Name: Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a caracterizar circuitos do prosencéfalo usando optogenética e fotoestimulação a laser em preparações de fatias cerebrais in vitro. Este método permite avaliar a topografia funcional e propriedades sinápticas de circuitos neurais.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NIDCD grant R03 DC 011361, SVM CORP grant LAV3202, NSF-LA EPSCoR grant PFUND86 e um grant de publicação da Leica Microsystems (CCL) e NIH/NIDCD grant R01 DC 008794 (SMS).

1. Cirurgia e Injeções
<ol>
	<li>Anestesiar camundongos usando uma injeção intraperitoneal (agulha 22-25 G recomendada) de cetamina (100-120 mg / kg) e xilazina (7,5-16 mg / kg).
	<ol>
		<li>Avalie a sedação usando beliscões fortes nos dedos dos pés até que nenhuma resposta seja obtida. Para todos os procedimentos em animais descritos, modifique para seguir as diretrizes locais da IACUC, conforme necessário.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque os ratos sedados em um dispositivo estereotáxico, prendendo a cabeça e as orelhas em seus respectivos suportes.
	<ol>
		<li>Lubrifique os olhos antes de colocar o animal no dispositivo estereotáxico com uma pomada oftálmica estéril.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raspe o couro cabeludo com uma navalha e esterilize a área com cotonetes Betadine.</li>
	<li>Usando um bisturi, corte uma incisão na linha média e reflita a pele e os músculos subjacentes acima da área a ser injetada.</li>
	<li>Gire uma lâmina de bisturi como uma trefina para realizar uma craniotomia acima da região a ser exposta. Como alternativa, use uma pequena broca presa a uma Dremel para realizar a craniotomia.
	<ol>
		<li>Para realizar a craniotomia, coloque a lâmina do bisturi ou broca na superfície do crânio e gire lentamente até que osso suficiente tenha sido escavado para revelar a pia-máter por baixo.</li>
		<li>Uma vez feita a escavação inicial, amplie a craniotomia usando uma pinça fina para remover cuidadosamente o osso das bordas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Encha uma seringa de 1 μl com a solução viral a injetar (UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>Para aumentar a eficácia da transfecção, prepare a solução viral com 4 μg / ml de polibreno.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abaixe a agulha na área a ser injetada e infunda 200 nl de solução contendo vírus com uma bomba de seringa.
	<ol>
		<li>Deixe a seringa descansar por 10 min antes de retirar a agulha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suturar a pele com Nylon monofilamento inabsorvível e cobrir a incisão com pomada antibiótica.
	<ol>
		<li>As suturas devem ser removidas após 7 a 10 dias.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injete buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para analgesia pós-operatória.</li>
	<li>Permita que os animais se recuperem no pós-operatório por 14-21 dias para permitir a expressão adequada da rodopsina em canal.</li>
</ol>
2. Preparação da fatia
<ol>
	<li>Após o período de recuperação, anestesiar profundamente o animal com anestesia com isoflurano, conforme verificado pela ausência de reflexo de retirada quando a pata traseira e/ou dedos dos pés estiverem firmemente comprimidos.</li>
	<li>Dissecar o cérebro por decapitação seguida de cortes na linha média e frontal no crânio.</li>
	<li>Separe o crânio da linha média para expor o cérebro.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o cérebro usando uma espátula fina para separar os nervos cranianos da base do cérebro.</li>
	<li>Coloque rapidamente o cérebro dissecado em um pequeno béquer de 100 ml contendo líquido cefalorraquidiano artificial gelado e gelado (ACSF; em mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glicose).</li>
	<li>Remova o cérebro do ACSF e coloque em uma lâmina de microscópio coberta com papel de filtro pré-umedecido com ACSF.</li>
	<li>Faça um corte de bloqueio do cérebro na orientação desejada usando uma lâmina de barbear limpa.</li>
	<li>Fixe a superfície bloqueada do cérebro ao estágio de corte usando cola adesiva instantânea.</li>
	<li>Transfira stage para uma câmara de corte vibratome (mantida no freezer até que esteja pronto para o corte).</li>
	<li>Despeje o ACSF gelado na câmara de corte.</li>
	<li>Corte seções cerebrais a 400-500 μm usando um cortador de tecido vibratório.</li>
