Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o grau de organização miofibrilar em larvas translúcidas de peixe-zebra e quantificar a distância de natação em resposta à estimulação tátil para ambos os métodos. Isso é realizado primeiramente acasalando os peixes-zebra e, em seguida, coletando ovos viáveis na segunda etapa do ensaio para avaliação da estrutura muscular. Um embrião de peixe-zebra anestesiado e revestido é posicionado diretamente entre duas lentes polarizadas sobre a platina de um microscópio estereoscópico, de modo que o peixe esteja orientado ao longo do eixo lateral do seu corpo e em uma orientação tão plana quanto possível.

A birrefringência é então visualizada e a integridade muscular é quantificada. Na segunda etapa do ensaio de fuga evocado pelo toque, uma única larva revestida é colocada em uma placa de Petri profunda e depois centralizada no campo de visão do microscópio estereoscópico. Um estímulo sensorial leve é aplicado às larvas ao tocar a cauda com um alfinete para insetos, e a reação do animal é registrada em imagem até que o embrião pare de nadar ou nade para fora do campo de visão.

Por fim, as diferenças na organização muscular e nas respostas locomotoras podem ser quantificadas. As principais vantagens dessas técnicas não invasivas são a análise rápida de um grande número de peixes e o monitoramento in vivo de defeitos no músculo esquelético no mesmo peixe ao longo de vários dias. Demonstrações visuais da montagem de lentes polarizadas e do posicionamento das larvas na orientação adequada são fundamentais para garantir o sucesso.

Com esses ensaios, remova os ovos inviáveis de todos os postos coletados de peixes adultos acasalados. Eles geralmente aparecem brancos e opacos a olho nu, ou como um aglomerado de células escuras desorganizadas ao microscópio, e devolva os embriões ao incubador para crescimento adicional entre três e sete dias após a fertilização. Se o embrião de interesse permanecer em seu córion, use um par de pinças finas para fazer cuidadosamente um pequeno rasgo no córion do embrião de interesse e, em seguida, vire-o de cabeça para baixo para que o embrião saia.

Anestesie os embriões revestidos com trica para facilitar seu posicionamento correto e, em seguida, adapte um microscópio estereoscópico com uma lente polarizadora que possa ser girada para ajustar o ângulo da luz polarizada. Assim que os embriões se endireitarem, posicione uma segunda lente polarizadora sobre a platina do microscópio diretamente abaixo da lente superior e coloque os embriões diretamente sobre a segunda lente. Cada embrião de interesse deve então ser posicionado ao longo do eixo lateral de seu corpo.

Gire a lente superior com o embrião de interesse em vista até que o eixo de polarização das duas lentes esteja orientado a 90 graus um em relação ao outro e o fundo fique completamente escuro. Mova o peixe para garantir que ele esteja deitado o mais plano possível. Se um peixe estiver curvado, apenas os segmentos com orientação plana permitirão a passagem da luz polarizada e exibirão frt.

Agora, observe o fenótipo de birrefringência do peixe selvagem. Músculos esqueléticos altamente organizados exibem uma forte birrefringência, pois o índice de refração para a luz paralela aos miofilamentos é maior do que para a luz polarizada perpendicularmente a essas estruturas. Peixes com músculo esquelético desorganizado, sugestivo de uma miopatia neurodegenerativa ou defeito no desenvolvimento, geralmente apresentam uma redução global na birrefringência nos peixes com músculo esquelético desorganizado.

Característica da distrofia muscular. Comumente exibem um padrão em manchas de birrefringência, com áreas escuras representando degeneração muscular entre áreas brilhantes de arquitetura muscular normal. Capture imagens do peixe sob luz polarizada para quantificação da birrefringência.

Salve as imagens como arquivos tiff. Abra as imagens de birrefringência em um programa de processamento de imagens. Se estiver usando o ImageJ, como mostrado aqui, para cada imagem, primeiro use a ferramenta de seleção poligonal para desenhar uma linha ao redor do corpo do peixe, definindo assim a área do músculo do peixe-zebra para medição.

