Name: Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a avaliar a organização miofibrilar em larvas de Danio rerio usando birrefringência e ensaios de fuga evocada por toque. Essas técnicas não invasivas permitem quantificar defeitos musculares esqueléticos in vivo.

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Agradecemos a Behzad Moghadaszadeh por sua maravilhosa ajuda na quantificação de imagens de birrefringência. Este trabalho foi financiado pela Associação de Distrofia Muscular dos EUA (MDA201302) e pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele (R01 AR044345), bem como pelo apoio generoso da A Foundation Building Strength, Cure CMD e da AUism Charitable Foundation. O VAG é apoiado pelo K01 AR062601 do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele, e o LLS é apoiado pelo F31 NS081928 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame.

1. Análise in vivo da Estrutura Muscular Esquelética por Birrefringência
<ol>
	<li>Prepare gaiolas de acasalamento separando o(s) macho(s) da(s) fêmea(s) da(s) linha(s) de peixe-zebra desejada(s) no final da tarde, após a alimentação.
	<ol>
		<li>Distinguir as fêmeas por sua barriga maior e leve coloração azul/branca, e os machos por sua forma corporal esbelta e tons rosa/amarelo.</li>
		<li>O sucesso com cruzamentos em pares (um macho e uma fêmea) pode ser de apenas cerca de 50%. Para uma maior taxa de sucesso, acasale um macho com 2-3 fêmeas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remova as divisórias da gaiola na manhã seguinte, logo após o início da luz, e deixe os peixes desovarem sem serem perturbados.</li>
	<li>Colete os ovos usando uma peneira quando um número suficiente de ovos fertilizados for colocado no fundo do tanque.</li>
	<li>Transfira os embriões para uma placa de Petri funda, enxaguando a peneira com água de peixe e retorne os peixes pais aos seus tanques. Coloque os pratos de embriões em uma incubadora a 28,5 °C.</li>
	<li>Limpe os ovos e detritos inviáveis mais tarde naquele dia ou na manhã seguinte e devolva os embriões à incubadora para maior crescimento.</li>
	<li>Embriões/larvas atingem a idade apropriada para observar birrefringência em 3-7 dias após a fertilização (dpf), pois os resultados anteriores a 3 dpf podem potencialmente sofrer de contraste limitado. Embriões do tipo selvagem eclodem de seus córions entre 48-60 horas pós-fertilização (hpf), seguido por um endireitamento do eixo do corpo. Embriões selvagens ou mutantes de eclosão tardia podem exigir descorionação manual.
	<ol>
		<li>Delicadamente, faça um rasgo no córion com uma pinça afiada e vire-o de cabeça para baixo para que o embrião caia.</li>
		<li>Permita que os embriões descorionados se endireitem antes de iniciar o ensaio.</li>
		<li>Anestesiar o(s) embrião(ões) com tricaína (0,04% na água dos peixes) para auxiliar no seu correto posicionamento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instale um microscópio de dissecação com uma lente polarizada que possa ser girada para ajustar o ângulo da luz polarizada (Figura 1A).</li>
	<li>Coloque o(s) embrião(ões) descorionado(s) anestesiado(s) diretamente em cima de uma segunda lente polarizada ao longo do eixo lateral do corpo. A segunda lente deve ser posicionada abaixo da lente superior, no estágio do microscópio (Figura 1B). Não use placas de Petri de plástico em nenhum momento durante o ensaio de birrefringência, pois o plástico não é um meio apropriado para a transmissão de luz refratada.</li>
	<li>Gire a lente superior com o embrião de interesse à vista até que os eixos de polarização das duas lentes estejam orientados a 90° um do outro e o fundo fique completamente escuro.</li>
	<li>A saída ideal do ensaio depende da orientação do peixe entre duas lentes polarizadas. Mova o peixe para se certificar de que eles estão deitados o mais plano possível.
	<ol>
		<li>Se o peixe for curvo, apenas os segmentos com essa orientação plana passarão pela luz polarizada e exibirão birrefringência. Nesses casos, medir a birrefringência nas zonas planas e registar a birrefringência da área correspondente nos peixes selvagens (por exemplo, somitos 1-10 tanto nos peixes selvagens como nos mutantes).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observe o fenótipo birrefringente do peixe.
	<ol>
		<li>Peixes selvagens com músculo esquelético altamente organizado apresentam birrefringência brilhante, pois o índice de refração da luz paralela aos miofilamentos é maior do que a luz polarizada perpendicular a essas estruturas.</li>
		<li>Peixes com músculo esquelético desorganizado sugestivo de miopatia não degenerativa ou defeito de desenvolvimento geralmente apresentam uma redução geral na birrefringência.</li>