	<li>Transferir fatias de cérebro para uma câmara de retenção contendo ACSF oxigenado e incubar a 30 °C durante pelo menos 1 hora antes da experiência.</li>
</ol>
3. Registro Fisiológico
<ol>
	<li>Após o período de incubação, transferir uma fatia para uma câmara de registo numa fase microscópica modificada.</li>
	<li>Prenda a fatia no banho durante o experimento usando alguns fios de filamentos de nylon presos a um suporte de fatia de fio de platina.</li>
	<li>Perfunda a fatia com ACSF constantemente.</li>
	<li>Puxe as pipetas de registro para uma resistência de ponta de 3-6 MΩ quando preenchidas com solução intracelular contendo o seguinte (em mM): 127 K-gluconato, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. A solução intracelular deve ter pH 7,3, ajustado com KOH ou ácido glucônico e a osmolalidade de 280-290 mOsm.</li>
	<li>Usando uma configuração padrão de gravação de células inteiras visualizadas, coloque a pipeta de gravação perto do neurônio a ser registrado enquanto aplica pressão positiva22,23.</li>
	<li>Libere a pressão positiva ao aplicar a sucção para formar a vedação Gigaohm.</li>
	<li>Aplique uma breve sucção para quebrar a membrana e formar o registro da configuração de toda a célula.</li>
	<li>Registre as respostas dos neurônios em voltagem ou corrente.</li>
</ol>
4. Fotoestimulação de varredura a laser
<ol>
	<li>Iniciar software e hardware de aquisição de dados, descritos nos relatórios anteriores23-29. 
	Nota: Utilizamos os programas de aquisição Tidelwave25 e, mais recentemente, Ephus26, escritos em Matlab e desenvolvidos pelo laboratório de Karel Svboda em Janelia Farms30. Para uma descrição completa da fotoestimulação por varredura a laser em Ephus, consulte Suter et al.26 e o passo a passo30. 
	Nota: A configuração descrita neste artigo é derivada daquela descrita por Shepherd (2012)23. O feixe de laser é guiado por meio de um sistema de feixe aberto de espelhos para a porta superior do microscópio através da lente objetiva para a fatia (Figura 2).</li>
	<li>Desvie uma pequena parte do laser para um fotodiodo com uma lamínula de microscópio colocada no caminho do laser e use a saída de corrente desse fotodiodo para monitorar a intensidade do laser durante os experimentos.
	<ol>
		<li>Calibre a saída de corrente de fotodiodo registrada no software para a potência do laser medida no plano focal traseiro da objetiva usando um medidor de potência durante a configuração do equipamento23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controle a potência do laser girando uma roda de densidade neutra variável. A potência do laser usada variou entre 25-70 mW (no plano focal posterior) em nossos experimentos.</li>
	<li>Defina a duração e o tempo da estimulação do laser modificando os parâmetros de pulso do laser e do obturador. A estimulação a laser geralmente tem 2 ms de duração.</li>
	<li>Capture a imagem da região a ser estimulada usando a função 'Captar vídeo'.</li>
	<li>Selecione a grade de estimulação de acordo com as dimensões desejadas. Normalmente usamos uma matriz de estimulação de 16 x 16 com espaçamento de 80 μm entre linhas e colunas adjacentes.</li>
	<li>Sobreponha a grade de mapeamento com a imagem adquirida e ajuste o deslocamento x, y e grau para o local e orientação desejados.</li>
	<li>Ative a função 'Mapa' para iniciar a estimulação e aquisição de dados.</li>
	<li>Após a aquisição das respostas evocadas por fotoestimulação, realize a análise dos dados mapeados usando o programa de análise de mapa offline no Tidelwave25 ou o programa 'MapAnalysis' no Ephus26.</li>
</ol>
5. Imagem de fatia fixa
<ol>
	<li>Após as gravações, transfira o fatiamento cerebral para paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS 0,01 M (pH 7,4) durante a noite a 4 ºC.</li>
	<li>Transfira a fatia em sacarose a 30% em PFA 4% / PBS 0,01 M durante a noite a 4 ºC.</li>
	<li>Corte seções de 50 μm usando um criostato e colete em PBS 0,01 M.</li>
	<li>Enxágue as seções em 0.01 M PBS duas vezes em temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte as seções e a lamínula em um meio antidesbotamento apropriado.</li>
	<li>Transfira as seções para o microscópio confocal.</li>
	<li>Concentre-se no ROI usando luz branca.</li>
	<li>Escolha o comprimento de onda, o tamanho da imagem e a repetição para aquisição da imagem. Para YFP, usamos 514 nm (Ex) / 527 nm (Em).</li>
</ol>

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
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</ol>

Os autores declaram não ter interesses conflitantes.
