Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as propriedades mecânicas e os estados de dobramento dos parceiros de ligação à proteína de fusão usando uma espectroscopia de força de molécula única baseada em FM. Isso é obtido imobilizando covalentemente os parceiros de ligação a proteínas em uma lâmina de vidro e em um cantilever A FM para obter uma geometria de tração bem definida como uma segunda etapa. A superfície do vidro é recuada com o cantilever, o que permite que a ligação do ligante do receptor seja estabelecida.

Em seguida, o cantilever é retraído a uma velocidade constante para desdobrar domínios proteicos individuais e associar o complexo ligante receptor são obtidos resultados que revelam elementos estruturais terciários que atuam como barreiras de energia ao longo da via de desdobramento, que são revelados em modelos de elasticidade polimérica. Mais informações cinéticas e energéticas sobre os parceiros de ligação podem ser obtidas ajustando modelos cinéticos ao espectro de força dinâmica. O objetivo geral deste procedimento é estudar as vias de desdobramento das proteínas sob força.

Este método pode fornecer informações sobre a estabilidade mecânica das proteínas. Ele pode ser aplicado a qualquer sistema de ligante de receptor de proteína que possa ser projetado com um grupo de arquivos acessível. Pesquisadores usando esse método pela primeira vez eu luto porque o tempo é crucial e o manuseio dos cantilevers pode ser difícil.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biofísica, como a forma como uma proteína de múltiplos domínios se desdobra Para começar lugar. Duas lamínulas de vidro de diâmetro de 24 milímetros e 0,5 milímetros de espessura no suporte A-P-T-F-E e depois sonicate. A cobertura desliza em uma mistura de 50 a 50 de etanol e água ultrapura por 15 minutos.

Quando a sonicação estiver concluída, enxágue as lamínulas com água ultrapura e grave-as em uma solução de piranha por 30 minutos. Após 30 minutos, remova as lamínulas e lave-as com água ultrapura e seque-as sob um jato suave de nitrogênio. Em seguida, submergir A cobertura desliza em uma mistura de 45 a cinco para um de etanol água ultrapura e três amino propil dimetil ahoy.

Coloque as amostras submersas em um agitador em temperatura ambiente por 60 minutos a aproximadamente 50 rotações por minuto. Em seguida, mergulhe a lamínula sequencialmente em etanol a 100%, seguido de água ultrapura duas vezes cada. Novamente, seque as lamínulas sob um jato suave de nitrogênio.

Depois de seco, asse as lamínulas em forno a 80 graus Celsius por 30 minutos. Armazene as lamínulas não utilizadas sob Argonne por até seis semanas para realizar a aminoização das pontas cantilever de silicone. Primeiro coloque quatro balanços de silicone em uma lâmina de vidro limpa e trate-os com ozônio UV por 15 minutos.

Em seguida, mergulhe os cantilevers por três minutos e uma solução de 50 a 50 de etanol e três amino propildimetil oxis Ilene, juntamente com o ponto 25% de água ultrapura. Em seguida, enxágue os cantilevers sequencialmente por 60 segundos em padeiros de tolueno, etanol e água ultrapura. Seque cuidadosamente os cantilevers em papel de filtro entre RINs após o enxágue final.

Coloque os balanços em uma lâmina de vidro limpa e asse a 80 graus Celsius por 30 minutos. Prepare dois Ts de grânulos redutores de sulfeto de diss TEP cortando primeiro a ponta de uma ponta de pipeta de 200 microlitros para aumentar seu diâmetro e, em seguida, pipetando 100 microlitros da solução de contas de estoque em cada microtubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de TBS aos OTTs de pasta de esferas TEP e enxágue as esferas agitando brevemente o microtubo.

Em seguida, peletize as esferas centrifugando as amostras a 850 Gs por três minutos. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta e enxágue as esferas mais duas vezes com um mililitro de TBS. A centrifugação entre os enxágues é após o enxágue final, adicione uma solução de proteína concentrada a três miligramas por mililitro às esferas TEP na proporção de um para dois e misture suavemente a pasta mexendo com uma ponta de micropipeta para evitar a introdução de bolhas de ar.

Em seguida, coloque a mistura de pasta de grânulos de proteína TEP em um rotador por 2,5 horas. Mergulhe os cantilevers amino olhos e lamínulas em tampão de sódio a um pH de 8,5 por 45 minutos para desprotonar os grupos aminas primárias na superfície. Em seguida, aqueça o pó de malam NHS até a temperatura ambiente e prepare 210 microlitros a 25 micromolares, agitando-o em tampão de sódio menino oito.

