Name: High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda a detectar anticorpos anti-D2R e anti-NMDA-R em amostras de soro humano usando citometria de fluxo de alta vazão. Este ensaio celular quantitativo melhora o diagnóstico de distúrbios imunomediados neurológicos.

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Este trabalho foi apoiado pelo australiano Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, Fundação Científica Star (Austrália), Síndrome de Tourette Association (EUA), A esclerose múltipla Trish Fundação de Pesquisa e Pesquisa da Esclerose Múltipla Austrália, Fundação Petre (Austrália), a Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Austrália). Agradecemos a todos os pacientes e familiares que forneceram amostras para o nosso estudo.

<html> 1. Subclonagem Estratégia Construir pIRES2-EGFP Vector Codificação D2R ou NMDAR <ol><li> Obter full-length cDNA clone de D2R humano ou NMDAR subunidade 1 (NR1). </li><li> Escolher um vector de expressão, tal como pIRES2-EGFP, o que é adequado para a expressão de proteínas de transmembrana com uma proteína verde fluorescente melhorada (GFP) repórter sob o controlo de um local de entrada de ribossoma interno (IRES), permitindo que ambos os antigénios e GFP para ser co-expressas em células separadamente. </li><li> Subclone cDNA humano dentro pIRES2-EGFP vetor. <ol><li> Para subclonar cDNA, utilizar enzimas de restrição adequadas (por exemplo NheI e XhoI para humano D2R cDNA). </li><li> CDNA corte ligadura inserir dentro restrito vetor pIRES2-EGFP. </li><li> Seqüência ligado pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para verificar se o vetor contém a seqüência correta. </li><li> Purificar e amplificar pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vetor para uso posterior na transfecção. </li></ol></li></ol>itle &quot;&gt; 2. HEK293 transfecção celular para Expressão da Neuronal Antígeno <ol><li> Células de cultura HEK293 em tecidos frascos de cultura com Meio Eagle Modificado fresco por Dulbecco (1x) (DMEM) completo com 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamina e 110 mg / piruvato de sódio L suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), GlutaMAX 2 mM, e 50 ug / ml de gentamicina. </li><li> Retire células HEK293 usando tripsina e transferir para um tubo cônico. <ol><li> Lave as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em meio DMEM completo fresco. </li></ol></li><li> Contar as células e as sementes em placas de 6 poços a cerca de 8 x 10 5 células / poço e cultura durante a noite em DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador. </li><li> Uma vez que eles tenham atingido cerca de 70% de confluência, transfecção as células HEK293 com pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 NMDAR +), pIRES2-EGFP D2R (células HEK293 D2R +) e (células HEK293 CTL, controle vetorial) pIRES2-EGFP como segue.Mantenha algumas células HEK293 untransfected de indemnização mais tarde. <ol><li> Prepare o volume requerido da mistura de transfecção compreende de 2,5 ug de ADN, 200 ul de cloreto de sódio a 0,9% e 4 ug / ml de polietilenimina / poço (contendo cada um 2 ml de DMEM completo fresco). </li><li> Vortex imediatamente a mistura para 10 seg e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos, antes da adição do volume da mistura de transfecção para os poços apropriados. </li><li> Cubra o prato, embrulhe os lados com Parafilm e centrifugar a 280 xg por 5 min para ajudar transfecção celular. </li><li> Remover o Parafilm e depois colocar na incubadora a cultura a 37 ° C. </li><li> Substitua os meios de cultura de 18 horas depois, com DMEM completo fresco e manter em cultura por outra 72 horas. </li><li> Opcional: 72 horas pós-transfecção, as células transfectadas podem ser seleccionadas por cultura em meio DMEM completo suplementado com 250 ug / ml de geneticina, de modo a obter um policlonal transfectante estável. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Citometria de Fluxo Ensaio Celular para Detecção de Anticorpos para Antígenos de Superfície Neuronal <ol><li> Separar HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e células HEK293 CTL por incubação com 500 ul / poço Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C. <ol><li> Ressuspender em 2ml/well de PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) suplementado com 2% de FBS (PBS / FBS) e transferência para a 15 ml ou 50 ml de tubo cónica. </li><li> Lavar as células por centrifugação a 250 xg durante 6 minutos e ressuspender o sedimento de células em 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavagem 2x. </li><li> Contar as células e em seguida ressuspender em PBS / FBS a 1 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> Conceber o molde de 96 cavidades para a aquisição de citometria de fluxo, uma vez que as células HEK293 D2R + ou HEK293 NMDAR +, bem como células HEK293 CTL terá de ser incubada com cada amostra de doente ou anticorpo primário. </li><li> Células de sementes em uma placa de 96 poços de fundo em V a 50.000 células / nósll acordo com a citometria de fluxo modelo de aquisição. </li><li> Agregar as células por centrifugação a placa de 96 poços a 450 g durante 5 min e suavemente remover o sobrenadante utilizando uma pipeta multi-canal electrónico ou manual, inclinando a placa sobre um ângulo e tendo cuidado para não aspirar o sedimento celular. </li><li> Incubar HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, e células HEK293 CTL durante 1 h à TA no escuro, com: <ol><li> Diluições em série de anticorpo primário, a fim de avaliar a expressão do antigénio de superfície. </li><li> As amostras dos pacientes, a fim de detectar anticorpos. </li></ol></li><li> Use fluxo apropriado citometria controles de compensação, por exemplo. células HEK293 não transf ectadas não coradas, GFP + células HEK293 (AF647 -), e AF647 + células HEK293 não transf ectadas (GFP). </li><li> Lavar as células por centrifugação a 450 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento de células em 170 ul de PBS / FBS. Repita o passo de lavagem mais duas vezes. </li><li> Incubar as células durante 1 hr à TA no escuro, com uma diluição de 1:100 de anticorpo secundário conjugado com AF647 (IgG anti-humano para o soro do paciente e anti-IgG de ratinho a anticorpos primários anti-NR1 ou anti-D2R). </li><li> Lave as células três vezes, tal como no passo 3.7, e voltar a suspender em 35 ul de PBS / FBS por citometria de fluxo de células de aquisição. </li><li> Configure o amostrador de alto rendimento (HTS) no citômetro de fluxo (BDLSRII). </li><li> Adquirir 10.000 eventos / poço de acordo com o modelo de aquisição de citometria de fluxo. </li><li> Export e, em seguida, analisar os dados para a análise usando uma citometria de fluxo de pacotes de software, como FlowJo v7.5: <ol><li> Primeiro, porta as células HEK293 vivos, com base para a frente (tamanho) e lateral (granularidade), espalha. </li><li> Além disso portão células HEK293 ao vivo com base na alta GFP-positividade para analisar apenas as células transfectadas. </li><li> Determinar a intensidade média de fluorescência (MFI) do canal AF647 nas células GFP positivas vivas. </li><li> Exportar dados para o Excel ou prisma de análise: <ol><li> Lote concentrations de anticorpo primário (anti-NMDAR ou anticorpo anti-D2R) versus o MFI obtido a partir das células incubadas com estes anticorpos. </li><li> Para cada amostra de doente e de controlo, determinar o ΔMFI subtraindo o MFI das células HEK293 CTL do MFI do células HEK293 NMDAR + HEK293 D2R + ou, respectivamente. </li><li> Calcular o limiar de positividade por adição de três desvios padrão acima da média ΔMFI do grupo de controlo. </li><li> Amostras individuais de plotagem agrupados de acordo com seu tipo de soro em um gráfico e representam o limite como uma linha. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+GABA%28B%29+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures%3A+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich%2C+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis%2C+Morvan%E2%80%99s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li>
<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li>
<li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
<li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li>
<li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides%3A+clues+for+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li>
<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
<li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li>
<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

Conflito de interesse: A patente foi arquivada por FB e RCD (Universidade de Sydney) alegando D2R como alvo para auto-anticorpos.