O autor (CCL) recebeu uma bolsa de publicação da Leica Microsystems, que produz um instrumento utilizado nesta filmagem deste protocolo.

O protocolo descrito detalha uma abordagem para a avaliação in vitro da topografia funcional e fisiologia dos circuitos neuronais, que não se limita à investigação dos circuitos do prosencéfalo, ou seja , os do tálamo e do córtex. Várias construções virais para transfecção optogenética foram disponibilizadas para a comunidade científica e podem ser facilmente obtidas no UNC Vector Core. Para obter uma descrição das construções virais prontamente disponíveis, consulte o UNC Vector Core31, a página de recursos de optogenética no Deisseroth Lab da Universidade de Stanford32 e o laboratório de neurobiologia sintética Boyden no MIT33. Variantes dessas opsinas foram desenvolvidas por esses laboratórios e permitem modos abrangentes para controlar a excitabilidade neuronal1,2. A obtenção desses vetores do UNC Vector Core requer um Contrato de Transferência de Material dos laboratórios de origem. Neste protocolo, notamos que a adição de polibreno aumenta a eficácia da transfecção. Além disso, outra variável que influencia a expressão é o período de recuperação pós-cirúrgica, que notamos que um período de pelo menos 14 dias é suficiente para obter uma expressão robusta nas vias do prosencéfalo de camundongos.
Para a transfecção direcionada de grupos neuronais específicos, várias linhagens de camundongos Cre-transgênicos foram desenvolvidas, que podem ser usadas em combinação com construções virais de quadro de leitura aberto invertidas 'floxed' que foram desenvolvidas11. Várias cepas pertinentes à pesquisa em neurociência estão disponíveis nos Centros Regionais de Recursos de Camundongos Mutantes34. Atlas de padrões de expressão de Cre-recombinase nessas linhagens transgênicas são oferecidos por meio do banco de dados GENSAT35. Além disso, o Jackson Labs oferece várias cepas Cre-transgênicas, bem como outras que expressam opsinas constitutivamente em grupos neuronais específicos. Um passo crítico para utilizar essas linhagens de camundongos é levar em consideração o tempo necessário para obter e estabelecer uma colônia de reprodução, que pode variar de acordo com a cepa específica de interesse.
Para a fotoestimulação, utilizamos e adaptamos a configuração desenvolvida pelo Shepherd Lab da Northwestern University, descrita em um protocolo recente29. Embora otimizada para desenjaulamento de glutamato, essa configuração também é passível de fotoestimulação de channelrodopsina sem modificação. Essa configuração permite o controle espacial preciso e o posicionamento dos loci de fotoestimulação, o que permite uma avaliação da topografia funcional da inervação da canalrodopsina dos neurônios registrados. Embora o controle espacial seja aprimorado com esse método de fotoestimulação, ele tem um custo mais proibitivo do que os métodos que utilizam iluminação de campo baseada em LED20. Além disso, a não uniformidade do tecido cerebral é uma limitação da optogenética ou de qualquer técnica que envolva manipulação da luz. Na prática, porém, raramente é um fator, uma vez que os resultados são interpretados principalmente de maneira qualitativa. Caso seja necessária uma comparação mais quantitativa entre as regiões do cérebro, pode-se sempre usar a intensidade máxima da luz para obter respostas "saturadas".