A solução deve ser usada o mais rápido possível devido à meia-vida extremamente curta do NHS. Em pH 8,5, deposite rapidamente gotículas de 30 microlitros de solução de malam N-H-S-P-E-G em uma placa de Petri e 90 microlitros em todas as outras lamínulas de vidro. Coloque cuidadosamente os cantilevers dentro das gotículas de 30 microlitros.

Em seguida, vire a lamínula sem a gota em uma com a solução N-H-S-P-E-G malam para formar um sanduíche com a solução N-H-S-P-E-G malam. No meio, incube os balanços e lamínulas com a solução N-H-S-P-E-G MALAM em temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue o cordão TEP e a solução de proteína reduzida a 100 GS por um minuto e colete o sarcástico.

Em seguida, dilua a solução de proteína com TBS. Procure uma concentração de proteína durante a conjugação da superfície em uma faixa de 0,5 a dois miligramas por mililitro. Em seguida, reserve as soluções de proteína reduzida e diluída por alguns minutos enquanto enxagua os balanços e as lamínulas.

Enxágue as lamínulas em três copos sequenciais de água ultrapura. Remova o líquido residual das lamínulas tocando cuidadosamente nas bordas do papel de filtro. Em seguida, monte as lamínulas em um porta-amostras apropriado que seja compatível com o instrumento A FM e seque o líquido residual sob um fluxo suave de nitrogênio.

Aplique 20 microlitros da solução de proteína diluída como uma gota no centro das lamínulas. Em seguida, enxágue os cantilevers em três copos sequenciais de água ultrapura, seguidos por gotículas de 30 microlitros da segunda solução proteica diluída. Incubar lamínulas e consolas peguilado com as respectivas soluções proteicas diluídas à temperatura ambiente durante uma a duas horas numa câmara de humidade.

Em seguida, use uma pipeta para enxaguar as lamínulas pelo menos 10 vezes com um mililitro de TBS e depois armazene-as em TBS até a medição. Enxágue também os cantilevers usando três copos sequenciais contendo TBS para remover proteínas não ligadas e armazená-las também em TBS. Monte as corrediças funcionalizadas, cantilever e de vidro em um modelo A FM que é adequado para medição em líquidos e suporta uma faixa de velocidade acessível no Z pieto de aproximadamente 200 a 5.000 nanômetros por segundo.

Ao montar a lata para minimizar a exposição ao ar, certifique-se de que as superfícies permaneçam cobertas com amortecedor durante todo o processo após o ajuste correto do feixe de laser. Deixe o sistema se equilibrar por pelo menos 30 minutos para reduzir quaisquer efeitos de deriva e reajustar se necessário. Em seguida, comece a fazer medições após a ligação bem-sucedida da coesão.

Docker em par os traços de distância de força registrados mostrados aqui. Exibir um padrão de pico característico. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio de proteína, com o último pico correspondendo à dissociação do complexo ligante do receptor.

Os traços de distância de força registrados foram então transformados em espaço de comprimento de contorno de força e montados em um histograma de posição de barreira. Os dados mostram um incremento de comprimento de contorno de aproximadamente 89 nanômetros, que pode ser atribuído de forma inequívoca ao desdobramento do domínio xin para sondar a paisagem de energia do docker coesivo e da interação. Um total de 186 traços de dados foram obtidos em quatro velocidades de agrupamento diferentes.

O espectro de força dinâmica resultante mostrado como grandes círculos azuis representa as forças de ruptura mais prováveis em uma determinada taxa de carregamento. Esses valores foram então ajustados ao modelo de Bell Evans, o ajuste produziu valores para Koff e delta X, que foram encontrados em boa concordância com os resultados publicados anteriormente. Uma vez dominada, a parte experimental dessa técnica pode ser feita em oito a nove horas.

Após este procedimento, a mutagênese específica do local pode ser realizada em um experimento de acompanhamento para determinar os aminoácidos cruciais para a ligação após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biofísica de molécula única explorarem paisagens de dobramento de proteínas. Nós o usamos para estudar as propriedades mecânicas das SOEs de celulose, que estão entre os sistemas de proteínas mecanicamente mais estáveis conhecidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar espectroscopia de força de molécula única em pares de ligantes de receptores de proteínas.