		<li>Peixes com músculo esquelético desorganizado característico de uma distrofia muscular geralmente exibem um padrão semelhante a uma mancha de birrefringência, com áreas escuras representando degeneração muscular entre áreas brilhantes de arquitetura muscular normal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Quantifique a birrefringência tirando imagens de peixes selvagens e mutantes sob luz polarizada nas mesmas configurações de exposição e ampliação. Salve imagens como arquivos .tiff.
	<ol>
		<li>Abra imagens de birrefringência no software ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Para cada imagem, selecione a área do músculo peixe-zebra desenhando uma linha ao redor do corpo usando a opção "Seleções de polígonos" na barra de ferramentas.</li>
		<li>Use "Definir medidas" no menu suspenso "Analisar" para selecionar as estatísticas necessárias para a imagem.
		<ol>
			<li>A seleção mínima requer que as caixas "Área", "Valor médio de cinza" e "Valor mínimo e máximo de cinza" estejam marcadas.</li>
			<li>Um valor máximo de cinza de >255 indicará saturação de pixels. Portanto, use imagens com valores máximos de cinza inferiores a 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Normalize a intensidade média com a área selecionada e repita este mesmo procedimento de quantificação para cada imagem de birrefringência.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ensaio de comportamento de escape evocado por toque
<ol>
	<li>Estabeleça pares de acasalamento da(s) linha(s) de peixe-zebra apropriada(s) e colete embriões conforme descrito acima nas etapas 1.1-1.5.</li>
	<li>De 2 a 7 dias após a fertilização, coloque embriões/larvas descorionados individualmente em uma placa de Petri profunda ou nas câmaras de placas de vários poços.</li>
	<li>Trabalhando com apenas um embrião de cada vez, centralize o embrião no campo de visão de um estereomicroscópio SMZ1500 Nikon com um sistema de câmera digital SPOT RT3 ou similar e inicie a imagem sequencial.
	<ol>
		<li>A mesma frequência de imagem deve ser usada para peixes selvagens e mutantes. Taxas de quadros >30 Hz são recomendadas, pois taxas mais lentas normalmente não serão suficientes para capturar a natação rápida de peixes do tipo selvagem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Forneça estímulos mecanossensoriais ao embrião tocando a cauda com um alfinete de inseto.</li>
	<li>Pare de fazer imagens quando o embrião parar de nadar ou nadar para fora do campo de visão.</li>
	<li>Converta imagens sequenciais em um arquivo de vídeo ou analise quadros individuais de imagens de lapso de tempo off-line, usando o software SPOT 5.1 Advanced. Pacotes de software semelhantes incluem Open Lab, NIS Elements ou ImageJ disponível gratuitamente (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
	<li>Quantifique o comportamento de natação realizando a resposta evocada ao toque em vários embriões.
	<ol>
		<li>Isso pode ser alcançado calculando a média da distância que os embriões são capazes de nadar dentro de um intervalo de tempo fixo usando um software ou uma régua métrica para marcar os pontos inicial e final da luta de natação.</li>
		<li>Evite que os embriões se habituem ao estímulo do toque ao longo do tempo, realizando o ensaio com um novo embrião para cada repetição experimental. Comportamentos em modelos mutantes confiáveis e de tipo selvagem tendem a ser altamente reprodutíveis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+T+is+essential+for+sarcomere+assembly+in+zebrafish+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle.</a> J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).</li>
<li>Hawkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase-dependent+chaperoning+activity+of+Hsp90a+regulates+thick+filament+formation+and+integration+during+skeletal+muscle+myofibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis.</a> Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).</li>
<li>Barbazuk, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syntenic+relationship+of+the+zebrafish+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes.</a> Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).</li>
<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os distúrbios neuromusculares primários são tradicionalmente classificados como processos distróficos ou não distróficos. As distrofias musculares são caracterizadas pela degeneração das miofibras seguida por repetidas rodadas de regeneração, o que acaba levando a um processo de estágio final tipificado por fibrose e substituição por tecido adiposo14. As miopatias não distróficas, por outro lado, não estão associadas a necrose ou alterações regenerativas, mas resultam em miofibras desorganizadas e fraqueza mus...

