Name: Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprenda a investigar sistemas receptor-ligante do celulossoma usando espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM. Este método revela propriedades mecânicas e estados de dobramento de proteínas.

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Os autores reconhecem o financiamento de uma bolsa avançada do Conselho Europeu de Pesquisa para Hermann Gaub. Michael A. Nash agradece o financiamento da Society in Science - The Branco Weiss Fellowship Os autores agradecem a Edward A. Bayer, Yoav Barak e Daniel B. Fried, do Instituto Weizmann de Ciência, por fornecerem generosamente as proteínas usadas neste estudo. Os autores agradecem a Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner e Stefan W. Stahl pelas discussões úteis.

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<li>Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-S+Transition+in+Short+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">B-S Transition in Short Oligonucleotides.</a> Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).</li>
<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Giannotti, M. I., Vancso, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Single+Synthetic+Polymer+Chains+and+Polysaccharides+by+AFM-Based+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy.</a> Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).</li>
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<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Morfill, J., Neumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-based+Analysis+of+Multidimensional+Energy+Landscapes%3A+Application+of+Dynamic+Force+Spectroscopy+and+Steered+Molecular+Dynamics+Simulations+to+an+Antibody+Fragment%E2%80%93Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide.</a> Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).</li>
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<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
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<li>Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contour+Length+and+Refolding+Rate+of+a+Small+Protein+Controlled+by+Engineered+Disulfide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds.</a> Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
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<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para obter dados significativos de experimentos de espectroscopia de força de molécula única, é crucial obter geometrias de tração bem definidas e reprodutíveis. O protocolo usado aqui resulta na imobilização específica do local de complexos de proteínas em uma geometria de tração definida.
Os balanços utilizados neste estudo foram escolhidos devido à sua sensibilidade à força e alta frequência de ressonância na água. Além disso, a pequena curvatura da ponta de aproximadamente 10 nm é vantajos...