Além disso, usamos os programas de software Tidelwave e Ephus escritos em Matlab para controlar a fotoestimulação de varredura a laser e a aquisição de dados25,26. No entanto, recomenda-se que aqueles que configuram um sistema semelhante empreguem o software Ephus26 mais recente, que tem suporte disponível através do site de desenvolvimento Janelia Farms30. Um passo fundamental é escolher qual desses pacotes de software usar, pois seus requisitos de hardware diferem ligeiramente. Além disso, os programas de análise de mapas são adaptados aos seus respectivos programas de aquisição de dados.
Várias dessas etapas podem ser modificadas para se adequar à configuração específica do médico. As injeções de soluções virais podem ser realizadas com mecanismos de administração além de uma seringa, por exemplo , pipetas de vidro capilar puxadas para diâmetros de ponta de ~ 40 μm também funcionam bem. Para cirurgias, um porta-cabeça não estereotáxico pode ser substituído se essas coordenadas não forem necessárias para guiar as injeções. Além disso, as composições de ACSF e solução intracelular podem ser alteradas dependendo dos requisitos experimentais específicos, por exemplo , substituindo uma solução intracelular de césio ou alto cloreto para isolar correntes inibitórias. Além disso, uma alternativa à imagem dos padrões de expressão em fatias fixas também pode ser feita na fatia viva em um equipamento de imagem adequado com um sistema de perfusão por banho.
Em resumo, este protocolo permitirá ao praticante caracterizar a topografia funcional e a fisiologia sináptica das projeções in vitro, o que pode não ser possível usando métodos padrão, por exemplo, caracterizar projeções de longo alcance que não podem ser preservadas em uma fatia. O protocolo de transfecção descrito pode ser aplicado a experimentos optogenéticos in vivo 1-3,12,14, uma vez que o mecanismo de entrega é o mesmo. Finalmente, embora este protocolo descreva a transfecção de camundongos, muitos dos vetores virais disponíveis podem ser usados para teoricamente transfectar e expressar essas opsinas em uma ampla gama de espécies de mamíferos, permitindo assim uma miríade de estudos comparativos e específicos de espécies1-3.

O elaborado circuito do prosencéfalo dos mamíferos representa um desafio experimental para dissecar os papéis funcionais de seus componentes entrelaçados. Desembaraçar essas relações foi auxiliado recentemente pelo desenvolvimento de métodos optogenéticos para excitar e inibir especificamente populações neuronais e suas projeções1-3. Essas abordagens fazem uso da expressão geneticamente controlada de canais de membrana responsivos à luz4-6. Digno de nota, a canalrodopsina, um canal iônico dependente de luz, despolariza as membranas neuronais após estimulação óptica, levando à excitação do neurônio expressor e suas projeções4,7. Por outro lado, a halorodopina, uma bomba de cloreto dependente de luz, hiperpolariza a membrana, inibindo assim a projeção alvo6,8,9. Várias variantes dessas opsinas foram projetadas, vários vetores produzidos para transfecção e expressão em populações neuronais de interesse e linhagens de camundongos transgênicos projetadas que expressam constitutivamente essas opsinas ou que permitem o controle mediado por cre-lox de sua expressão1,2,10,11.
A utilidade desses métodos e materiais optogenéticos revolucionou a neurociência experimental moderna, permitindo a dissecação do papel de circuitos neurais específicos na fisiologia e no comportamento do organismo12-15. Em particular, esses métodos podem ser fortemente aplicados à dissecção funcional de circuitos cerebrais usando preparações de fatias in vitro 16-20. Nesse contexto, uma das principais vantagens desse método é a capacidade de caracterizar a fisiologia de projeções de longo alcance que são difíceis, senão impossíveis, de preservar em um corte grosso, como as conexões comissurais entre os hemisférios corticais cerebrais16. Além disso, essa tecnologia permite manipulações não possíveis com outros métodos, como a inibição seletiva de projeções com fina precisão temporal usando halorodopsina6,8,9. Além disso, a expressão específica do tipo celular dessas opsinas permite que componentes isolados em um circuito neural sejam estimulados ou inibidos seletivamente1,2,11,15,21. Como tal, essas novas ferramentas optogenéticas permitem a análise sem precedentes das contribuições neuronais para a fisiologia e o comportamento.