Este artigo descreve uma nova aplicação da citometria de fluxo ensaio baseado em células vivas para detectar anticorpos que visam as proteínas neuronais específicos na superfície celular utilizando um amostrador de alto rendimento. Usando esta técnica, informamos que um subgrupo de pacientes afetados com doenças auto-imunes do sistema nervoso central têm anticorpos séricos para a superfície ou à superfície NMDAR D2R. Passos essenciais para a detecção de anticorpo óptima utilizando este fluxo...

Nos últimos anos, as formas auto-imunes do sistema nervoso central, doenças (CNS) tem sido identificado. Tem sido demonstrado que estas doenças estão associadas e definida pela presença de auto-anticorpos. Estes anticorpos ligam-se a receptores neuronais ou proteínas sinápticas envolvidas na neurotransmissão 1,2. Antigénios diferentes foram detectados, tal como o receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, receptor γ-aminobutírico, o B (GABA B) do receptor 6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolopropiónico (AMPA) receptor 7, canal de potássio voltagem-dependentes (CPVD) proteínas associadas: leucina-rico uma proteína ativada por glioma (LGL-1) e associada à contactina proteína 2 (capsr2) receptor 8,9, glutamato 5,10 , e a dopamina-2 receptor (D2R) 11. No passado, estas desordens auto-imunes do sistema nervoso central (principalmente chamados encefalite) eram frequentemente não diagnosticada e não tratada. Estes biomarcadores de anticorpos novela, por exemplo,Anticorpo NMDAR ou anticorpo D2R, melhoraram substancialmente o diagnóstico e consciência, e abriram as opções de tratamento para os pacientes. Na verdade, o tratamento precoce com immunotherapies se associa à melhora resultado 11,12. Os métodos tradicionais para a detecção de anticorpos, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) e Western blot foram utilizados para a detecção de anticorpos no soro. No entanto, eles não são facilmente permitir o reconhecimento de epitopos extracelulares ou de superfície e, em vez disso, pode revelar imunorreactividade contra o epitopo intracelular. Além disso, os anticorpos que se ligam ao domínio extracelular de proteínas importantes envolvidas na neurotransmissão são susceptíveis de ser 2,3,7,13,14 patogénico. Portanto, o desenvolvimento de ensaios precisos e sensíveis para descobrir superfície celular relevante ou alvos de anticorpos extracelulares em pacientes é fundamental. O método padrão de ouro no domínio baseia-se na utilização de células vivas, em chamada &quot;célula-baensaios sed &quot;. Este método envolve a expressão de um antigénio na superfície de células de mamíferos (mais frequentemente nos rins (293) células embrionárias humanas HEK293) na sua forma nativa por transfecção de vectores contendo a sequência de cDNA completa do antigénio de interesse. Nonpermeabilized células vivas são então incubadas com o soro diluído do paciente e seguido por fluorocromo-conjugados com anti-imunoglobulina humana (Ig), o anticorpo secundário. A intensidade ou o nível de fluorescência é detectada e é associado ao nível de ligação de auto-anticorpos. Esta técnica é específica, uma vez que apenas um antígeno é sobre-expresso em células. O mais usado &quot;read-out&quot; tem sido a análise de microscopia confocal após imunocitoquímica 4,5,8-10. No entanto, a citometria de fluxo ensaios baseados em células têm sido usados ​​com sucesso para detectar anticorpos em pacientes com doenças desmielinizantes 15-17. Em particular, 15 Waters et al. Comparado a detecção do anticorpo usando uma panelael das técnicas de detecção de anticorpos, incluindo ensaios com células seguidas por microscopia ou citometria de fluxo analisa e mostrou citometria de fluxo ensaio baseado em célula a ser o método mais sensível, preciso e confiável. Portanto, citometria de fluxo ensaio baseado em células é vantajoso, pois é quantitativa, não dependente de investigador, e não envolve qualquer uso de material radioativo. Também é conveniente, uma vez que permite que grandes grupos de pacientes a serem ensaiadas em um curto espaço de tempo. Mais recentemente, temos um fluxo otimizado de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células para detectar anticorpos NMDAR e D2R anticorpo em pacientes com doenças auto-imunes do SNC 11. O nosso grupo detectados recentemente nos soros de anticorpos NMDAR paciente utilizando citometria de fluxo de ensaio de base celular. Estes soros de anticorpos positivos NMDAR foram previamente analisados ​​por meio de microscopia confocal e também foram encontrados para ser positivo 11. Este protocolo descreve uma citometria de fluxo de ensaio à base de células para a detecção de canticorpo CNS onformation sensível no soro do paciente, utilizando um amostrador automático de alto rendimento.

