Estique em células cerebrais endoteliais microvasculares (cEnd) como um
26 de outubro de 2013
In vitro estão sendo desenvolvidos modelos de lesões cerebrais traumáticas para reproduzir in vivo deformação cerebral. Estiramento lesão induzida tem sido utilizada para neurónios, astrócitos, células da glia, da aorta e células endoteliais cerebrais. No entanto, nosso sistema utiliza a barreira hemato-encefálica (BBB), modelo que possui propriedades que constituem um modelo legítimo do BBB para estabelecer um modelo TBI vitro.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso da lesão por tração como um modelo de lesão cerebral traumática. Isso é realizado primeiramente cultivando células endoteliais microvasculares em poços com fundos flexíveis. O segundo passo é diferenciar as células pela redução do soro fetal bovino no meio de cultura.
Em seguida, as células são lesionadas utilizando o dispositivo estirador de células. O passo final é avaliar o grau de lesão nas células. Em última análise, a lesão induzida por estiramento em células endoteliais cerebrais é utilizada para demonstrar lesão na barreira hematoencefálica in vitro.
As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de lesão cerebral traumática porque modela o impacto real que ocorre durante a LCT na barreira hematoencefálica, utilizando lesão por estiramento de células endoteliais cerebrais marinhas. O procedimento será demonstrado pela Dra. Elaine Salvador, pós-doutoranda do meu laboratório. Inicie este procedimento cultivando as células endoteliais microvasculares cerebrais marinhas em um frasco de cultura T 75.
Troque o meio duas vezes por semana até atingir a confluência. Em seguida, lave as células com PBS. Depois remova o PBS e a tripsina.
Adicione às células dois mililitros de solução morna de tripsina-EDTA. Incube as células a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que a camada celular esteja dispersa. Em seguida, adicione oito mililitros de meio de cultura às células e agite o frasco várias vezes para destacar as células.
Observe as células ao microscópio para garantir a completa dessanexão do frasco. Em seguida, pipete o meio com as células destacadas para cima e para baixo. Agite o frasco para misturar a suspensão celular posteriormente.
Adicione 20 microlitros da suspensão celular a um hemocitômetro e conte o número de células. Determine a densidade celular e semeie 20.000 células por centímetro quadrado no poço. Em seguida, transfira a suspensão celular para o colágeno.
Uma placa de cultura com fundo flexível pré-codificada com seis poços e volume total de três mililitros por poço. Troque o meio de cultura duas vezes por semana e cultive as células a 37 graus Celsius durante uma semana, até atingirem confluência.
Para a diferenciação celular, troque o meio de cultura das células pelo meio de diferenciação e incube as células a 37 graus Celsius por 24 horas. Neste procedimento, ligue o dispositivo controlador de lesão celular e ajuste o atraso para 50 milissegundos. Em seguida, ajuste a pressão do regulador para 15 PSI e pressione o gatilho algumas vezes até que a pressão máxima registrada se estabilize.
Em seguida, ajuste a pressão do regulador ao valor desejado. Depois disso, coloque a placa de cultura de fundo flexível com seis poços no suporte da bandeja. Certifique-se de que o seletor de poços esteja ajustado ao tamanho correto dos poços.
Em seguida, coloque firmemente o conector adaptador sobre o, segurando bem o conector no lugar com uma mão, enquanto com a outra mão pressiona o gatilho para registrar a pressão máxima gerada. Imediatamente após, devolva a placa ao incubador a 37 graus Celsius pelo tempo desejado, ou utilize imediatamente para experimentos ou avaliações subsequentes para avaliar a lesão por estiramento por meio do ensaio de captação de DI. Imediatamente após o estiramento das células, adicione 30 microlitros de uma solução corante de viabilidade a um miligrama por mililitro, que atua como marcador de citotoxicidade, ao meio de cultura celular.
Para avaliar a lesão por alongamento mediante a liberação de desidrogenase láctica. Após o alongamento, remova imediatamente 200 microlitros do meio de cultura celular do poço, procedendo da mesma forma para cada ponto temporal pós-lesão que desejar incluir na sua investigação da liberação de LDH. Em seguida, centrifugue o meio de cultura celular na velocidade máxima de uma microcentrífuga durante cinco minutos.
Para remover qualquer debris celular, remova o sobrenadante e utilize-o para as etapas subsequentes. Assim que as amostras necessárias de vários pontos de tempo tiverem sido coletadas, lise as células usando a solução de lise incluída no kit de ensaio de LDH. Em seguida, adicione 100 microlitros do meio de ensaio incluído no kit de ensaio a cada poço de uma placa de 96 poços fornecida no kit.
Em seguida, adicione 100 microlitros do meio de cultura celular livre de células em duas cavidades paralelas da placa de 96 poços, incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos e leia a absorbância em 492 nanômetros. É mostrada aqui a análise por microscopia de luz de células normais em comparação com células lesadas.
A monocamada de células normais em confluência não esticada é densamente empacotada e alongada; quando as células são esticadas mediante a aplicação de um pulso de pressão máxima de 1,8 a 2,0 PSI, elas parecem menos compactas. Quando as células são moderadamente lesadas com um pulso de pressão máxima de 2,5 a 3,0 PSI, algumas delas parecem inchadas e deformadas. As células tornam-se retraídas com um estiramento severo de 3,5 a 4,5 PSI.
Aqui está a análise microscópica de fluorescência de células normais em comparação com células lesadas. As células foram tratadas com corante de viabilidade duas horas após a lesão. Estas são as células controle não esticadas, as células moderadamente esticadas e as células severamente esticadas.
