Name: Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a avaliar quantitativamente a migração de neutrófilos humanos através de epitélio vesical cultivado em resposta a bactérias uropatogênicas ou quimioatrantes. Este ensaio in vitro fornece insights sobre respostas inflamatórias agudas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios R01-DK080752 e P50-DK064540 do National Institutes of Health (NIH). Agradecemos a J. Loughman por seus esforços em estabelecer este ensaio.

1. Cultura de 5637 células epiteliais da bexiga
Execute as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar preparada com irradiação UV e limpa com etanol a 70%.
<ol>
	<li>Prepare o meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) [denominado RPMI+], esterilize por filtro usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm e aqueça a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Descongelar um criovial de 5637 células (American Type Culture Collection HTB-9; derivado de carcinoma de bexiga) em banho-maria a 37 °C. Transferir rapidamente as células descongeladas para um balão de cultura detecidos 2 de 75 cm contendo 20 ml de RPMI+.</li>
	<li>Incubar o balão a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 até que as células estejam aproximadamente 95% confluentes (~6 x 106 células por frasco), cerca de 4 dias.</li>
	<li>Para subcultivar as 5637 células:
	<ol>
		<li>Retirar o meio do balão. Lave as células com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar 6 ml de tripsina a 0,05% de tripsina morna (37 °C) e solução de EDTA a 0,02% ao balão e incubar a 37 °C com CO2 a 5% durante 15 min.</li>
		<li>Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml e granular por centrifugação a 300 x g durante 5 min. Retirar a solução de tripsina/EDTA.</li>
		<li>Ressuspender as células em 6 ml de RPMI+ (106 células/ml) e transferir 1 ml (106 células) para um novo balão de 75 cm2 contendo 20 ml de RPMI+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Repita a etapa 1.4 para subcultivar células a cada 4 dias ou quando as células atingirem 95% de confluência.</li>
</ol>
2. Semeando e Cultivando 5637 Células em Suportes Permeáveis
Execute as etapas a seguir em uma coifa de cultura de tecidos usando técnica asséptica. Para obter os melhores resultados, use 5637 células que passaram por menos de 10 subculturas.
<ol>
	<li>Usando uma pinça estéril, inverta os suportes permeáveis em uma placa de cultura de tecidos estéreis de 25 mm de profundidade.</li>
	<li>Tripsinizar um balão de 75 cm2 de 5637 células a 95% de confluência, de acordo com os passos 1.4.1-1.4.3.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1.000 μl, ressuspenda suavemente as células em ~ 2 ml de RPMI + a uma concentração de 3 x 106 células / ml, determinada pela contagem de células usando um hemocitômetro.</li>
	<li>Aplique 50 μl da suspensão celular (1,5 x 105 células) em cada suporte permeável sem tocar na membrana. Tampe o prato e coloque-o cuidadosamente a 37 °C com 5% de CO2 por no máximo 16 horas.</li>
	<li>Usando uma pinça estéril, coloque os suportes permeáveis em uma placa de 24 poços contendo 0,6 ml de RPMI+ por poço. Adicionar 0,1 ml de RPMI+ ao reservatório superior de cada suporte permeável. Incubar a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua o meio a cada 2 dias. Primeiro, aspirar o meio do reservatório superior seguido do reservatório inferior e, em seguida, aplicar RPMI+ fresco na ordem inversa, no reservatório inferior (0,6 ml) e depois no reservatório superior (0,1 ml).</li>
	<li>Sete dias após a semeadura dos suportes permeáveis com 5637 células, avaliar a confluência das células. Encha o reservatório superior com RPMI+ (~0,35 ml). As células são suficientemente confluentes quando o meio não se equilibra entre os reservatórios superior e inferior.</li>
</ol>