<table><tbody>cDNA Missouri S& do receptor humano da HA-dopamina-2 de <tr><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td>do <td>vetor de pIRES2-EGFP</td></tr><tr><td>(D2R)</td><td> T Centro de Recursos de cDNA</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>Subunidade Humana 1 do NMDAR (NR1) cDNA</td><td></td><td></td><td>Presente do Prof A. Vincent&nbsp; (Oxford, Reino Unido)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NR1 humano de camundongo purificado monoclonal (clone: 54.1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-DRD2 monoclonal purificado de camundongo (clone: 1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 burro anti-mouse IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 cabra anti-humano IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (1x) 4,5 g/L D-glicose, L-Glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) com Fenol Vermelho</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloreto de sódio</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr> Kit de <tr><td>Purificação PCR Roche</td><td></td> 10885843001 <td></td> PureLink Invitrogen K3100-01 <td></td></tr><tr><td>JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> T4 DNA Ligase Roche <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>10481220001</tr><tr><td>Plasmídeo&nbsp; Mais&nbsp; Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome do Equipamento/Software Número de</td><td>Catálogo</td><td>da Empresa</td><td>Modelo/Versão</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo com sistema de amostragem de alto rendimento</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII com HTS</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td></td><td>CKX41 (com lâmpada de mercúrio e fonte de alimentação U-RFLT50)</td></tr><tr><td>Pipeta eletrônica multicanal (15-300 &mu; l)</td> <td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12 canais Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de polipropileno de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 poços placa</td><td>Corning</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

high-throughput citometria de fluxo ensaio celular para detectar anticorpos em n-metil-d-aspartato ou dopamina-2 receptor em soro humano

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Ao longo dos últimos anos, os anticorpos contra a superfície de conformação e proteínas envolvidas na neurotransmissão foram detectados em doenças auto-imunes do sistema nervoso central em crianças e adultos. Estes anticorpos têm sido usados ​​para ajudar no diagnóstico e tratamento. Os ensaios baseados em células têm melhorado a detecção de anticorpos no soro do paciente. Eles baseiam-se na expressão de antigénios de superfície do cérebro em células eucarióticas, que são, em seguida, incubadas com soro de paciente diluído seguido de anticorpos secundários conjugados com fluorocromo. Após a lavagem, o anticorpo secundário de ligação é então analisada por citometria de fluxo. O nosso grupo desenvolveu um fluxo de alto rendimento citometria de ensaio baseado em células vivas para detectar com fiabilidade os anticorpos contra receptores de neurotransmissores específicos. Este método de citometria de fluxo é para a frente, quantitativa, eficiente, e a utilização de um sistema de amostragem de alto rendimento permite grandes grupos de pacientes para ser facilmente testada num curto espaço de tempo. Além disso, esta célula baseada em quantodizer pode ser facilmente adaptado para a detecção de anticorpos para vários alvos antigénicos diferentes, tanto do sistema nervoso central e na periferia. Descobrindo biomarcadores romance anticorpos adicionais permitirá o diagnóstico rápido e preciso e melhorar o tratamento de doenças imunomediadas.