Cellulossomos são grandes complexos multienzimáticos exibidos na superfície de bactérias celulolíticas anaeróbicas (por exemplo, C. thermocellum) que evoluíram para despolimerizar eficientemente a lignocelulose da parede celular vegetal em oligossacarídeos solúveis1. Um atributo central dos celulossomos é a interação coesina-dockerina de alta afinidade. No paradigma mais proeminente, um módulo de dospina de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado é exibido na extremidade C-terminal das várias enzimas bacterianas. O módulo dockerin direciona a montagem de combinações sinérgicas de enzimas para a proteína de andaime não catalítica ('scaffoldin'), que compreende uma poliproteína de domínios de coesina que são específicos para o módulo dockerin tipo I. Em níveis mais altos, a arquitetura do celulossomo pode se tornar muito complexa, incorporando pares alternativos de coesina e dockerina (por exemplo, tipo II, tipo III) que ancoram as estruturas à superfície celular e permitem a montagem de estruturas ramificadas contendo múltiplos andaimes2. Os vários tipos de coesina-dourina, apesar de terem estruturas relacionadas, exibem especificidades de ligação diferencial, suprimindo a reatividade cruzada com andaimes não intencionais ou componentes de outras espécies bacterianas produtoras de celulossoma. Embora as abordagens de bioinformática tenham identificado com sucesso milhares de componentes celulossômicos únicos no nível genético, comparativamente poucas estruturas proteicas são conhecidas, e os mecanismos em ação na determinação da especificidade coesina-dourina continuam sendo uma área ativa da pesquisa em biologia estrutural.
Desde a invenção do microscópio de força atômica (AFM) por Binnig et al.3, vários modos operacionais do AFM foram desenvolvidos e melhorados continuamente, incluindo a imagem latente do noncontact, a imagem latente4 do modo da oscilação, e a única espectroscopia da força da molécula (SMFS)5,6. O SMFS evoluiu para uma técnica amplamente utilizada para sondar diretamente proteínas individuais7-11, ácidos nucléicos12-15 e polímeros sintéticos16-19. Em um experimento típico de SMFS para investigar a ligação receptor-ligante20,21, uma ponta cantilever AFM é modificada com um dos parceiros de ligação, enquanto uma superfície de vidro plana é modificada com o parceiro de ligação complementar. O cantilever modificado é colocado em contato com a superfície, permitindo que os parceiros se unam. A base do cantilever é então retirada a velocidade constante e a força é medida usando o método de deflexão da alavanca óptica. Os traços de dados de força-distância resultantes exibem picos semelhantes a dentes de serra se a ligação foi estabelecida. Nos casos em que os parceiros de ligação são fundidos a vários domínios de proteína, cada pico no traço de força-distância pode ser correlacionado ao desdobramento de um único domínio de proteína ou subdomínio dobrado, enquanto o último pico corresponde à ruptura da interface de ligação à proteína. As posições específicas dos elementos resistentes à força podem ser usadas como uma impressão digital para identificar os vários domínios de proteína de interesse. Este método pode ser usado para interrogar aminoácidos importantes envolvidos no dobramento e estabilização de proteínas. Muitos modelos foram relatados na literatura para tratar o comportamento característico de extensão de força observado em experimentos SMFS. Os modelos mais comumente usados incluem o modelo de corrente articulada livremente (FJC)22, o modelo de cadeia semelhante a um sem-fim (WLC)18,23-25 e o modelo de corrente de rotação livre (FRC)25,26.
Em nosso trabalho anterior11, usamos espectroscopia de força de molécula única para investigar a interação dos módulos coesina e dockerina. Aqui, apresentamos um protocolo experimental para funcionalização de superfícies de vidro e cantilever com construções de proteínas enzimáticas-dockerina e CBM-coesina. Também apresentamos um protocolo SMFS baseado em AFM, incluindo procedimentos de aquisição e análise de dados. O protocolo descrito pode ser facilmente generalizado para outros sistemas moleculares e deve ser particularmente útil para pesquisadores interessados em pares de ligantes de receptores de alta afinidade.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropil dimetil etoxissilano</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimida</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Gel redutor de dissulfeto</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini cantilevers de nitreto de silício</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Lotes macios</td></tr><tr><td>XYZ Atuadores piezoelétricos</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infravermelho " amplo espectro" Laser IR</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Controller</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Aquisição e análise de dados</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>sódio Cloreto</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>cálcio Medidor de pH Borato</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de sódio</td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>24 mm de diâmetro, 0,5 mm de espessura</td></tr><tr><td>Porta-amostras</td><td></td><td></td> de PTFE <td>feito sob medida</td></tr><tr><td>Banho</td><td></td><td></td><td></td>Sonicator</tr><tr><td>Pureza analítica</td>do<td>etanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (concentrado)</td><td></td><td></td> <td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (30%)</td><td></td><td></td> <td>pureza analítica</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td></td><td></td> pureza <td>analítica</td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr><tr><td>Microtubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>adequada para microtubos</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Placas <td></td><td></td><td></td><td>de Petri</td></tr><tr><td>Béqueres</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td> óptico</tr></tbody></table>

investigando sistemas receptor-ligante do celulossoma com base-afm única molécula força espectroscopia