Aqui, descrevemos um protocolo para expressar channelrodopsina no cérebro de camundongos usando vetores virais adeno-associados (AAV)1,2. A transfecção específica de populações neuronais alvo pode ser realizada usando este protocolo, com a escolha apropriada de construtos promotores ou camundongos transgênicos que expressam Cre-recombinase nos neurônios alvo de interesse e uma construção viral 'floxed'1,11,15,21 (Figura 1). Como exemplos aqui, examinamos as projeções corticocorticais entre o córtex visual primário (V1) e o córtex visual secundário (V2) e também investigamos a projeção corticotalâmica da camada 6 do córtex somatorsensorial primário (S1) para o núcleo medial ventroposterior (VPm). Combinamos essa expressão específica com a fotoestimulação de varredura a laser in vitro para avaliar a fisiologia sináptica e a topografia funcional. A configuração apresentada aqui permite o posicionamento espacial preciso e o controle dos loci de fotoestimulação. Finalmente, descrevemos a visualização dos padrões de expressão usando microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 32% solução</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV construções virais</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse suporte de cabeça estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Nanocool injetor</td><td>Harvard Aparelho</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>Galvonometers</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>espelhos</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>montagem</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>cabo</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>driver/controlador</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>Obturador - ZM revestido (compatível com UV)</td> <td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de corrente</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713 placa</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 caixa de fuga</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>Cabos National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>National Instruments</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>National</td><td>Instruments</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

O prosencéfalo sensorial é composto de tipos de células intrincadamente conectadas, cujas propriedades funcionais ainda não foram totalmente elucidadas. A compreensão das interações desses circuitos do prosencéfalo foi auxiliada recentemente pelo desenvolvimento de métodos optogenéticos para modulação mediada por luz da atividade neuronal. Aqui, descrevemos um protocolo para examinar a organização funcional dos circuitos do prosencéfalo in vitro usando fotoestimulação de varredura a laser de canalrodopsina, expressa optogeneticamente por meio de transfecção mediada por vírus. Essa abordagem também explora a utilidade da recombinação cre-lox em camundongos transgênicos para direcionar a expressão em tipos específicos de células neuronais. Após a transfecção, os neurônios são registrados fisiologicamente em preparações de fatias usando grampo de remendo de células inteiras para medir suas respostas evocadas à fotoestimulação de varredura a laser de fibras que expressam canalrodopsina. Essa abordagem permite uma avaliação da topografia funcional e das propriedades sinápticas. Os correlatos morfológicos podem ser obtidos por meio de imagens da expressão neuroanatômica das fibras que expressam a channelrodopsina usando microscopia confocal do corte vivo ou tecido pós-fixado. Esses métodos permitem investigações funcionais de circuitos do prosencéfalo que expandem abordagens mais convencionais.

A fotostimulação a laser de projeções entre a área visual primária (V1) e a área visual secundária (V2) em camundongos foi realizada após injeções de pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP em V1 de um camundongo Balb/C (Figura 3). O promotor CaMKIIa nesta construção viral induz a expressão específica da canalrorodopsina-EYFP em neurônios glutamatérgicos excitatórios1,15. Após o preparo de fatias para gravação fisiológica, observou-se a expressão de fibras de canalrorodopsina-EYFP, ou seja, a epifluorescência do EYFP conjugado, atravessando de V1 para V2 (Figura 3A). Além disso, também foram observadas as fibras corticotalâmicas no núcleo geniculado lateral (LGN) (Figura 3A). Registros de grampo de corrente em célula inteira de um neurônio em V2 revelaram correntes excitatórias pós-sinápticas (EPSCs) desencadeadas após a fotostimulação com varredura a laser de fibras expressando canalrorodopsina-EYFP nas camadas inferiores de V2 (Figura 3B).