3. Preparação do Inóculo Bacteriano
<ol>
	<li>Adicionando 20 ml de caldo de cultura adequado a um balão de 250 ml com tampa, utilizando uma técnica asséptica. Use o caldo Luria-Bertani (LB) para culturas de E. coli e adicione antibióticos ao caldo quando apropriado.</li>
	<li>Usando um loop de inoculação estéril, inocule o caldo com bactérias de um estoque de glicerol ou de uma placa de listra. Para cepas UPEC, incubar a cultura bacteriana a 37 °C por aproximadamente 16 horas, sem agitar (para promover a produção de pili tipo 1).</li>
	<li>Transfira a cultura bacteriana para um tubo de centrífuga. Pulverize as bactérias por centrifugação a 8.000 x g por 10 min.</li>
	<li>Decantar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em PBS a OD600 = 1.000, equivalente a ~109 UFC/ml.
	<ol>
		<li>Para gerar um estímulo bacteriano morto pelo calor, incubar uma alíquota (por exemplo, ~ 1,5 x 108 UFC em 150 μl) das bactérias ressuspensas a 55 ° C por 30 min. Coloque uma alíquota da suspensão morta pelo calor para confirmar a morte bacteriana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imediatamente antes do uso, dilua as bactérias ressuspensas (vivas ou mortas pelo calor) 10 vezes para 108 UFC / ml em RPMI sem soro quente [denominado RPMI-] em um tubo de microcentrífuga.</li>
</ol>
4. Isolamento de neutrófilos humanos do sangue periférico
A coleta de sangue de voluntários adultos requer revisão prévia e aprovação de um conselho de revisão institucional. Use equipamento de proteção individual adequado e descarte adequadamente os materiais perigosos para evitar a exposição ao sangue humano.
<ol>
	<li>Aproximadamente 25 ml de sangue venoso de um voluntário adulto saudável devem ser aspirados para 3 tubos estéreis de coleta de sangue contendo heparina sódica por uma equipe treinada em flebotomia.
	<ol>
		<li>Enrole firmemente um torniquete de borracha ao redor do braço, acima do cotovelo.</li>
		<li>Desinfete o local de entrada, a fossa antecubital, usando um lenço estéril com álcool 70%.</li>
		<li>Prenda um suporte de tubo de plástico a um sistema de agulha borboleta alada.</li>
		<li>Insira a agulha em uma veia antecubital em um ângulo de 30° ou menos, chanfrado voltado para cima. A agulha perfurou a veia quando um jato de sangue aparece no tubo de plástico.</li>
		<li>Insira um tubo de coleta de sangue no suporte do tubo de plástico. Quando o primeiro tubo de coleta estiver cheio, substitua pelo segundo tubo de coleta. Repita com o terceiro tubo.</li>
		<li>Quando o terceiro tubo de coleta estiver aproximadamente meio cheio, remova o torniquete.</li>
		<li>Cubra o local da punção com uma bola de algodão estéril e retire lentamente a agulha da veia. Deslize o escudo protetor sobre a agulha e coloque em um recipiente para objetos cortantes de risco biológico.</li>
		<li>Aplique pressão no local da punção. Cubra o local da punção e a bola de algodão com um curativo adesivo.</li>
		<li>Inverta suavemente os tubos de coleta de sangue para dispersar a heparina.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Execute as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos usando técnica asséptica.
<ol start="2">
	<li>Usando uma pipeta de 10 ml, transfira suavemente o sangue para um tubo cônico fresco e estéril de 50 ml. Adicione um volume equivalente de 3% (p / v) de dextrano em 0,9% de NaCl e misture por inversão. Incube o tubo na vertical em temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Sem perturbar a camada inferior, aspirar cuidadosamente a camada superior e transferi-la para um novo tubo cónico de 50 ml. Pulverize as células por centrifugação a 300 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet celular em um volume de 0,9% de NaCl equivalente ao volume inicial de sangue.</li>
