Name: In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a imaginar complexos virais em líquido com microscopia eletrônica de transmissão in situ. Este método utiliza microchips de nitreto de silício com superfícies de captura por afinidade para observar dinâmicas de partículas de rotavírus em resolução nanométrica.

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Os autores reconhecem o Dr. Michael J. Friedlander, Diretor do Instituto de Pesquisa Virginia Tech Carilion por incentivar nossos esforços de pesquisa. Este projeto foi apoiado por fundos de desenvolvimento para S.M.M e D.F.K. e, em parte, pela iniciativa Nano-Bio do Institute for Critical Technology and Applied Science da Virginia Tech.

1. Prepare os dispositivos de captura de afinidade16
<ol><li>Limpe o nitreto de silício E-chips incubando-os em 15 ml de acetona por 2 min seguido por 15 ml de metanol por 2 min(Figura 1A). Deixe os chips secarem sob o fluxo de ar laminar.</li>
	<li>Incubar os chips secos em uma placa de agitação aquecida (sem mexer) durante 1,5 h a 150 °C, em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Use seringas Hamilton para compor misturas lipídicas em pequenos tubos de vidro para conter 25% de clorofórmio, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocolina) em clorofórmio (1 mg/ml) e lipídio ni-NTA de 20% (1,2-dioleoyl-iminodiacético ácido-succinyl-sal) em clorofórmio (1 mg/ml) para um volume total de 40 μl.</li>
	<li>Aplique uma alíquota de 1 μl da mistura sobre cada gota de 15 μl de água Milli-Q em um pedaço de Parafilm em uma placa de Petri úmida(Figura 1B). Incubar amostras no gelo por pelo menos 60 minutos.</li>
</ol>2. Capturar macromoléculas17
<ol><li>Coloque um E-chip com um espaçador integrado de 150 nm em cima de uma amostra de monocamadas e incubar por 1 min(Figura 1C).</li>
	<li>Retire suavemente o chip da amostra e adicione uma alíquota de 3 μl de Proteína A. Incubar por 1 min a temperatura ambiente(Figura 1D).</li>
	<li>Limpe a gota de excesso usando o Whatman #1 papel filtro e adicione imediatamente uma alíquota de 3 μl de solução de anticorpos. Incubar por 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova a solução em excesso usando uma seringa Hamilton e adicione imediatamente uma alíquota de 1 μl de DLPs rotavírus (0,1 mg/ml) em solução tampão contendo HEPES de 50 mM (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM CaCl2. Incubar por pelo menos 2 minutos em temperatura ambiente. A preparação dos DLPs foi descrita anteriormente18.
</li>
</ol>3. Monte a Câmara Microfluiídica e Carregue o Porta-Espécimes In situ
<ol><li>Carregue o e-chip molhado contendo a amostra viral na ponta do suporte da amostra microfluida. Descarregue um segundo e-chip plano por 1 min e depois carregado em cima do chip espaçador(Figura 2, painéis 1-5).</li>
	<li>Alternativamente, para aumentar o contraste das macromoléculas biológicas, a mancha de metal pesado (por exemplo, 0,2% de formação de urano) pode ser adicionada a espécimes molhados antes de colocar o segundo e-chip no espécime molhado. No entanto, o e-chip contendo o espécime precisará ser lavado com água Milli-Q antes de adicionar o reagente de contraste.</li>
	<li>Sanduíche toda a montagem para formar um gabinete selado, mantido no lugar mecanicamente dentro do suporte por 3 parafusos de latão (Figura 2, painéis 6-8).</li>
	<li>Após o montagem, a ponta do suporte é bombeada para 10-6 Torr usando uma estação de bombeamento a seco turbo-bombeada antes de colocar o suporte dentro do TEM.</li>
</ol>4. Imagem em líquido usando um microscópio eletrônico de transmissão
<ol><li>Carregue o porta-espécimes in situ em um microscópio eletrônico de transmissão (FEI Company) equipado com um filamento LaB6 e operando a 120 kV.</li>
	<li>Ligue o filamento TEM e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação à amostra usando a função wobbler para inclinar a amostra de -15° para +15° para frente e para trás na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção z para ajudar a explicar a espessura adequada da câmara líquida. Esta etapa também garante que uma ampliação precisa seja usada ao gravar imagens.</li>
	<li>Registo as imagens ao longo das bordas e nas regiões do canto da câmara microfluidica primeiro. Essas áreas normalmente contêm a solução mais fina. Registo imagens de amostras em condições de baixa dose (1-3 elétrons/Å2) usando uma câmera CCD. Use ampliações nominais de 6.000X - 30.000X.</li>
	<li>Determine o valor adequado do desfoco focando na borda da câmara fluida. Use um valor de -1,5 μm para gravar imagens a 30.000X de ampliação. Se a solução espessa for encontrada ou se o agente de contraste não for usado na preparação da amostra, use valores de desfoco mais elevados na faixa de -2 a -4 μm.</li>
	<li>Para garantir que a solução esteja contida na câmara microfluida durante os experimentos, concentre o feixe de elétrons até que as bolhas sejam formadas no líquido dentro do dispositivo.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

A autora, Madeline J. Dukes, é funcionária da Protochips, Inc.