Em outro exemplo, a fotostimulação com varredura a laser das projeções corticotalâmicas da camada 6 do córtex somatossensorial primário (S1) para o núcleo ventroposterior (VP) foi realizada utilizando este protocolo. Neste caso, utilizamos uma abordagem Cre-Lox para direcionar especificamente a expressão da canalrodpopsina aos neurônios da camada 6 e às projeções corticotalâmicas de interesse. Explicitamente, injetamos pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA no S1 de camundongos B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figuras 1 e 4). Esta linhagem transgênica de camundongos expressa a Cre-recombinase especificamente em neurônios corticotalâmicos da camada 621, resultando, portanto, na expressão de ChR-YFP apenas nesses neurônios após transfeção com o vetor AAV "floxed". Após o preparo dos cortes, fibras de canalrodpopsina-EYFP foram observadas nos neurônios da camada 6 e nas fibras que projetam para a camada 4 e o VP (Figuras 4A e 4B). O registro fisiológico de um neurônio do VPm por meio de grampo de corrente em célula inteira revelou que correntes excitatórias pós-sinápticas (EPSCs) puderam ser elicitadas após a fotostimulação com varredura a laser próxima ao neurônio registrado (Figuras 4C e 4D).
A morfologia das fibras marcadas foi avaliada mais facilmente após os registros fisiológicos. Aqui, ressecionamos preparações em fatias (50 μm) com expressão de canalrodopsina-EYFP em neurônios corticotalâmicos da camada 6 (Figura 5). Isso revelou um padrão fino de fibras marcadas que atravessam da camada 6 até a camada 4, onde terminam e se arborizam extensivamente (Figura 5A). Além disso, observou-se que as fibras corticotalâmicas entravam na substância branca, percorrendo caminho em direção ao tálamo (Figuras 5A e 5B).
<img alt="Diagrama de edição gênica usando Cre-loxP para expressão direcionada de ChR-YFP em modelo de camundongo." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Ilustração esquemática da expressão direcionada de canalrorrodopsina por meio de uma abordagem Cre-Lox. Camundongos transgênicos que expressam a recombinase Cre nas populações neuronais de interesse são injetados com um vírus "floxed" que codifica canalrorrodopsina fundida a uma proteína fluorescente, como a YFP. Após a transfeção, somente os neurônios que expressam a recombinase Cre produzirão canalrorrodopsina-EYFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução</a>.
<img alt="Diagrama de microscopia a laser com óptica a laser, espelho dicróico, câmera CCD e configuração de varredura." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Ilustração esquemática da configuração de fotostimulação. (A) Diagrama da configuração de fotostimulação com varredura a laser. O feixe de laser é conduzido sucessivamente por um sistema de feixe aberto até um obturador e um filtro de densidade neutra (N.D.). Uma lamínula reflete parte do feixe para um fotodiodo conectado a um amplificador para medições de potência do laser. Galvanômetros com espelhos são utilizados para posicionar o feixe de laser por meio de uma lente de varredura, que guia o feixe através de uma porta lateral na parte superior do microscópio. O feixe é então refletido para baixo através da objetiva até a preparação do corte, utilizando um espelho dicróico. Para mais detalhes, consulte Lam e Sherman23 e Shepherd29. (B) Exemplo do padrão de grade de fotostimulação para o experimento representativo mostrado na Figura 3. A grade de estimulação 16 x 16 está sobreposta a uma fotomicrografia da preparação do corte. Uma estrela vermelha indica a localização de um neurônio registrado utilizando o método de patch clamp em célula inteira. A posição do feixe de laser é guiada para cada uma das 256 posições na grade de estimulação por meio do posicionamento computadorizado dos galvanômetros com espelhos. As posições do laser nos 5 primeiros sítios de estimulação são representadas na figura. As respostas do neurônio registrado à fotostimulação em cada um dos sítios são representadas na Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>.
