High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar anticorpos neuronais anti D dois R ou N-M-D-A-R em amostras de pacientes usando um ensaio baseado em células de citometria de fluxo de alto rendimento. Isso é conseguido por subaderência, a sequência completa de CDNA de D dois humanos R ou N-M-D-A-R dentro de um plasmídeo. Como segunda etapa, uma linhagem celular humana é transfectada, o que leva à expressão de antígenos neuronais na superfície celular.

Em seguida, as células transfectadas são incubadas com soro do paciente e um anticorpo secundário apropriado antes da aquisição da citometria de fluxo. Para detectar a ligação de anticorpos a antígenos de superfície celular, os resultados são obtidos com base na análise de citometria de fluxo. Este nosso ensaio baseado em células de citometria de fluxo de três portas é rápido, quantitativo e eficiente para grandes coortes de amostras de pacientes.

Esta é uma vantagem significativa em relação ao uso de um ensaio baseado em células com imunoquímica e análise confocal. Geralmente, os indivíduos novos neste método lutarão com a perda de células ao longo do experimento para adquirir o número apropriado de células no citômetro de fluxo. Tome cuidado para não aspirar as células entre as lavagens.

Selecione um vetor de expressão que seja adequado para a expressão de proteínas transmembranares e permita a co-expressão celular dos antígenos e da proteína fluorescente verde separadamente. Por exemplo, este vetor tem um repórter GFP aprimorado sob o controle de um subclone interno do local de entrada do ribossomo no CD NA humano de comprimento total no vetor usando as enzimas de restrição apropriadas após verificar os clones por sequenciamento, fazer estoques de plasmídeo adequados para uso em cultura de transfecto. O HEK 2 93 células em DMEM completo com 10% de soro bovino fetal.

Colha as células por tripsina após uma lavagem, centrifugue as células e suspenda novamente o pellet celular em dmm completo fresco. Conte as células, depois semeie duas culturas de mililitros em seis placas de poços com cerca de 70% de fluência de Co e atribua os poços de células HEK 2 93 para transfecção com as construções de expressão, bem como o vetor de controle. Mantenha alguns em células HEK 2 93 transfectadas para compensação mais tarde.

Prepare as misturas de transfecção compostas por 200 microlitros de cloreto de sódio a 0,9%, 2,5 microgramas de DNA e quatro microgramas por mililitro de polielina. Imediatamente vórtice por 10 segundos e incube em temperatura ambiente por 10 minutos antes de adicionar a mistura de transfecção a cada poço de dois mililitros de dmm completo fresco. Cubra a placa, enrole as laterais com perfil e centrifugue a 280 GS por cinco minutos para ajudar na transfecção celular.

Em seguida, remova o filme para e coloque a placa em condições de cultura por 18 horas. Substituir os meios de cultura por DM EM completo e mantê-los em cultura durante mais 72 horas. Para separar as células, adicione 500 microlitros de varice a cada poço e incube por aproximadamente cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, ressuspenda as células de cada poço em dois mililitros de 2% FBS em PBS e transfira as células para um tubo cônico após três lavagens. Ressuspenda os paletes de células a 1 milhão de células por mililitro em solução de 2% FBS. Agora projete o modelo de 96 poços para aquisição de citometria de fluxo, de modo que as diferentes linhagens celulares sejam tratadas com cada amostra de paciente ou anticorpo primário.

Em seguida, semeie 50.000 células por poço em uma placa de 96 poços de fundo em V granule as células centrifugando a 450 Gs por cinco minutos. Incline uma placa em ângulo e remova suavemente a supranatina, tomando cuidado para não aspirar o pellet celular. Em seguida, adicione diluição serial do anticorpo primário para avaliar a expressão da superfície do antígeno.

E então amostras de pacientes para detectar anticorpos, incubar as células por uma hora em temperatura ambiente no escuro após três lavagens em 170 microlitros de solução de 2% FBS, adicionar o anticorpo secundário conjugado AF 6 47 apropriado anti-humano IgG para o paciente e anti-US. IgG para anticorpos primários. Hibridizar por uma hora em temperatura ambiente no escuro após três lavagens.

Resus suspende as células em 35 microlitros de solução de 2% FBS para a aquisição de células por citometria de fluxo no citômetro de fluxo. Primeiro configure o amostrador de alto rendimento. Adquira 10.000 eventos por poço de acordo com o modelo de aquisição de citometria de fluxo.

Exporte e analise os dados usando um pacote de software de citometria de fluxo para as células HEK 2 93 ao vivo com base em dispersões internas diretas. Também se baseia em alta positividade de GFP para analisar apenas as células transfectadas. Determine a intensidade média de fluorescência do canal AF 6 47 dentro das células vivas GFP positivas.

Em seguida, exporte os dados para o Excel ou prisma para análise. Representar graficamente as concentrações de anticorpos primários versus o IFM obtido a partir das amostras correspondentes para cada doente e amostra de controlo. Determine o delta MFI Calcule o limiar de positividade do anticorpo adicionando três desvios-padrão acima do delta MFI médio da coorte de controle.

Em seguida, plote as amostras individuais agrupadas de acordo com o grupo de pacientes em um gráfico. Represente o limite como uma linha aqui. As células que expressam o receptor n metil de aspartato ou o receptor de dopamina dois foram adquiridas no citômetro de fluxo usando um amostrador de alto rendimento.

Durante a análise, as células foram fechadas com base no espalhamento frontal para tamanho e no espalhamento lateral para granularidade. As células HK 2 9 3 TRANSFECTADAS expressaram a molécula repórter GFP no citoplasma e as células transfectadas UNT foram excluídas da análise dentro da marcha positiva para GFP. O MFI associado à ligação do anticorpo secundário anti-IgG humano conjugado AF 6 47 foi medido para eliminar a fluorescência de fundo ao analisar soros humanos.

O delta MFI foi calculado subtraindo o MFI de fundo das células de controle. Este ensaio baseado em células de citometria de fluxo é baseado na detecção de anticorpos do antígeno de superfície celular de interesse. Por exemplo, as células a GK 2 93 transfectadas com o plasmídeo de expressão para N-M-D-A-R apresentaram alta expressão da superfície e do receptor de metila.

Da mesma forma, as células transfectadas D dois R expressaram o receptor de dopamina dois, enquanto as células controladas não expressaram nenhum desses antígenos. Este estudo clínico avaliou uma coorte de pacientes com encefalite N-M-D-A-R, uma coorte de pacientes com encefalite associada ao anticorpo D two R e uma coorte controle com outras doenças neurológicas não inflamatórias. Observe que nenhum dos pacientes positivos foi duplamente positivo para anticorpos.

Visando N-M-D-A-R-M-D dois R como esperado. Os anticorpos N-M-D-A-R e D dois R não foram detectados em nenhum dos controles analisados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada corretamente em cinco horas com uma hora de aquisição de fluxo para cerca de 80 amostras Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neuroimunologia descobrirem novos alvos de anticorpos em distúrbios imunomediados.