Esta figura mostra a liberação do enzima LDH para o snat após lesão por estiramento. A LDH liberada para o meio de cultura foi medida em diversos intervalos de tempo após a lesão induzida por estiramento e foi expressa como uma porcentagem do total de LDH-LDH liberável proveniente de células submetidas a estiramento baixo e moderado. Não diferiu significativamente daquela dos controles não estirados e entre si.
Células que foram severamente esticadas liberaram uma quantidade significativamente maior de LDH em comparação com todas as outras amostras, exceto com a amostra moderadamente esticada em uma hora após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurobiologia explorarem lesão cerebral traumática em células endoteliais cerebrais marinhas in vitro.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para modelar lesão cerebral traumática (TBI) in vitro utilizando lesão por estiramento em células endoteliais cerebrais. O estudo enfatiza a importância de um modelo de barreira hematoencefálica (BBB) para replicar com precisão os efeitos da TBI.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre Lesão Cerebral Traumática
Contexto
- Modelos in vitro são essenciais para estudar os mecanismos do TCE.
- Lesão induzida por estiramento é uma técnica usada para simular o TCE.
- Células endoteliais cerebrais são cruciais para compreender o papel da BHE no TCE.
- Os modelos existentes não possuem fidelidade suficiente para replicar condições in vivo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo in vitro confiável de lesão cerebral traumática utilizando lesão por alongamento.
- Avaliar o impacto da lesão por alongamento em células endoteliais cerebrais.
- Explorar as implicações desse modelo para a terapia da lesão cerebral traumática.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células endoteliais microvasculares cerebrais marinhas.
- Diferenciação celular por meio da redução de soro.
- Aplicação de lesão por estiramento utilizando um dispositivo esticador de células.
- Avaliação da lesão celular por meio de ensaios de viabilidade e liberação de LDH.
Resultados Principais
- A lesão por tração provoca alterações observáveis na morfologia celular.
- A liberação de LDH correlaciona-se com a gravidade da lesão por tração.
- Lesões moderadas e graves por tração apresentam diferenças significativas na viabilidade celular.
- Este modelo permite a exploração dos efeitos do TCE sobre a BHE.
Conclusões
- O modelo desenvolvido simula eficazmente o TCE in vitro.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos do TCE na BHE.
- Essa técnica pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o TCE.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de lesão por alongamento in vitro fornece um sistema escalonável e reprodutível para o estudo dos mecanismos de lesão cerebral traumática na barreira hematoencefálica, permitindo a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de neuroterapêuticos. Ao quantificar as respostas endoteliais ao estresse mecânico controlado, o modelo oferece confiança preditiva na triagem de compostos líderes e na investigação de vias. Sua simplicidade e adaptabilidade facilitam a colaboração multifuncional e a padronização de ensaios em diferentes etapas do processo de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à ruptura da barreira hematoencefálica na lesão cerebral traumática.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da aplicação controlada de lesão por estiramento mecânico.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao modelar respostas endoteliais fisiologicamente relevantes a estímulos associados à LCT.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas dependentes da dose por meio de ensaios de liberação de LDH e de viabilidade celular para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Fornece níveis padronizados e reprodutíveis de lesão entre poços, utilizando pulsos de pressão regulados em placas com fundo flexível.
- Escalabilidade: Permite a avaliação em alto rendimento de compostos direcionados à integridade da barreira hematoencefálica sob condições definidas de estresse mecânico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Modela a fisiopatologia humana relevante da barreira hematoencefálica utilizando células cEND murinas que mimetizam as propriedades da barreira in vivo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as relações dose-resposta entre a intensidade do estiramento e a disfunção endotelial, orientando avaliações pré-clínicas de segurança.
- Confiabilidade Preditiva: Oferece um sistema relevante para a doença para avaliar terapêuticas candidatas quanto à proteção ou reparo da barreira antes de estudos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores, oferecendo uma plataforma com base mecanicista para avaliar a vulnerabilidade da barreira hematoencefálica em contextos de lesão cerebral traumática.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias envolvidas na resposta endotelial a lesões mecânicas, permitindo a redução de riscos dos alvos.
- Triagem: Fornece monocamadas endoteliais padronizadas e prontas para ensaio, com métricas quantificáveis de lesão, para avaliação de compostos.
- Análises: Gera dados quantitativos de liberação de lactato desidrogenase e de viabilidade celular para comparar condições e avaliar os efeitos dos compostos.
- Pesquisa Translacional: Mantém relevância biológica mediante o uso de células endoteliais microvasculares cerebrais que modelam a função da barreira hematoencefálica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e escalonável para avaliação repetida de compostos neuroprotetores ou estabilizadores da barreira.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade nos vínculos mecanicistas entre lesão cerebral traumática e disfunção da barreira hematoencefálica.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da aplicação padronizada de pressão e protocolos definidos de avaliação da lesão.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer uma visão precoce e quantitativa dos efeitos de compostos direcionados à barreira hematoencefálica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base na preservação da integridade da barreira sob estresse relevante para lesão cerebral traumática.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de cultivo de células primárias e diferenciação de células endoteliais.
- Depende do acesso a um dispositivo estirador de células capaz de controle preciso e aplicação uniforme de pressão.
- Necessita padronização dos parâmetros de lesão (pressão, duração) e do cronograma dos ensaios entre diferentes usuários e pontos temporais.
- A adaptação a outros sistemas endoteliais ou de co-cultivo pode exigir validação das propriedades de barreira e da resposta à lesão.
- As limitações práticas incluem a variabilidade no isolamento de células primárias e a necessidade de otimização dos parâmetros de estiramento conforme a fonte celular e o número de passagens.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Seeding of Endothelial Cells and Cell Differentiation
2:50
Stretch-induced Injury of Endothelial Cells
3:46
Assessment of Stretch Injury by Dye Uptake Assay and Lactate Dehydrogenase Release
5:20
Results: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier
6:50
Conclusion