<table><tbody><tr><td>Tricaine </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Pino de inseto</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Lentes polarizadas</td><td>Ritz Camera</td><td>Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Fischer </td><td>Incubadora Científica Isotemp Modelo 630D</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Instrumentos de Diagnóstico Inc.</td><td>Software de imagem SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumentos de diagnóstico Inc.</td><td>SPOT 5.1 Avançado</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta particularmente eficaz para modelar doenças humanas que afetam o músculo esquelético, incluindo distrofias musculares1-3, miopatias congênitas4,5 e interrupções na montagem sarcomérica6,7, devido à alta conservação genômica e estrutural com mamíferos8. A desorganização muscular e o comprometimento locomotor podem ser avaliados rapidamente no peixe-zebra nos primeiros dias após a fertilização. Dois ensaios para ajudar a caracterizar defeitos do músculo esquelético em peixe-zebra são birrefringência (estrutural) e resposta de fuga evocada pelo toque (comportamental).
A birrefringência é uma propriedade física na qual a luz é girada à medida que passa pela matéria ordenada, como a matriz pseudocristalina de sarcômeros musculares9. É uma abordagem simples e não invasiva para avaliar a integridade muscular em larvas translúcidas de peixe-zebra no início do desenvolvimento. O peixe-zebra do tipo selvagem com músculo esquelético altamente organizado parece muito brilhante em meio a um fundo escuro quando visualizado entre dois filtros de luz polarizados, enquanto os mutantes musculares têm padrões de birrefringência específicos para o distúrbio muscular primário que modelam. O peixe-zebra modelando distrofias musculares, doenças caracterizadas por degeneração de miofibras seguidas por repetidas rodadas de regeneração, exibem manchas escuras degenerativas no músculo esquelético sob luz polarizada. As miopatias não distróficas não estão associadas a necrose ou alterações regenerativas, mas resultam em miofibras desorganizadas e fraqueza muscular esquelética. O peixe-zebra miopático normalmente mostra uma redução geral na birrefringência, refletindo a desorganização dos sarcômeros.
O ensaio de escape evocado pelo toque envolve a observação do comportamento de natação de um embrião em resposta à estimulação tátil10-12. Em comparação com as larvas do tipo selvagem, as larvas mutantes freqüentemente exibem uma contração de escape fraca, seguida de natação lenta ou outro tipo de movimento prejudicado que não consegue impulsionar as larvas mais do que uma curta distância12. A vantagem desses ensaios é que a progressão da doença no mesmo tipo de peixe pode ser monitorada in vivo por vários dias e que um grande número de peixes pode ser analisado em um curto espaço de tempo em relação aos vertebrados superiores.

A birrefringência pode ser usada como um ensaio eficiente e não invasivo para elucidar o estado da organização dos miófilamentos em embriões vivos de peixe-zebra. São apresentados exemplos de peixes-zebra selvagens, bem como de peixes-zebra com expressão reduzida de genes essenciais para o desenvolvimento e funcionamento do músculo esquelético. Peixes-zebra selvagens com 5 dpf exibem músculos esqueléticos altamente birrefringentes sob luz polarizada, devido à disposição ordenada dos miofilamentos (Figuras 2A-B</s...

