias in vitro. Não se esqueça, trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso quando você executa as etapas de calibração associadas a este procedimento.

Use óculos de proteção.