Em seguida, no menu suspenso analisar, escolha definir medidas para selecionar as estatísticas necessárias para a imagem. Marque as caixas de área, valor médio de cinza e valores mínimo e máximo de cinza para configurar o ensaio de comportamento de fuga evocado por toque entre dois e sete dias após a fertilização. Coloque individualmente os peixes revestidos de interesse em placas de Petri profundas, trabalhando com apenas um embrião por vez.

Centralize o peixe no campo de visão de um microscópio estereoscópico equipado com um sistema de câmera digital e inicie a aquisição de imagens sequenciais utilizando taxas de quadros superiores ou iguais a 30 hertz. Em seguida, utilizando um alfinete entomológico, toque a cauda do embrião para aplicar o estímulo sensorial mecânico, interrompendo a aquisição quando o embrião cessar a natação ou sair do campo de visão. Por fim, converta as imagens sequenciais em um arquivo de vídeo ou analise os quadros individuais das imagens de lapso de tempo.

A birrefringência offline pode ser utilizada como um ensaio não invasivo eficiente para elucidar o estado da organização dos miófilamentos em embriões de peixe-zebra vivos. Peixes-zebra selvagens com cinco dias pós-fertilização exibem músculos esqueléticos altamente organizados sob luz polarizada, devido à disposição ordenada dos seus miofilamentos. Em contraste, embriões de mesma idade homozigóticos para uma mutação patogênica no gene distroglicano ou DAG1 exibem birrefringência irregular, indicativa de áreas de degeneração muscular. Esse padrão irregular e a rápida progressão da degeneração muscular ao longo do início do desenvolvimento são compatíveis com outros modelos de peixes distróficos.

A quantificação da birrefringência em mutantes distróficos de DAG1 cinco dias após a fecundação identifica uma redução significativa no brilho para 27,9 ± 5,3% da birrefringência máxima observada em seus irmãos selvagens. Essa redução é mais grave do que a redução para 52,4 ± 5,5% observada em peixes modelos miopáticos com morfina mtm1 três dias após a fecundação. Em vez disso, os modelos de peixe miopático tendem a apresentar uma redução geral na birrefringência em comparação com o tipo selvagem, pois frequentemente há desorganização miofibrilar nos principais músculos esqueléticos axiais, mas sem evidência de alterações degenerativas. Comportamentos de fuga desencadeados por estímulos táteis podem ser utilizados para demonstrar que modelos de peixe-zebra de doenças musculares esqueléticas exibem defeitos locomotores e dificuldades para nadar.

Este primeiro vídeo mostra um ensaio de comportamento de fuga evocado por toque em peixes-zebra do tipo selvagem. Observe como, aos cinco dias pós-fertilização, as larvas normais nadam rapidamente para longe. Em resposta ao toque neste segundo vídeo, foi registrado o comportamento de fuga evocado por toque em uma larva dag um.

Observe como os embriões mutantes cinco dias após a fertilização apresentam uma resposta prejudicada ao toque e não saem do campo de visão após a estimulação. Os vídeos foram então analisados quadro a quadro para confirmar que mutantes DAG um exibem movimento prejudicado em comparação com os controles do tipo selvagem em resposta a estímulos táteis. As distâncias que ambos os tipos de embriões conseguiram mover dentro de um intervalo de tempo fixo foram médias e indicam uma função motora diminuída em mutantes DAG um.

Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser realizadas em grandes quantidades de peixes em um curto período, o que é essencial ao conduzir telas químicas ou de mutagênese de alto rendimento. Após este procedimento, abordagens mais invasivas, como imunohistoquímica ou microscopia eletrônica, podem ser realizadas para investigar defeitos no músculo esquelético nos níveis molecular e estrutural.