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o grau de organização miofibrilar em larvas translúcidas de peixe-zebra e quantificar a distância de natação em resposta à estimulação tátil para ambos os métodos. Isso é realizado primeiramente acasalando os peixes-zebra e, em seguida, coletando ovos viáveis na segunda etapa do ensaio para avaliação da estrutura muscular. Um embrião de peixe-zebra anestesiado e revestido é posicionado diretamente entre duas lentes polarizadas sobre a platina de um microscópio estereoscópico, de modo que o peixe esteja orientado ao longo do eixo lateral do seu corpo e em uma orientação tão plana quanto possível.A birrefringência é então visualizada e a integridade muscular é quantificada. Na segunda etapa do ensaio de fuga evocado pelo toque, uma única larva revestida é colocada em uma placa de Petri profunda e depois centralizada no campo de visão do microscópio estereoscópico. Um estímulo sensorial leve é aplicado às larvas ao tocar a cauda com um alfinete para insetos, e a reação do animal é registrada em imagem até que o embrião pare de nadar ou nade para fora do campo de visão.Por fim, as diferenças na organização muscular e nas respostas locomotoras podem ser quantificadas. As principais vantagens dessas técnicas não invasivas são a análise rápida de um grande número de peixes e o monitoramento in vivo de defeitos no músculo esquelético no mesmo peixe ao longo de vários dias. Demonstrações visuais da montagem de lentes polarizadas e do posicionamento das larvas na orientação adequada são fundamentais para garantir o sucesso.Com esses ensaios, remova os ovos inviáveis de todos os postos coletados de peixes adultos acasalados. Eles geralmente aparecem brancos e opacos a olho nu, ou como um aglomerado de células escuras desorganizadas ao microscópio, e devolva os embriões ao incubador para crescimento adicional entre três e sete dias após a fertilização. Se o embrião de interesse permanecer em seu córion, use um par de pinças finas para fazer cuidadosamente um pequeno rasgo no córion do embrião de interesse e, em seguida, vire-o de cabeça para baixo para que o embrião saia.Anestesie os embriões revestidos com trica para facilitar seu posicionamento correto e, em seguida, adapte um microscópio estereoscópico com uma lente polarizadora que possa ser girada para ajustar o ângulo da luz polarizada. Assim que os embriões se endireitarem, posicione uma segunda lente polarizadora sobre a platina do microscópio diretamente abaixo da lente superior e coloque os embriões diretamente sobre a segunda lente. Cada embrião de interesse deve então ser posicionado ao longo do eixo lateral de seu corpo.Gire a lente superior com o embrião de interesse em vista até que o eixo de polarização das duas lentes esteja orientado a 90 graus um em relação ao outro e o fundo fique completamente escuro. Mova o peixe para garantir que ele esteja deitado o mais plano possível. Se um peixe estiver curvado, apenas os segmentos com orientação plana permitirão a passagem da luz polarizada e exibirão frt.Agora, observe o fenótipo de birrefringência do peixe selvagem. Músculos esqueléticos altamente organizados exibem uma forte birrefringência, pois o índice de refração para a luz paralela aos miofilamentos é maior do que para a luz polarizada perpendicularmente a essas estruturas. Peixes com músculo esquelético desorganizado, sugestivo de uma miopatia neurodegenerativa ou defeito no desenvolvimento, geralmente apresentam uma redução global na birrefringência nos peixes com músculo esquelético desorganizado.Característica da distrofia muscular. Comumente exibem um padrão em manchas de birrefringência, com áreas escuras representando degeneração muscular entre áreas brilhantes de arquitetura muscular normal. Capture imagens do peixe sob luz polarizada para quantificação da birrefringência.Salve as imagens como arquivos tiff. Abra as imagens de birrefringência em um programa de processamento de imagens. Se estiver usando o ImageJ, como mostrado aqui, para cada imagem, primeiro use a ferramenta de seleção poligonal para desenhar uma linha ao redor do corpo do peixe, definindo assim a área do músculo do peixe-zebra para medição.Em seguida, no menu suspenso analisar, escolha definir medidas para selecionar as estatísticas necessárias para a imagem. Marque as caixas de área, valor médio de cinza e valores mínimo e máximo de cinza para configurar o ensaio de comportamento de fuga evocado por toque entre dois e sete dias após a fertilização. Coloque individualmente os peixes revestidos de interesse em placas de Petri profundas, trabalhando com apenas um embrião por vez.Centralize o peixe no campo de visão de um microscópio estereoscópico equipado com um sistema de câmera digital e inicie a aquisição de imagens sequenciais utilizando taxas de quadros superiores ou iguais a 30 hertz. Em seguida, utilizando um alfinete entomológico, toque a cauda do embrião para aplicar o estímulo sensorial mecânico, interrompendo a aquisição quando o embrião cessar a natação ou sair do campo de visão. Por fim, converta as imagens sequenciais em um arquivo de vídeo ou analise os quadros individuais das imagens de lapso de tempo.A birrefringência offline pode ser utilizada como um ensaio não invasivo eficiente para elucidar o estado da organização dos miófilamentos em embriões de peixe-zebra vivos. Peixes-zebra selvagens com cinco dias pós-fertilização exibem músculos esqueléticos altamente organizados sob luz polarizada, devido à disposição ordenada dos seus miofilamentos. Em contraste, embriões de mesma idade homozigóticos para uma mutação patogênica no gene distroglicano ou DAG1 exibem birrefringência irregular, indicativa de áreas de degeneração muscular. Esse padrão irregular e a rápida progressão da degeneração muscular ao longo do início do desenvolvimento são compatíveis com outros modelos de peixes distróficos.A quantificação da birrefringência em mutantes distróficos de DAG1 cinco dias após a fecundação identifica uma redução significativa no brilho para 27,9 ± 5,3% da birrefringência máxima observada em seus irmãos selvagens. Essa redução é mais grave do que a redução para 52,4 ± 5,5% observada em peixes modelos miopáticos com morfina mtm1 três dias após a fecundação. Em vez disso, os modelos de peixe miopático tendem a apresentar uma redução geral na birrefringência em comparação com o tipo selvagem, pois frequentemente há desorganização miofibrilar nos principais músculos esqueléticos axiais, mas sem evidência de alterações degenerativas. Comportamentos de fuga desencadeados por estímulos táteis podem ser utilizados para demonstrar que modelos de peixe-zebra de doenças musculares esqueléticas exibem defeitos locomotores e dificuldades para nadar.Este primeiro vídeo mostra um ensaio de comportamento de fuga evocado por toque em peixes-zebra do tipo selvagem. Observe como, aos cinco dias pós-fertilização, as larvas normais nadam rapidamente para longe. Em resposta ao toque neste segundo vídeo, foi registrado o comportamento de fuga evocado por toque em uma larva dag um.Observe como os embriões mutantes cinco dias após a fertilização apresentam uma resposta prejudicada ao toque e não saem do campo de visão após a estimulação. Os vídeos foram então analisados quadro a quadro para confirmar que mutantes DAG um exibem movimento prejudicado em comparação com os controles do tipo selvagem em resposta a estímulos táteis. As distâncias que ambos os tipos de embriões conseguiram mover dentro de um intervalo de tempo fixo foram médias e indicam uma função motora diminuída em mutantes DAG um.Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser realizadas em grandes quantidades de peixes em um curto período, o que é essencial ao conduzir telas químicas ou de mutagênese de alto rendimento. Após este procedimento, abordagens mais invasivas, como imunohistoquímica ou microscopia eletrônica, podem ser realizadas para investigar defeitos no músculo esquelético nos níveis molecular e estrutural.