Em nosso trabalho apresentado, utilizamos a abordagem de captura de afinidade para dLPs rotavírus de tether para uma plataforma microfluida. Isso permitiu imagens in situ de complexos macromoleculares em um microambiente líquido. A abordagem de captura é significativa em relação a outras técnicas de imagem microfluidica, pois localiza espécimes biológicos na janela de imagem para negar grandes problemas difusivos que surgem durante a gravação de imagens em líquido. No entanto, uma das etap...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Um objetivo comum de biólogos e engenheiros é entender o funcionamento interno das máquinas moleculares. Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) são instrumentos ideais para visualizar esses detalhes intrincados na resolução quase atômica1-2. Para sustentar o sistema de alto vácuo de um TEM, as amostras biológicas são tipicamente incorporadas em pelíneas de gelo vítreo3, açúcares4,sais de metal pesado5, ou alguma combinação de6. Como resultado, imagens de espécimes incorporados podem revelar apenas instantâneos limitados de processos dinâmicos.
As primeiras tentativas de manter espécimes biológicos hidratados em câmaras de líquidos ambientais foram realizadas por Parsons e colegas utilizando estágios diferenciais de bombeamento. Padrões de difração eletrônica de cristais catalase não manchados foram registrados com sucesso em uma resolução de 3 Å em um estado hidratado7-8. Além disso, domínios lipíduos separados em fases poderiam ser examinados em membranas hidratadas de eritrócitos humanos9-10. No entanto, o movimento causado pela difusão do líquido e sua interferência com o feixe de elétrons, resultou em perda severa de resolução e outros experimentos usando espécimes biológicos não foram tentados até recentemente.
Recém-desenvolvidos foram introduzidos portadores de amostras microfluidas que utilizam microchips semicondutores para formar uma câmara ambiental microes em escala. Estes dispositivos podem manter amostras em líquido enquanto estão posicionados em uma coluna TEM11-12. Esse avanço técnico na imagem TEM permitiu que os pesquisadores vissem, pela primeira vez, eventos progressivos no nível molecular13. Referimo-nos a esta nova modalidade como " microscopia molecularin situ", pois os experimentos agora podem ser realizados "dentro" da coluna EM14-15. O objetivo geral deste método é imaginar conjuntos biológicos em líquido, a fim de observar seus comportamentos dinâmicos na resolução de nanômetros. A lógica por trás da técnica desenvolvida é registrar observações em tempo real e examinar novas propriedades do maquinário biológico em solução. Essa metodologia amplia o uso de TEMs para fins mais amplos em biologia celular e molecular12-16.
No artigo de vídeo atual, apresentamos um protocolo abrangente para montar e usar um suporte de espécime microfluidic comercialmente disponível. Esses suportes especializados utilizam microchips de nitreto de silício produzidos com espaçadores integrados para formar uma câmara líquida que inclua volumes minuciosos de solução. Janelas finas e transparentes são gravadas nos microchips para fins de imagem12. Demonstramos o uso adequado de um suporte microfluido para examinar partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) em camadas sídicas em líquido usando um TEM. Para garantir que os conjuntos biológicos, como os DLPs, não se difundam rapidamente em grandes distâncias durante a imagem, empregamos a abordagem Affinity Capture para amarrá-los à superfície da câmara microfluidica16. Esta etapa de captura molecular tem uma grande vantagem sobre técnicas alternativas para imagens de amostras biológicas em líquido, pois permite a aquisição de imagens que serão usadas para rotinas de processamento a jusante. Esta etapa de captura usada em conjunto com a imagem microfluidica é exclusiva dos nossos procedimentos17. Os leitores que utilizam aplicações de biologia estrutural usando câmaras de imagem TEM ou microfluidic podem considerar o uso de técnicas de captura de afinidade quando observações dinâmicas no nível molecular são o objetivo final.

