Name: Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprenda a investigar sistemas receptor-ligante do celulossoma usando espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM. Este método revela propriedades mecânicas e estados de dobramento de proteínas.

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Os autores reconhecem o financiamento de uma bolsa avançada do Conselho Europeu de Pesquisa para Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece o financiamento da Society in Science - The Branco Weiss Fellowship Os autores agradecem a Edward A. Bayer, Yoav Barak e Daniel B. Fried, do Instituto Weizmann de Ciência, por fornecerem generosamente as proteínas usadas neste estudo. Os autores agradecem a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner e Stefan W. Stahl pelas discussões úteis.

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<li>Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-S+Transition+in+Short+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">B-S Transition in Short Oligonucleotides.</a> Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).</li>
<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Giannotti, M. I., Vancso, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Single+Synthetic+Polymer+Chains+and+Polysaccharides+by+AFM-Based+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy.</a> Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).</li>
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<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Morfill, J., Neumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-based+Analysis+of+Multidimensional+Energy+Landscapes%3A+Application+of+Dynamic+Force+Spectroscopy+and+Steered+Molecular+Dynamics+Simulations+to+an+Antibody+Fragment%E2%80%93Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide.</a> Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).</li>
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<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
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<li>Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contour+Length+and+Refolding+Rate+of+a+Small+Protein+Controlled+by+Engineered+Disulfide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds.</a> Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para obter dados significativos de experimentos de espectroscopia de força de molécula única, é crucial obter geometrias de tração bem definidas e reprodutíveis. O protocolo usado aqui resulta na imobilização específica do local de complexos de proteínas em uma geometria de tração definida.
Os balanços utilizados neste estudo foram escolhidos devido à sua sensibilidade à força e alta frequência de ressonância na água. Além disso, a pequena curvatura da ponta de aproximadamente 10 nm é vantajos...