<img alt="Diagrama de mapa de neuroimagem; análise do córtex visual LGN, V1, V2; estudo de conexões neurais." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Fotostimulação com escaneamento a laser de projeções corticocorticais do córtex visual primário (V1) para o córtex visual secundário (V2) no camundongo. (A) Imagem epifluorescente do preparo de fatia mostrando fibras de canalrodopsina-EYFP de V1 para V2 e no núcleo geniculado lateral (LGN). A expressão específica da canalrodopsina-EYFP em neurônios glutamatérgicos excitatórios é induzida por um construto viral contendo o promotor CaMKIIa. (B) Correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs) evocadas em um neurônio de V2 após fotostimulação com escaneamento a laser. A estrela vermelha indica o local de registro. Barras de escala: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução</a>.
<img alt="Diagrama da camada cortical com análise da região VP; mapeia a atividade microelétrica; dados de eletrofisiologia." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Fotostimulação com escaneamento a laser de projeções corticotalâmicas do córtex somatossensorial primário (S1) para o núcleo ventroposterior (VP) no camundongo. (A) Imagem epifluorescente do preparo em fatia mostrando fibras de canalrodopsina-EYFP em S1. (B) Imagem epifluorescente de fibras marcadas no VP. (C) Correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs) evocadas em um neurônio do VP após fotostimulação com escaneamento a laser. (D) Gráfico das EPSCs médias. A estrela vermelha indica o local de registro. Os traçados em destaque em (C) correspondem aos valores em destaque em (D). Barras de escala: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução</a>.
<img alt="Microscopia de fluorescência mostrando estruturas neuronais marcadas com marcadores verdes; diagrama comparativo." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Visualização de neurônios da camada 6 expressando canalrodpopsina-EYFP no córtex somatossensorial primário (S1) do camundongo. (A-B) Neurônios marcados na camada 6 e fibras projetando-se para a camada 4 e a substância branca. Barras de escala: (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução</a>.

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

O objetivo geral deste procedimento é aplicar técnicas optogenéticas modernas para fotoestimular vias neuronais específicas em preparações de fatias in vitro. Isso é realizado primeiramente pela expressão da channelrod Dossin nas linhagens celulares neuronais de interesse. O segundo passo do procedimento consiste em realizar preparações agudas de fatias das estruturas cerebrais relevantes a serem estudadas.O próximo passo é registrar as respostas de neurônios na preparação de fatia em resposta à estimulação fotônica das fibras expressantes do canal rodopsina Dossin. O passo final é obter imagens da distribuição de neurônios e fibras que expressam a canalrodopsina. Em última análise, essa abordagem permite uma avaliação da topografia funcional e das propriedades sinápticas de circuitos neurais por meio da estimulação fotônica com varredura a laser de componentes neurais direcionados optogeneticamente.As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos tradicionais de estimulação elétrica são a capacidade de direcionar e estimular especificamente tipos celulares neuronais particulares e examinar suas projeções de longo alcance in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência de sistemas, como a organização funcional de circuitos neurais complexos. Prepare uma seringa e agulha para injetar a solução viral, que contém quatro microgramas por mililitro de poli para aumentar a transfeção.Em seguida, injete por pressão 200 nanolitros da solução utilizando a bomba de seringa; duas a três semanas depois, haverá expressão adequada do canal rodopsina na fatia de Dossin. O preparo deve ser realizado o mais rapidamente possível. Após remover o cérebro injetado, faça um bloco do cérebro na orientação desejada usando uma lâmina de barbear limpa. A seguir, fixe a superfície bloqueada do cérebro no estágio de corte usando cola adesiva instantânea.Em seguida, transfira a platina para uma câmara de corte refrigerada a freezer e despeje A CSF gelado na câmara de corte. Corte as seções cerebrais utilizando um viome em quatro seções com espessura de 500 mícrons. Transfira as fatias cerebrais para uma câmara de armazenamento oxigenada e deixe incubarem a 30 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de prosseguir com o experimento.Quando