Células vivas HEK293 D2R + e HEK293 CTL foram adquiridas no citômetro de fluxo utilizando um amostrador de alto rendimento. Durante a análise, as células foram fechado com base na dispersão para a frente (tamanho) e (granularidade) parâmetros (Figuras 1A e 1D) dispersão lateral. Células HEK293 transfectadas expressa a molécula repórter, a GFP, no citoplasma, e as células não transfectadas foram excluídos da análise (Figuras 1B e 1E).</stron...

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar anticorpos neurais anti D2R ou NMDAR em amostras de pacientes utilizando um ensaio celular baseado em citometria de fluxo de alto rendimento. Isso é alcançado subclonando a sequência completa de cDNA do D2R humano ou do NMDAR em um plasmídeo. Como segundo passo, uma linhagem celular humana é transfectada, o que leva à expressão na superfície celular dos antígenos neurais.Em seguida, as células transfectadas são incubadas com soro de paciente e um anticorpo secundário apropriado antes da aquisição por citometria de fluxo. Para detectar a ligação de anticorpos a antígenos de superfície celular, os resultados são obtidos com base na análise de citometria de fluxo. Este nosso ensaio celular baseado em citometria de fluxo com alta capacidade e três canais é rápido, quantitativo e eficiente para grandes coortes de amostras de pacientes.Essa é uma vantagem significativa em comparação com o uso de um ensaio baseado em células com imunocitoquímica e análise confocal. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades com a perda de células ao longo do experimento para obter o número apropriado de células no citômetro de fluxo

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Este vídeo descreve uma técnica de imunoensaio usando esferas magnéticas fluorescentes ou microesferas acopladas a diferentes antígenos para detectar simultaneamente vários isotipos de anticorpos em uma amostra de soro. O ensaio é útil para entender a soroconversão durante uma infecção ou pós-vacinação.

Ensaio de Imunoesferas Multianalita: Uma Técnica de Imunoensaio Baseada em Fluxo para Detecção Simultânea de Vários Subtipos de Anticorpos em Amostra de Soro Humano

Este vídeo demonstra uma técnica para identificar anticorpos contra antígenos específicos em uma amostra usando uma cultura neuronal do hipocampo de rato. Ao expor neurônios cultivados a amostras de pacientes contendo autoanticorpos direcionados aos receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs), a presença de autoanticorpos ligados à superfície neuronal é revelada por meio de imunocoloração.

Um ensaio para detectar autoanticorpos em soro humano usando uma cultura neuronal do hipocampo

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.

Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

Ectopically manifestámos NR1 subunidade do receptor NMDA marcado com proteína verde fluorescente em células embrionárias humanas (HEK293) como antígeno para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes suspeitado com encefalite auto-imune. Este método simples pode ser adequado para fins em situações clínicas de triagem.

Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

Aqui nós apresentamos um método de citometria de fluxo baseados em células para detectar anticorpos neutralizantes ou outros fatores que interferem com a absorção celular de terapias de substituição enzimática em uma matriz humana, tais como fluido espinal cerebral (CSF) ou soro humano.

Anticorpos que neutralizam a absorção celular de terapias de substituição enzimática com um ensaio de baseada em célula de

O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Descrevemos uma plataforma de imunoensaio recentemente desenvolvida com base nos princípios da biologia sintética livre de células e na técnica de dot-blot para detecção personalizável da resposta de anticorpos em soros humanos e animais.

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

Aprenda a detectar anticorpos anti-D2R e anti-NMDA-R em amostras de soro humano usando citometria de fluxo de alta vazão. Este ensaio celular quantitativo melhora o diagnóstico de distúrbios imunomediados neurológicos.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano (Vídeo) | JoVE Journal

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

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