Cellulossomos são grandes complexos multienzimáticos exibidos na superfície de bactérias celulolíticas anaeróbicas (por exemplo, C. thermocellum) que evoluíram para despolimerizar eficientemente a lignocelulose da parede celular vegetal em oligossacarídeos solúveis1. Um atributo central dos celulossomos é a interação coesina-dockerina de alta afinidade. No paradigma mais proeminente, um módulo de dospina de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado é exibido na extremidade C-terminal das várias enzimas bacterianas. O módulo dockerin direciona a montagem de combinações sinérgicas de enzimas para a proteína de andaime não catalítica ('scaffoldin'), que compreende uma poliproteína de domínios de coesina que são específicos para o módulo dockerin tipo I. Em níveis mais altos, a arquitetura do celulossomo pode se tornar muito complexa, incorporando pares alternativos de coesina e dockerina (por exemplo, tipo II, tipo III) que ancoram as estruturas à superfície celular e permitem a montagem de estruturas ramificadas contendo múltiplos andaimes2. Os vários tipos de coesina-dourina, apesar de terem estruturas relacionadas, exibem especificidades de ligação diferencial, suprimindo a reatividade cruzada com andaimes não intencionais ou componentes de outras espécies bacterianas produtoras de celulossoma. Embora as abordagens de bioinformática tenham identificado com sucesso milhares de componentes celulossômicos únicos no nível genético, comparativamente poucas estruturas proteicas são conhecidas, e os mecanismos em ação na determinação da especificidade coesina-dourina continuam sendo uma área ativa da pesquisa em biologia estrutural.
Desde a invenção do microscópio de força atômica (AFM) por Binnig et al.3, vários modos operacionais do AFM foram desenvolvidos e melhorados continuamente, incluindo a imagem latente do noncontact, a imagem latente4 do modo da oscilação, e a única espectroscopia da força da molécula (SMFS)5,6. O SMFS evoluiu para uma técnica amplamente utilizada para sondar diretamente proteínas individuais7-11, ácidos nucléicos12-15 e polímeros sintéticos16-19. Em um experimento típico de SMFS para investigar a ligação receptor-ligante20,21, uma ponta cantilever AFM é modificada com um dos parceiros de ligação, enquanto uma superfície de vidro plana é modificada com o parceiro de ligação complementar. O cantilever modificado é colocado em contato com a superfície, permitindo que os parceiros se unam. A base do cantilever é então retirada a velocidade constante e a força é medida usando o método de deflexão da alavanca óptica. Os traços de dados de força-distância resultantes exibem picos semelhantes a dentes de serra se a ligação foi estabelecida. Nos casos em que os parceiros de ligação são fundidos a vários domínios de proteína, cada pico no traço de força-distância pode ser correlacionado ao desdobramento de um único domínio de proteína ou subdomínio dobrado, enquanto o último pico corresponde à ruptura da interface de ligação à proteína. As posições específicas dos elementos resistentes à força podem ser usadas como uma impressão digital para identificar os vários domínios de proteína de interesse. Este método pode ser usado para interrogar aminoácidos importantes envolvidos no dobramento e estabilização de proteínas. Muitos modelos foram relatados na literatura para tratar o comportamento característico de extensão de força observado em experimentos SMFS. Os modelos mais comumente usados incluem o modelo de corrente articulada livremente (FJC)22, o modelo de cadeia semelhante a um sem-fim (WLC)18,23-25 e o modelo de corrente de rotação livre (FRC)25,26.
Em nosso trabalho anterior11, usamos espectroscopia de força de molécula única para investigar a interação dos módulos coesina e dockerina. Aqui, apresentamos um protocolo experimental para funcionalização de superfícies de vidro e cantilever com construções de proteínas enzimáticas-dockerina e CBM-coesina. Também apresentamos um protocolo SMFS baseado em AFM, incluindo procedimentos de aquisição e análise de dados. O protocolo descrito pode ser facilmente generalizado para outros sistemas moleculares e deve ser particularmente útil para pesquisadores interessados em pares de ligantes de receptores de alta afinidade.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropil dimetil etoxissilano</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimida</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel redutor de dissulfeto</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini cantilevers de nitreto de silício</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lotes macios</td></tr><tr><td>XYZ Atuadores piezoelétricos</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infravermelho " amplo espectro" Laser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Aquisição e análise de dados</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>sódio Cloreto</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>cálcio Medidor de pH Borato</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de sódio</td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm de diâmetro, 0,5 mm de espessura</td></tr><tr><td>Porta-amostras</td><td></td><td></td> de PTFE <td>feito sob medida</td></tr><tr><td>Banho</td><td></td><td></td><td></td>Sonicator</tr><tr><td>Pureza analítica</td>do<td>etanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (concentrado)</td><td></td><td></td> <td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (30%)</td><td></td><td></td> <td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td></td><td></td> pureza <td>analítica</td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr><tr><td>Microtubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>adequada para microtubos</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Placas <td></td><td></td><td></td><td>de Petri</td></tr><tr><td>Béqueres</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td> óptico</tr></tbody></table>

investigando sistemas receptor-ligante do celulossoma com base-afm única molécula força espectroscopia

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Os celulossomos são complexos multienzimáticos discretos usados por um subconjunto de bactérias anaeróbicas e fungos para digerir substratos lignocelulósicos. A montagem das enzimas na proteína de andaime não catalítica é dirigida por interações entre uma família de pares receptor-ligante relacionados compreendendo módulos de coesina e dockerina em interação. A ligação extremamente forte entre os módulos coesina e dockerina resulta em constantes de dissociação na faixa de picomolar a nanomolar baixo, o que pode dificultar medições precisas fora da taxa com métodos convencionais em massa. A espectroscopia de força de molécula única (SMFS) com o microscópio de força atômica mede a resposta de biomoléculas individuais à força e, em contraste com outros métodos de manipulação de molécula única (ou seja, pinças ópticas), é ideal para estudar interações receptor-ligante de alta afinidade devido à sua capacidade de sondar o regime de alta força (>120 pN). Aqui apresentamos nosso protocolo completo para estudar montagens de proteínas celulossômicas no nível de molécula única. Usando uma topologia de proteína derivada do celulossomo nativo, trabalhamos com proteínas de fusão enzimática-dockerina e módulo de ligação a carboidratos-coesina (CBM-coesina), cada uma com um grupo tiol livre acessível em um resíduo de cisteína projetado. Apresentamos nosso protocolo de imobilização de superfície específico do local, juntamente com nosso procedimento de medição e análise de dados para obter parâmetros de ligação detalhados para o complexo de alta afinidade. Demonstramos como quantificar as forças de desdobramento de subdomínio único, forças de ruptura complexas, taxas de desligamento cinéticas e larguras potenciais do poço de ligação. A aplicação bem-sucedida desses métodos na caracterização da interação coesina-dourina responsável pela montagem de complexos celulolíticos multidomínio é descrita mais adiante.