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Biologia

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por ensaios de birrefringência e resposta de fuga induzida por toque

Este vídeo descreve o ensaio de resposta de evocação de toque, que mede a resposta da larva do peixe-zebra aos estímulos de toque.

Ensaio de resposta de escape: um método para estudar a resposta de larvas de peixe-zebra a estímulos de toque

O vídeo descreve o ensaio de evitação e tigmotaxia de larvas de peixe-zebra. O vídeo examina o comportamento das larvas de peixe-zebra em resposta ao estímulo visual aversivo.

Ensaio de evitação e timotaxia do peixe-zebra: um método de alto rendimento para examinar o comportamento larval em resposta a estímulos visuais aversivos

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

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Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Apresentamos um método para a análise eletrorretinográfica (ERG) de larvas de peixe-zebra utilizando técnicas de micromanipulação e eletrorretinografia. Este é um método simples e direto para testar a função visual de larvas de peixe-zebra in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra.  Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e a caracterização de um modelo de zebrafish de epilepsia resultante da inibição transitória do gene DEPDC5.

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A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

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Um novo método versátil para a observação da microcirculação é apresentado. Ele é considerado adequado para observação a longo prazo, e para combinação com pharmacophysiological ou molecular intervenções biológicas.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

Aprenda a avaliar a organização miofibrilar em larvas de Danio rerio usando birrefringência e ensaios de fuga evocada por toque. Essas técnicas não invasivas permitem quantificar defeitos musculares esqueléticos in vivo.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

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