	<li>Colocar 10 ml de solução de centrifugação por densidade sob a suspensão celular, preservando a interface entre as duas fases. Centrifugue a 400 x g por 30 min sem freio. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Para lisar os glóbulos vermelhos restantes, ressuspenda o pellet celular em 10 ml de NaCl frio a 0,2%. Incube por 30 segundos e, em seguida, adicione imediatamente 10 ml de NaCl frio a 1,6% para restaurar a isotonicidade.</li>
	<li>Pulverizar as células por centrifugação a 300 x g durante 6 min. Rejeitar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas 4.6-4.7 até que o pellet celular pareça estar livre de glóbulos vermelhos, normalmente 3 rodadas de lise.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1.000 μl, ressuspenda o pellet celular, principalmente PMN, em RPMI- quente (37 ° C) até uma concentração de 107 células / ml, determinada por contagem de células usando um hemocitômetro. Mantenha as células a 37 °C até ao uso. Normalmente, a viabilidade e a pureza do PMN são >99%, conforme avaliado pela exclusão do azul de tripano e visualização da morfologia nuclear após a coloração, respectivamente.</li>
</ol>
5. Ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos
Execute as etapas a seguir em uma coifa de cultura de tecidos usando técnica asséptica. Use apenas suportes permeáveis com camadas de células 5637 confluentes, conforme determinado na etapa 2.7. As placas de 24 poços contendo RPMI- podem ser preparadas com antecedência e mantidas a 37 °C com 5% de CO2 até o uso.
<ol>
	<li>Alíquota de 1 ml de RPMI quente por alvéolo numa placa de 24 poços; preparar 3 alíquotas por suporte permeável.</li>
	<li>Aspirar o meio dos reservatórios superior e inferior dos suportes permeáveis.</li>
	<li>Usando uma pinça estéril, transfira os suportes permeáveis para a placa de 24 poços preparada na etapa 5.1. Lave os suportes permeáveis três vezes, transferindo-os de um poço para outro.</li>
	<li>Se for utilizado um inóculo bacteriano, inverter os suportes permeáveis numa placa de cultura de tecidos estéreis de 25 mm de profundidade. Se um quimioatraente (por exemplo, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) ou IL-8) for usado, prossiga para a etapa 5.6.</li>
	<li>Para experimentos com estímulos bacterianos vivos ou mortos, inocular o lado apical de cada suporte permeável com 60 μl de RPMI- (infecção simulada) ou com o inóculo bacteriano (6 x 106 UFC) preparado na etapa 3.5. Tampe o prato e incube a 37 °C com 5% de CO2 por 1 hora.</li>
	<li>Adicione 0,6 ml de RPMI- por alvéolo a uma placa de baixa fixação de 24 poços; prepare 1 poço por suporte permeável. Prepare 3 alvéolos contendo 0,5 ml de RPMI- para enumerar a entrada de PMN.
	<ol>
		<li>Se um quimioatraente estiver sendo usado no lugar de bactérias, adicione o quimioatraente a 0,6 ml de RPMI- na placa de 24 poços preparada na etapa 5.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Direita os suportes permeáveis na placa de fixação baixa de 24 poços.</li>
	<li>Adicionar 0,1 ml de PMN (106 PMN), preparado no passo 4.9, ao reservatório superior (lado basolateral) de cada suporte permeável. Adicionar 100 μl de PMN directamente aos alvéolos contendo 500 μl de RPMI-. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 1 hora.</li>
	<li>Usando uma pinça estéril, raspe suavemente a membrana do suporte permeável contra a borda do poço para remover o PMN adicional do lado apical e, em seguida, descarte o suporte.</li>
	<li>Colete o PMN raspando suavemente o fundo de cada poço com a ponta da pipeta de 1.000 μl e transfira as suspensões de PMN para tubos de microcentrífugas.</li>
	<li>Enumere o PMN usando um hemocitômetro.</li>
	<li>Para calcular o número total de PMN no reservatório inferior, multiplique o número de PMN em 1 mm2 (100 nl) por 6.000. Os dados podem ser relatados como uma porcentagem do PMN de entrada ou como números de PMN normalizados para 106 PMN de entrada.</li>
</ol>