<table><tbody><tr><td>E-chips, chip espaçador</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; Janela M</td></tr><tr><td>E-chip, chip superior</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; janela m Lipídio</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>Forma de pó</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) lipídio</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>Forma de pó</td></tr><tr><td>Frascos volumétricos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringas Hamilton</td><td>Hamilton Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu; l; 1-25 &mu; l</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman #1</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 peças, 90 mm</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidro</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Tubos de cultura de vidro</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Clorofórmio&nbsp;</td><td>Ciências de Microcópia Eletrônica</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteína A marcada com ele</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>de água Milli-Q</td> de 10 mg <td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Água Ultrapura</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Equipamento&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon In situ suporte de espécime</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; FEI compatível</td></tr><tr><td>FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>Câmera</td></tr><tr><td>CCD Eagle 2k HS</td> de 120 kV <td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp; &Aring;/amostragem de pixels a 30.000X</td></tr><tr><td>Gatan 655 Estação de bombeamento a seco</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Ponta do suporte da bomba para 10-6&nbsp; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, unidade de descarga luminescente</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Modo de polaridade negativa</td></tr><tr><td>Placa de agitação aquecida Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat para 150 &ordm; C por 1,5 horas</td></tr></tbody></table>

in situ tem de assembleias biológicas em líquido

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Os pesquisadores usam regularmente microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) para examinar entidades biológicas e avaliar novos materiais. Aqui, descrevemos uma aplicação adicional para esses instrumentos: visualização de conjuntos virais em um ambiente líquido. Este excitante e novo método de visualização de estruturas biológicas utiliza um suporte de espécimes de base microfluidic recentemente desenvolvido. Nosso artigo em vídeo demonstra como montar e usar um suporte microfluido para imagem de amostras líquidas dentro de um TEM. Em particular, usamos partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) como nosso sistema modelo. Também descrevemos passos para revestir a superfície da câmara líquida com biofilmes de afinidade que amarram DLPs à janela de visualização. Isso nos permite fazer assembleias de imagem de forma adequada para a determinação da estrutura 3D. Assim, apresentamos um primeiro vislumbre de partículas subvirais em um ambiente líquido nativo.

Imagens representativas de DLPs em líquido usando E-chips que foram descarregadas por brilho(Figura 3A) mostram menos DLPs em uma determinada área de visualização, presumivelmente devido à difusão, em comparação com DLPs que são enriquecidos em dispositivos affinity capture(Figura 3B). A adição de formato de urano na câmara de imagem aumenta o contraste da amostra e, consequentemente, a visibilidade de DLPs individuais na solução(Figura 3C, painel superior). Um melhor co...

Aqui descrevemos um procedimento para imagem de complexos virais em liquidez em resolução de nanômetros usando um microscópio eletrônico de transmissão.