estiver pronto para iniciar o experimento, transfira a fatia cerebral para a platina do equipamento de gravação eletrofisiológica. Registre um neurônio utilizando técnicas padrão de patch clamp em célula inteira. Posicione brevemente a pipeta de gravação junto ao neurônio enquanto aplica pressão positiva à pipeta.Após o contato com a célula ser estabelecido, libere a pressão e aplique sucção para formar o selo gigaseal. Em seguida, aplique sucção breve para romper a membrana e obter a configuração de célula inteira, realizando gravações nos modos de clamp de tensão ou de corrente. Opere o escâner a laser com o software de aquisição de dados tidal wave ou EFAs.O software deve ser calibrado de acordo com o fotodiodo antes do uso para controlar a potência do laser. Uma roda de densidade neutra variável é colocada em seu percurso. Girar a roda ajusta a potência do laser mediante medição no plano focal traseiro.A potência é geralmente ajustada entre 25 e D miliwatts. O parâmetro de pulso do obturador controla a duração e o tempo de estimulação no software. Uma imagem da região a ser estimulada pode ser obtida pela função de vídeo instantâneo.Em seguida, configure a grade de estimulação, como uma grade de 16 por 16 com espaçamento de 80 mícrons. Depois, sobreponha a grade à imagem adquirida e ajuste as coordenadas XY e o grau de deslocamento para otimizar a orientação para iniciar a estimulação. Ative a função de mapa.Os dados são mantidos e podem ser analisados usando o programa de análise offline no tidal wave, ou podem ser analisados usando o programa de análise de mapas no software EFAs. Após concluir as gravações fisiológicas no corte, o padrão de expressão da opsina do canal marcada com YFP pode ser documentado. Primeiro, fixe o corte durante a noite em PFA 4% em PBS 0,01 molar a quatro graus Celsius.No dia seguinte, transfira a fatia para uma solução de 30% de sacarose e 4% de PFA para proteção criogênica durante a noite. No dia seguinte, corte secções de 50 mícrons da fatia em um criostato. Lave as fatias em PBS e monte-as para imagem com um meio antidesvanecimento no microscópio confocal.Após identificar a região de interesse em luz branca, utilize um comprimento de onda excitatório de 514 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 527 nanômetros. Para imagens do construto viral YFPA que induz a expressão do canal rod Dobson, EYFP. Em neurônios glutamatérgicos excitatórios foi injetado no córtex visual primário de um camundongo BSY.Verificou-se expressão viral em trajetos entre as cortezas visual primária e secundária, bem como nas fibras corticotalâmicas do LGN. O registro por patch clamp de célula inteira de um neurônio na córtex visual secundária, marcado pela estrela, revelou EPSCs. Após a estimulação fotônica por varredura a laser do canal, fibras expressando canal rodopsina Dossin nas camadas inferiores de V2, projeções corticotalâmicas da camada VI da córtex somatossensorial primária até o núcleo ventral posterior, foram estudadas utilizando uma abordagem CRE LAX para expressar canal rodopsina Dossin em neurônios corticotalâmicos da camada VI e em suas projeções. Conforme esperado, a transfeção por um vetor AAV flockado em um camundongo transgênico CRE resultou em expressão de canal rodopsina Dossin nos neurônios-alvo da camada VI e em suas fibras que se estendem até a camada IV.Canalização com bastão Dobson, a expressão de EYFP também foi observada em fibras que projetam para gravações fisiológicas do VP a partir de um neurônio do VP. Usando o registro de clamp de célula inteira, revelou-se que PSCs poderiam ser elicitadas após estimulação fotônica próxima ao neurônio registrado, o qual é marcado pela estrela. A análise off-line mostra a amplitude média da resposta à estimulação fotônica no VP. Em fatias resecionadas de 50 mícrons de neurônios corticotalâmicos da camada seis que expressam o canal Rodin EYFP, revelou-se um padrão fino de fibras marcadas que atravessam da camada seis até a camada quatro, onde terminam e se arborizam extensivamente.Além disso, foram observadas fibras corticotalâmicas entrando na substância branca e percorrendo em direção ao tálamo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar técnicas modernas de optogenética para fotoestimular vias neuronais específicas em preparações de fatias in vitro. Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso durante a realização dos passos de calibração associados a este procedimento.Use proteção para os olhos.

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