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+chamber+in+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+migration+of+neutrophils%3A+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li>
<li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li>
<li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li>
<li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li>
<li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li>
<li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Usando uma linhagem de células epiteliais da bexiga cultivada e PMN humano recém-isolado, estabelecemos um modelo in vitro de migração transuroepitelial de neutrófilos. Este modelo tem sido fundamental para começar a dissecar as complexidades da resposta imune inata durante a infecção do trato urinário (ITU), uma infecção bacteriana extremamente comum tipicamente causada por UPEC9. Durante a infecção da bexiga, ou cistite, o recrutamento de PMN para o lúmen da bexiga é essencial para a depuração bacte...

O movimento das células através do corpo, muitas vezes através de longas distâncias, é necessário para o crescimento e desenvolvimento, a cicatrização de feridas, e a resposta imune. A migração celular é complexo e requer coordenação de muitos processos diferentes, incluindo cascatas de sinalização e o rearranjo dos componentes do citoesqueleto. As células podem se mover de forma aleatória (quimiocinese), bem como para gradientes químicos definidos (quimiotaxia). Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para estudar a migração celular in vitro. A técnica mais antiga e mais comum, a câmara de Boyden, que consiste num sistema de duas câmaras verticais, onde uma substância quimioatractiva é colocada na câmara inferior e as células de interesse são colocados na parte superior da câmara 1. O movimento das células através do filtro permeável, com poros de tamanho definido, que separa as duas câmaras é controlada. Outras técnicas têm sido desenvolvidas para investigar a migração de células, incluindo a câmara de Zigmond 2 e a câmara de Dunn3. Estas abordagens coletivas produziram um panorama significativo para o movimento de muitos tipos celulares diferentes. Além interrogar os princípios básicos da quimiocinese e quimiotaxia, ensaios de duas câmaras têm facilitado a investigação da migração de células através de componentes da matriz extracelular e as duas camadas de células endoteliais e epiteliais. Uma vantagem de sistemas de duas câmaras em relação a outras técnicas é que a membrana porosa pode ser revestida com proteínas tais como colagénio ou fibrinogénio, e a migração de células através de uma barreira de matriz extracelular, como pode ser apreciado. Além disso, as linhas de células cultivadas pode ser cultivada e diferenciado sobre os suportes permeáveis. Para investigar o movimento das células através de uma barreira endotelial, células endoteliais cultivadas são semeadas e cultivadas no reservatório superior dos suportes permeáveis. Células móveis, tais como células do sistema imunológico, são adicionados ao reservatório superior e a migração para dentro do reservatório inferior do outro lado da enbarreira endotelial no sentido fisiológico apical-para-basolateral é observada. Este modelo tem sido inestimável na compreensão de extravasamento de células do sistema imunológico para fora da corrente sanguínea. Em contraste com a migração transendotelial, o movimento das células através de uma barreira epitelial ocorre tipicamente no sentido basolateral-para-apical. A fim de modelar estas eventos in vitro, os investigadores sementes e crescer as células epiteliais cultivadas na parte inferior dos suportes permeáveis. Células móveis são adicionados ao reservatório superior e da migração através da barreira epitelial, que representa a direcção basolateral-para-apical, é monitorado. Tais modelos de migração transepitelial têm contribuído significativamente para a nossa compreensão de respostas inflamatórias na superfície das mucosas, principalmente os de pulmão e intestino 4,5. Em contraste, o tráfico de células imunitárias através do epitélio do tracto urinário tem recebido menos atenção. Para reforçar ainda mais a nossa understanding de respostas imune inata no trato urinário durante a infecção com uropatogênica Escherichia coli (UPEC), desenvolvemos um ensaio in vitro, o ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, que permite a investigação de leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) o movimento através de uma barreira epitelial da bexiga 6 -8. Tal como com outros modelos de duas câmaras de migração transepitelial, bexiga células epiteliais humanas cultivadas são crescidas na parte inferior de um suporte permeável e formar camadas epiteliais confluentes. Os neutrófilos humanos, isolados a partir de sangue venoso, são aplicados para o lado basolateral da camada epitelial, e migração através do epitélio na direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante é quantificada em resposta à infecção por diferentes estirpes de E. coli ou a presença de moléculas de quimioatratantes. Muita investigação focou no movimento de neutrófilos, tanto quimiocinese e quimiotaxia, na ausência de tipos de células adicionais. O ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial é vantajosa, uma vez que leva em conta as interações complexas entre as células epiteliais da bexiga e células do sistema imunológico durante a infecção. Este modelo in vitro tratável tem o potencial de permitir a investigação aprofundada das respostas imunitárias em superfícies uroepiteliais.