In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de montagens biológicas e líquidos para observar seus comportamentos dinâmicos com resolução de nanômetro. Isso é realizado primeiramente preparando microchips de nitreto de silício com uma superfície de captura por afinidade, permitindo que macromoléculas sejam ancoradas à superfície do microchip, impedindo a difusão no líquido. O segundo passo é carregar as amostras biológicas no microchip para recrutar partículas de rotavírus.Em seguida, o microchip contendo as partículas virais é lavado com um agente de contraste e, então, carregado no suporte de espécime microfluídico. O passo final é carregar o chip superior e a placa frontal para formar um recipiente fechado que envolve a amostra líquida. Por fim, imagens são registradas no MET para revelar características da amostra viral dentro da câmara microfluídica líquida.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos existentes para examinar entidades em líquido é que nossas amostras não se difundem rapidamente por grandes distâncias durante a imagem, devido ao revestimento de captura por afinidade aplicado aos microchips. As implicações desta técnica estendem-se para avaliações em tempo real de sistemas de liberação de fármacos baseados em nanopartículas ou para o desenvolvimento de vacinas contra patógenos virais, porque podemos observar, pela primeira vez, como máquinas nano dinâmicas mudam em solução. Embora este método possa fornecer insights sobre a visualização de macromoléculas biológicas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como aplicações em eletroquímica.Uma demonstração visual deste método é essencial, já que a preparação de dispositivos de captura por afinidade e o carregamento do suporte para espécimes microfluídicos podem representar um desafio para o usuário iniciante. Para iniciar, limpe os chips de nitreto de silício mergulhando-os em 15 mililitros de acetona por dois minutos, seguido por 15 mililitros de metanol por dois minutos.Para remover o fotoresiste residual utilizado no processo de fabricação, deixe as pastilhas secarem rapidamente sob fluxo laminar. Após secas, incube as pastilhas em uma placa aquecida a 150 graus Celsius por 1,5 hora. Em seguida, permita que esfriem até a temperatura ambiente.Em seguida, utilize seringas Hamilton para preparar uma mistura de lipídios em um pequeno tubo de vidro. Primeiro, adicione 25% de clorofórmio, depois adicione 55% de DLPC em clorofórmio a um miligrama por mililitro. E, finalmente, usando uma seringa separada, adicione 20% de lipídio NTA-níquel em clorofórmio a um miligrama por mililitro, obtendo um volume total de 40 microlitros.Em seguida, corte um pedaço de parafina para ajustar dentro de uma placa de Petri de vidro de 100 por 15 milímetros e adicione nove gotas de 15 microlitros de água Milli Q sobre a superfície da parafina. Aplique uma alíquota de um microlitro da mistura lipídica sobre cada gota de 15 microlitros de água Milli Q e coloque a placa sobre gelo em um ambiente úmido por pelo menos 60 minutos, enquanto uma monocamada lipídica se forma sobre a superfície das gotas. Coloque um EIP com espaçador integrado de 150 nanômetros sobre a gota da monocamada lipídica e incube-os juntos por um minuto.Em seguida, levante cuidadosamente o chip da gota e adicione três microlitros de proteína A com marcação por histidina a 0,01 miligramas por mililitro diretamente sobre a superfície do chip. Incube o chip com a proteína A por um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, remova o líquido em excesso utilizando papel filtro Watman número um e adicione imediatamente três microlitros de solução de anticorpo IgG a 0,01 miligramas por mililitro.Incube a amostra por um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução em excesso utilizando uma seringa Hamilton e adicione imediatamente uma alíquota de um microlitro de rotavírus, partículas duplamente camadas a 0,1 miligrama por mililitro em uma solução tampão heaps, e incube o chip por pelo menos dois minutos à temperatura ambiente. Um segundo IP plano é preparado por descarga de brilho por um minuto, montando a câmara microfluídica utilizando um ST.Stereoscope, carregando primeiro a ponta da câmara de espécime com anéis O.Em seguida, carregue o E IP úmido contendo a amostra viral na ponta do suporte microfluídico para espécimes. Depois, adicione o EIP plano com descarga luminiscente sobre a parte superior do espécime, montando todo o conjunto para formar um compartimento selado mantido mecanicamente no lugar dentro do suporte por três parafusos de latão. Após a montagem, reduza a pressão na ponta do suporte até 10 elevado a menos seis torr.Usando uma estação de bombeamento a vácuo com bomba turbo antes de colocar o porta-amostras no MET, carregue o porta-amostras tipo I em um microscópio eletrônico de transmissão equipado com filamento lab six operando a 120 quilovolts. Em seguida, ligue o filamento do MET e ajuste a altura centrada da platina do microscópio em relação ao espécime utilizando a função wobbler para inclinar a amostra de menos 15 graus a mais 15 graus, para frente e para trás. Na coluna, registre imagens com aumento de 6.000 a 30.000 vezes ao longo das bordas e nas regiões dos cantos da câmara microfluídica.Primeira imagem utilizando uma câmera CCD em condições de baixa dose de um a três elétrons por angstrom quadrado. Determine o valor adequado de desfoque focalizando na borda da câmara fluidica. Em geral, utilize um valor de desfoque de menos 1,5 micrômetros para registrar imagens com ampliação de 30.000 vezes, garantindo que a solução esteja contida na câmara microfluidica.Durante os experimentos, foque o feixe de elétrons até que as bolhas se formem no líquido dentro do dispositivo. A imagem mostrada aqui foi capturada após dois minutos com cinco elétrons por angstrom quadrado. Após cinco minutos, formaram-se ainda mais bolhas, descarga luminiscente, ligação de microchips.Muito poucas partículas em camada dupla na solução, presumivelmente devido à difusão. Em comparação, as partículas em camada dupla são enriquecidas em microchips com revestimento de afinidade; as imagens mostradas aqui são representativas e incluem uma reconstrução tridimensional de partículas em camada dupla em meio líquido contendo um agente de contraste. O diâmetro da reconstrução é de 80 nanômetros.Médias da classe de partículas duplamente estratificadas e líquido revelaram características bem definidas ao longo de suas superfícies externas. Os painéis individuais têm 110 nanômetros. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de centralizar o E IPS na ponta do porta-espécimes e preparar o porta-espécimes antes de inseri-lo no microscópio eletrônico.Após este procedimento, outros métodos, como a avaliação da atividade transcricional, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, até que ponto o feixe de elétrons afetou a capacidade funcional dos complexos virais? Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir dispositivos de captura por afinidade, decorá-los com adaptadores moleculares, carregar espécimes virais no suporte microfluídico para MET e imaginar os espécimes utilizando procedimentos de microscopia cche. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos virais pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e proteção ocular, devem sempre ser tomadas ao realizar procedimentos com patógenos do nível BSL 2.

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Bioengineering

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