Observando e quantificando compactação de gel de fibrina mediada por fibroblasto

O objetivo geral deste procedimento é observar e analisar o efeito das interações entre células e matriz no realinhamento de fibras e nas atividades de remodelação da matriz em um sistema de gel de fibrina. Isso é realizado primeiramente pela polimerização de um gel tridimensional de fibrina contendo microesferas sobre um lamínula contido em um biorreator com controle ambiental. O segundo passo consiste em preparar uma suspensão celular altamente concentrada, utilizada para posicionar aglomerados de fibroblastos ou explantes X em padrões geométricos sobre a superfície do gel.

Em seguida, a amostra é imageada a cada 15 minutos utilizando microscopia de contraste de interferência diferencial ao longo de 48 horas. O passo final consiste em medir o grau de reorganização e remodelação do fibrina na forma de deformação (strain) a partir de diferentes regiões do gel, utilizando correlação digital de imagens. Em última análise, este sistema de explante permite organizar as células em padrões geométricos simples, o que facilita a visualização e investigação dos mecanismos subjacentes à remodelação da matriz e ao realinhamento de fibras induzidos por células.

Este método pode responder perguntas fundamentais na área da biologia mecânica, como quais são os efeitos de sinais mecânicos espaciais e temporais muito específicos sobre o comportamento celular e as alterações resultantes que eles geram na matriz tecidual circundante. Será demonstrado neste procedimento Arabic de Jesus, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, dissolvendo suavemente o fibrinogênio em solução salina pré-aquecida a 37 graus Celsius durante a noite para criar uma solução estoque de 33,3 miligramas por mililitro. Prepare um molde em perfil para dispor a localização de cada explante x seguindo a geometria e o espaçamento desejados.

Cada ponto com cerca de um a dois milímetros de distância. Essa distância corresponde a um espaçamento ideal para gerar alinhamento de fibras entre explantes. Em seguida, limpe completamente todos os componentes do biorreator com etanol 70% e coloque os componentes limpos sob a luz UV de uma cabine de cultura tecidual por duas a três horas antes da semeadura.

Após a esterilização dos componentes do biorreator, fixe o gabarito sob a região do vidro de cobertura com diâmetro de 60 milímetros onde a amostra será preparada, utilizando fita adesiva. Em seguida, prepare a suspensão de microesferas, seguida pelo fibrinogênio e pela trombina. As soluções estoque combinam 0,017 mililitros da solução estoque de microesferas e 0,149 mililitros de DMEM em um tubo microcentrífuga para obter uma concentração de 10 milhões de esferas por mililitro.

Em seguida, sonique a suspensão por 10 minutos para dispersar as microesferas e homogeneizar a solução. Adicione 0,22 mililitros da solução estoque de fibrinogênio a 0,44 mililitros de tampão heaps 20 milimolar e 0,1667 mililitros da solução de microesferas em um tubo cônico de 15 mililitros. Misture suavemente os componentes e, em seguida, coloque o tubo sobre gelo em um tubo cônico separado de 15 mililitros.

Misturou-se: 32,8 µL de trombina dissolvida em solução salina a 25 unidades por mililitro, 131 µL de tampão HEPES 20 milimolar e 2,46 µL de cloreto de cálcio 2 molar.

Em seguida, misture cuidadosamente as soluções preparadas de trombina e fibrinogênio pipetando para cima e para baixo de cinco a 10 vezes até que a solução esteja uniformemente distribuída. Tente minimizar a introdução de bolhas na mistura, sem descarregar completamente a pipeta durante a mistura. Pipete a solução mista em moldes quadrados de PDMS de oito milímetros sobre lâminas de vidro o mais rápido possível e deixe o gel polimerizar à temperatura ambiente.

A adição de trombina fará com que a solução gеле rapidamente em cerca de 30 segundos após a polimerização. Selle o biorreator e prepare os explantes celulares para iniciar a colheita de células de fibroblastos dérmicos humanos com 70 a 90% de confluência a partir de um frasco T75 usando tripsina e centrifugue-as a 200 × g durante cinco minutos. Transfira o biorreator para uma cabine de segurança biológica e remova cuidadosamente a tampa seguindo condições assépticas. Em seguida, aspire o meio e re-suspenda o pellet celular em uma concentração final de 20 milhões de células por mililitro em DMEM com 10% de SBF.