<table><tbody><tr><td>Inserções Transwell (i.e.&nbsp; suportes permeáveis)</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>6,5 mm, 3 &mu; m poro, inserção de membrana de poliéster</td></tr><tr><td>Tubos de coleta de sangue BD Vacutainer</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>366480</td><td>Tubos de tampa verde de 16 mm x 100 mm x 10 ml contendo heparina sódica</td></tr><tr><td>Conjunto de coleta e infusão de sangue BD Safety-Lok</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>367281</td><td>21 G x 0,75 pol agulha x 12 pol tubo</td></tr><tr><td>BD Vacutainer uso único, suporte não empilhável</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td><td>364815</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4876</td><td>De Leuconostoc mesenteroides</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Solução de centrifugação de densidade PLUS</td> Placas de fixação ultrabaixa <td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3473</td><td>24 poços, fundo</td></tr> <tr><td>plano transparenteN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td>Reconstituído em DMSO para 10 mM</td></tr><tr><td>Humano Recombinante CXCL8/IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td>Reconstituído em PBS para 100 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um cultivadas bexiga epitélio

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

O recrutamento de células do sistema imunológico da periferia para o local da inflamação é um passo essencial na resposta imune inata a qualquer superfície mucosa. Durante a infecção da bexiga urinária, os leucócitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) migram da corrente sanguínea e atravessar o epitélio da bexiga. A incapacidade de resolver a infecção, na ausência de uma resposta neutrofílica demonstra a importância de PMN em defesa da bexiga. Para facilitar a colonização do epitélio da bexiga, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), o agente causador da maioria das infecções do tracto urinário (ITU), atenuar a resposta inflamatória aguda, utilizando uma variedade de mecanismos parcialmente definidas. Para investigar ainda mais a interacção entre o hospedeiro eo agente patogénico bacteriano, foi desenvolvido um modelo in vitro do presente aspecto da resposta imune inata a UPEC. No ensaio de migração de neutrófilos transuroepithelial, uma variação na câmara de Boyden, epith bexiga cultivadasElial células são cultivadas até à confluência na parte inferior de um suporte permeável. PMN são isolados a partir de sangue venoso humano e são aplicados para o lado basolateral das camadas de células epiteliais da bexiga. Migração PMN representando a direcção basolateral-para-apical fisiologicamente relevante, em resposta a uma infecção bacteriana ou moléculas quimioatratantes é enumerada utilizando um hemocitómetro. Este modelo pode ser usado para investigar interacções entre UPEC e células eucarióticas, bem como para interrogar os requisitos moleculares para a passagem do epitélio da bexiga por PMN. O modelo de migração de neutrófilos transuroepithelial irá promover nossa compreensão da resposta inflamatória inicial para UPEC na bexiga.

O ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos permite a avaliação quantitativa da migração de PMNs humanos através de camadas cultivadas de células epiteliais da bexiga em resposta a diversos estímulos (Figura 1B). Embora o protocolo seja simples, existem diversas variáveis que podem influenciar a migração de PMNs e, consequentemente, afetar a reprodutibilidade deste ensaio. Medidas devem ser tomadas durante o preparo dos suportes permeáveis e dos PMNs para reduzir a variabilidade entre réplicas ...

Desenvolvemos um modelo in vitro que mimetiza um componente importante da resposta inflamatória aguda durante a infecção da bexiga por Escherichia coli uropatogênica. O ensaio de migração transuroepitelial de neutrófilos permite a avaliação quantitativa da migração de neutrófilos humanos através do epitélio da bexiga, cultivada em suportes permeáveis, em resposta a infecções bacterianas ou substâncias quimioatraentes.