Utilizamos o procedimento descrito para investigar um par coesina-dockerina do tipo I de C. thermocellum. Após a ligação bem-sucedida do par coesina-dockerina, os traços de força-distância registrados exibiram padrões de picos característicos. Um traço típico é mostrado na Figura 4a. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio proteico, sendo o último pico correspondente à dissociação do complexo receptor-ligante.
Para o complexo CBM-coesina-dockeri...

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as propriedades mecânicas e os estados de dobramento de parceiros de ligação de proteínas de fusão utilizando espectroscopia de força única molécula baseada em MF. Isso é alcançado imobilizando covalentemente parceiros de ligação proteicos em uma lâmina de vidro e em um cantiléver de MF para obter uma geometria de tração bem definida como segundo passo. A superfície de vidro é indentada com o cantiléver, o que permite o estabelecimento da ligação entre receptor e ligante.Em seguida, o cantiléver é recolhido com velocidade constante para desdobrar domínios proteicos individuais e associar o complexo receptor-ligante; os resultados obtidos revelam elementos estruturais terciários que atuam como barreiras de energia ao longo do caminho de desdobramento, os quais são evidenciados em modelos de elasticidade polimérica. Informações cinéticas e energéticas adicionais sobre os parceiros de ligação podem ser obtidas mediante o ajuste de modelos cinéticos ao espectro dinâmico de força. O objetivo geral deste procedimento é estudar os caminhos de desdobramento de proteínas sob força.Este método pode fornecer informações sobre a estabilidade m

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

&lt; class = 'jove_content '&gt; Um protocolo para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais covalentemente em uma ponta AFM é apresentado. Procedimentos e exemplos para determinar a força de adesão e a energia livre dessas moléculas em suportes sólidos e bio-interfaces são fornecidos.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Descrevemos um protocolo para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e sua caracterização usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Nós apresentamos um método para conseguir imagens com resolução sub-nanométrica com (modo tapping) amplitude da modulação de microscopia de força atômica em líquido. O método é demonstrado em microscópios de força atómica comerciais. Nós explicar a lógica por trás de nossas escolhas de parâmetros e sugerir estratégias para otimização resolução.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Nós apresentamos um protocolo para funcionalizar cantialavancas do microscópio de força atômica (AFM) com uma única pilha de T e partícula do grânulo para estudos imunológicos. Os procedimentos para sondar a ligação Cell-dendritic do único-par célula T por AFM e monitorar a resposta celular em tempo real dos macrófagos a uma única partícula contínua pelo AFM com imagem latente da fluorescência são mostrados.

Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

A fixação covalente de moléculas de sondas às pontas de cantilever da microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica essencial para a investigação de suas propriedades físicas. Isso nos permite determinar a força de alongamento, a força de dessorção e o comprimento dos polímeros através da espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM com alta reprodutibilidade.

Ligação covalente de moléculas únicas para espectroscopia de força baseada em AFM

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.

Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

Aprenda a investigar sistemas receptor-ligante do celulossoma usando espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM. Este método revela propriedades mecânicas e estados de dobramento de proteínas.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

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