Em seguida, crie os explantes carregando as células em uma micropipeta e injetando 0,3 microlitros da suspensão celular no gel de fibrina polimerizado. Seguindo o padrão no estêncil, cada explante deve conter aproximadamente 6.000 células. Uma vez que os explantes tenham sido posicionados no gel, feche o biorreator.

Em seguida, insira os blocos aquecedores e conecte os termopares ao controlador de temperatura. Ajuste o controlador de temperatura para 37 graus Celsius e incube os géis por uma hora para permitir que as células sedimentem e se liguem à matriz de fibrina. Então, adicione aproximadamente cinco mililitros de DMEM que foi condicionado por duas a três horas com 5% de dióxido de carbono e suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina-estreptomicina, 0,1% de anfotericina B e 10 microgramas por mililitro de aprotinina diretamente na câmara do biorreator.

Em seguida, feche novamente o biorreator. Use uma seringa para adicionar os cinco mililitros adicionais de meio condicionado com dióxido de carbono através do conector com barbatanas no orifício de entrada, preenchendo completamente o biorreator; remova cuidadosamente todas as bolhas que se formarem. Prepare uma bomba de seringa com uma seringa de 10 mililitros ou 30 mililitros cheia com meio adicional condicionado com 5% de dióxido de carbono. Conecte a seringa diretamente ao orifício de entrada na tampa do biorreator usando tubo estéril com conexão luva luer.

Defina a taxa de perfusão na bomba de seringa como 0,01 mililitros por minuto. Em seguida, conecte peças modificadas de tubo a ambas as saídas e posicione as extremidades em um béquer de 100 mililitros. Para coletar o resíduo, utilize um suporte regulável para ajustar as alturas das entradas e saídas, de modo que não se desenvolva um diferencial de pressão no sistema de alimentação do biorreator.

Adicione meio condicionado com 5% de dióxido de carbono fresco ao biorreator durante todo o experimento. Para manter o pH, fornecer nutrientes e remover produtos residuais, uma seringa de 10 mililitros cheia de meio dura aproximadamente 16 horas. Posicione o objetivo 20 XDIC sob a janela de visualização do microscópio e certifique-se de que o polarizador, o analisador e o prisma estejam todos no lugar.

Em seguida, abra o software de imagem. Foque o objetivo na área entre os três x explan e salve as coordenadas X, Y e Z dessa localização no software de imagem. Para imagens de toda a área entre e ao redor do x explan, selecione a opção de adquirir uma imagem grande e especifique o tamanho da área.

Isso permitirá a aquisição de múltiplas imagens ao redor da área especificada e criará uma imagem ampla em mosaico; defina a intensidade da luz e o tempo de exposição nos valores mais baixos possíveis. Isso ajudará a evitar a morte celular causada pela fototoxicidade, ao mesmo tempo que fornece resolução suficiente para discriminar entre células, microesferas e fibras de fibrina. Observe que, neste experimento específico, as fibras de fibrina não são visíveis devido à alta densidade de microesferas espalhadoras de luz no gel; reduza a densidade de microesferas ou a espessura do gel para observar as fibras de fibrina.

Em seguida, inicie o rastreamento de deformação. Primeiro, crie ou baixe um código personalizado em MATLAB e, em seguida, registre as imagens utilizando microesferas ao longo do gel como pontos de referência. O registro das imagens garantirá que as imagens obtidas sejam adquiridas exatamente no mesmo local a cada vez.

Realizou-se a observação do realinhamento das fibras entre os explantes mediante a aquisição de imagens em mosaico a cada 15 minutos. Ao longo de um período de 48 horas, regiões individuais foram extraídas das imagens em mosaico e analisadas com o algoritmo de rastreamento de deformação. Para medir as deformações locais a partir do deslocamento dos microesferas, os contornos mostram a distribuição da deformação principal máxima na área de realinhamento das fibras correspondente à correia.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente três a quatro horas, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a marcação fluorescente de colágeno e proteínas do citoesqueleto, bem como a quantificação da migração celular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais vias mecanobiológicas estão envolvidas na remodelação tecidual e como esses processos são modulados por diversas substâncias bioquímicas.