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar o nível de migração de neutrófilos através de uma barreira epitelial da bexiga durante infecção bacteriana ou em resposta a moléculas quimiotáticas. Isso é realizado primeiramente cultivando células epiteliais da bexiga em suportes permeáveis até atingirem confluência. O segundo passo consiste em infectar as células epiteliais da bexiga com diversas bactérias ou aplicar moléculas quimiotáticas ao reservatório inferior dos suportes permeáveis.Em seguida, os neutrófilos são isolados do sangue venoso e aplicados ao reservatório superior dos suportes permeáveis. O passo final é enumerar o número de neutrófilos no reservatório inferior após uma hora, utilizando um hemocitômetro. Em última análise, o ensaio de migração de neutrófilos através do epitélio urinário é usado para avaliar diferenças na migração de neutrófilos induzidas por diversos estímulos.Embora este método possa fornecer informações sobre aspectos da resposta imune inata durante infecções do trato urinário, ele também pode ser utilizado para investigar outras doenças, incluindo infecções bacterianas que ocorrem em outras superfícies mucosas. Realize este procedimento em uma cabine de cultura de tecidos utilizando técnica asséptica e pinças estéreis. Inverta os suportes permeáveis em uma placa de cultura de tecidos estéril de 25 milímetros de profundidade.Para obter resultados ideais, utilize células epiteliais da bexiga 5 6 3 7 que tenham passado por menos de 10 subculturas com tripsina. Um frasco de 75 centímetros quadrados de células 5 6 3 7 com 95% de confluência, conforme descrito no texto. Usando uma pipeta de 1000 microlitros, ressuspenda suavemente as células em aproximadamente dois mililitros de RPMI acrescido, até uma concentração de 3 milhões de células por mililitro, determinada por contagem celular.Usando um hemocitômetro, aplique 50 microlitros da suspensão celular a cada suporte permeável sem tocar a membrana. Coloque a tampa na placa e posicione cuidadosamente a placa a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por não mais de 16 horas. Usando pinças estéreis.Coloque os suportes permeáveis em uma placa de 24 poços contendo 0,6 mililitros de RPMI mais por poço. Adicione 0,1 mililitro de RPMI mais ao reservatório superior de cada suporte permeável antes de incubar a placa a 37 graus Celsius com 5%CO2. Substitua o meio a cada dois dias aspirando o meio do reservatório superior, seguido pelo reservatório inferior.Em seguida, aplique RPMI fresco na ordem inversa, adicionando 0,6 mililitros ao reservatório inferior e depois 0,1 mililitro ao reservatório superior. Sete dias após o semeador dos suportes permeáveis com células 5 6 3 7. Avalie a confluência das células preenchendo o reservatório superior com 0,35 mililitros de RPMI.Além disso, as células estão suficientemente confluentes quando o meio não se equilibra entre os compartimentos superior e inferior. Prepare o inóculo bacteriano e colete sangue de voluntários adultos conforme descrito no protocolo no texto, em uma cabine de cultura de tecidos. Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir suavemente o sangue para um novo tubo cônico estéril de 50 mililitros.Adicione uma quantidade equivalente de dextrana 3% em cloreto de sódio 0,9%. Incube o tubo em posição vertical à temperatura ambiente por 20 minutos sem perturbar a camada inferior. Aspire cuidadosamente a camada superior e transfira-a para um novo tubo cônico de 50 mililitros.Centrifugue as células a 300 vezes G durante 10 minutos e, após a centrifugação, descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em um volume de cloreto de sódio 0,9% equivalente ao volume inicial de sangue. Em seguida, sobreponha 10 mililitros de solução de centrifugação de densidade sob a suspensão celular.Mantendo a interface entre as duas fases, centrifugue a 400 vezes G durante 30 minutos sem frear antes de descartar o sobrenadante para lisar as células vermelhas do sangue remanescentes. Resuspenda o pellet celular em 10 mililitros de cloreto de sódio a 0,2% frio; após incubação por 30 segundos, adicione imediatamente 10 mililitros de cloreto de sódio a 1,6% frio para restabelecer a isotonicidade. Peliculize as células por centrifugação a 300 vezes G durante seis minutos e descarte o sobrenadante. Repita esses passos até que o pellet celular pareça estar livre de células vermelhas do sangue.Normalmente, três ciclos de lise utilizando uma pipeta de 1000 microlitros resus. Suspender o pellet celular, principalmente leucócitos polimorfonucleares ou PMN, em RPMI sem aquecido até uma concentração de 10 milhões de células por mililitro, conforme determinado pelo contagem celular. Utilizando um hemocitômetro, manter as células a 37 graus Celsius até o uso. Normalmente, a viabilidade e a pureza de pm n são superiores a 99%, conforme avaliado pela exclusão de azul de trian e pela visualização da morfologia nuclear após coloração, respectivamente. Para o ensaio de migração, utilize apenas suportes permeáveis com camadas celulares confluentes de 5 6 3 7.Adicione um mililitro de RPMI morno sem fenol vermelho por poço. Em uma placa de 24 poços, prepare três poços por suporte permeável, aspirando o meio dos reservatórios superior e inferior dos suportes permeáveis utilizando pinças estéreis. Transfira os suportes permeáveis para a placa de 24 poços e lave os suportes permeáveis três vezes, transferindo-os de poço em poço.Se for utilizar um inóculo bacteriano, inverta os suportes permeáveis em uma placa de cultura tecidual estéril de 25 milímetros de profundidade. Para experimentos com estímulos bacterianos vivos ou mortos, inocule o lado apical de cada suporte permeável com 60 microlitros de RPMI para uma infecção simulada ou com o inóculo bacteriano preparado. Coloque a tampa na placa e incube a 37 graus Celsius com 5%CO2 por uma hora.Em seguida, adicione 0,6 mililitros de RPMI sem por poço em uma placa de 24 poços com fundo de baixa adesão, preparando um poço por suporte permeável. Prepare três poços contendo 0,5 mililitros de RPMI sem para enumerar a entrada de PMN.Alternativamente, se um quimioatraente estiver sendo usado no lugar de bactérias, adicione o quimioatraente a 0,6 mililitros de RPMI sem suplementos na placa de 24 poços preparada. O próximo passo para ambos os experimentos é colocar os suportes permeáveis na placa de 24 poços com baixa adesão. Em seguida, adicione 0,1 mililitro dos PMN preparados ao reservatório superior de cada suporte permeável.Adicione 0,1 mililitros de PMN diretamente aos poços contendo 0,5 mililitros de RPMI, menos incubar a 37 graus Celsius com 5%CO2 por uma hora. Usando uma pipeta de 1000 microlitros. Enxágue a parte inferior da membrana do suporte permeável com meio do reservatório inferior usando pinças estéreis, raspando suavemente a membrana contra a borda do poço.Para remover os PMN adicionais do lado apical, colete os PMN raspando suavemente o fundo de cada poço com a ponteira de pipeta de 1000 microlitros e transfira as suspensões de PMN para tubos microcêntrifugos. Conte os PMN utilizando um hemocitômetro para calcular o número total de PMN no reservatório inferior.Multiplique o número de PMN em um milímetro quadrado por 6.000. Os dados podem ser relatados como uma porcentagem dos PMN de entrada ou como números de PMN normalizados a 10 elevado à sexta potência. A aderência dos PMN de entrada ao protocolo descrito neste vídeo, com atenção aos detalhes, permite a enumeração da migração de PMN em resposta a estímulos, incluindo bactérias e substâncias quimiotáticas, infecção com a cepa não patogênica de E. coli MG 1655.MG 1655 morto pelo calor ou um mutante PEC induz significativamente mais migração de PMN do que infecção simulada ou infecção com a linhagem selvagem PEC UTI 89, um isolado de cistite. A adição de quimioatraentes, FMLF ou IL-8, ao reservatório inferior resulta em significativamente mais migração de PMN do que o tratamento simulado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a migração de neutrófilos através de uma barreira epitelial em resposta a estímulos quimiotáticos.

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite...

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

A migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção bacteriana mucosa contribui para lesão epitelial e doença clínica. Foi desenvolvido um modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos e camadas de células epiteliais humanas polarizadas cultivadas em filtros transwell para facilitar investigações para desvendar os mecanismos moleculares que orquestram esse fenômeno.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

Este protocolo gera micromatrizes de biopartículas que fornecem enxame de neutrófilos espacialmente controlados. Ele fornece fácil acesso aos mediadores que os neutrófilos liberam durante a migração e permite análise quantitativa de imagem.

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Aprenda a avaliar quantitativamente a migração de neutrófilos humanos através de epitélio vesical cultivado em resposta a bactérias uropatogênicas ou quimioatrantes. Este ensaio in vitro fornece insights sobre respostas inflamatórias agudas.

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Explorar mais vídeos