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Os celulossomos são complexos multienzimáticos discretos usados por um subconjunto de bactérias anaeróbicas e fungos para digerir substratos lignocelulósicos. A montagem das enzimas na proteína de andaime não catalítica é dirigida por interações entre uma família de pares receptor-ligante relacionados compreendendo módulos de coesina e dockerina em interação. A ligação extremamente forte entre os módulos coesina e dockerina resulta em constantes de dissociação na faixa de picomolar a nanomolar baixo, o que pode dificultar medições precisas fora da taxa com métodos convencionais em massa. A espectroscopia de força de molécula única (SMFS) com o microscópio de força atômica mede a resposta de biomoléculas individuais à força e, em contraste com outros métodos de manipulação de molécula única (ou seja, pinças ópticas), é ideal para estudar interações receptor-ligante de alta afinidade devido à sua capacidade de sondar o regime de alta força (>120 pN). Aqui apresentamos nosso protocolo completo para estudar montagens de proteínas celulossômicas no nível de molécula única. Usando uma topologia de proteína derivada do celulossomo nativo, trabalhamos com proteínas de fusão enzimática-dockerina e módulo de ligação a carboidratos-coesina (CBM-coesina), cada uma com um grupo tiol livre acessível em um resíduo de cisteína projetado. Apresentamos nosso protocolo de imobilização de superfície específico do local, juntamente com nosso procedimento de medição e análise de dados para obter parâmetros de ligação detalhados para o complexo de alta afinidade. Demonstramos como quantificar as forças de desdobramento de subdomínio único, forças de ruptura complexas, taxas de desligamento cinéticas e larguras potenciais do poço de ligação. A aplicação bem-sucedida desses métodos na caracterização da interação coesina-dourina responsável pela montagem de complexos celulolíticos multidomínio é descrita mais adiante.

Utilizamos o procedimento descrito para investigar um par coesina-dockerina do tipo I de C. thermocellum. Após a ligação bem-sucedida do par coesina-dockerina, os traços de força-distância registrados exibiram padrões de picos característicos. Um traço típico é mostrado na Figura 4a. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio proteico, sendo o último pico correspondente à dissociação do complexo receptor-ligante.
Para o complexo CBM-coesina-dockeri...

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as propriedades mecânicas e os estados de dobramento de parceiros de ligação de proteínas de fusão utilizando espectroscopia de força única molécula baseada em MF. Isso é alcançado imobilizando covalentemente parceiros de ligação proteicos em uma lâmina de vidro e em um cantiléver de MF para obter uma geometria de tração bem definida como segundo passo. A superfície de vidro é indentada com o cantiléver, o que permite o estabelecimento da ligação entre receptor e ligante.Em seguida, o cantiléver é recolhido com velocidade constante para desdobrar domínios proteicos individuais e associar o complexo receptor-ligante; os resultados obtidos revelam elementos estruturais terciários que atuam como barreiras de energia ao longo do caminho de desdobramento, os quais são evidenciados em modelos de elasticidade polimérica. Informações cinéticas e energéticas adicionais sobre os parceiros de ligação podem ser obtidas mediante o ajuste de modelos cinéticos ao espectro dinâmico de força. O objetivo geral deste procedimento é estudar os caminhos de desdobramento de proteínas sob força.Este método pode fornecer informações sobre a estabilidade mecânica de proteínas. Pode ser aplicado a qualquer sistema de receptor proteico e ligante que possa ser modificado com um grupo funcional acessível. Pesquisadores que utilizam este método pela primeira vez podem ter dificuldades, pois o tempo é crucial e o manuseio dos cantiléveres pode ser difícil.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de biofísica, como a maneira pela qual uma proteína com múltiplos domínios se desdobra. Para começar, coloque duas lamínulas de vidro de 24 milímetros de diâmetro e 0,5 milímetro de espessura no suporte A-P-T-F-E e, em seguida, submeta as lamínulas à sonicação em uma mistura 50:50 de etanol e água ultrapura por 15 minutos.Quando a sonicação estiver completa, enxágue as lamínulas com água ultrapura e ataque-as em uma solução piranha por 30 minutos. Após 30 minutos, remova as lamínulas, enxágue-as com água ultrapura e seque-as sob um fluxo suave de nitrogênio. Em seguida, submerja as lamínulas em uma mistura na proporção de 45:5:1 de etanol, água ultrapura e tridimetilaminopropil silano.Coloque as amostras submersas em um agitador à temperatura ambiente por 60 minutos a aproximadamente 50 rotações por minuto. Em seguida, mergulhe a lamínula sequencialmente em etanol a 100%, seguido por água ultrapura, duas vezes cada. Novamente, seque as lamínulas sob um fluxo suave de nitrogênio.Uma vez secos, aqueça as lamínulas em estufa a 80 graus Celsius por 30 minutos. Armazene as lamínulas não utilizadas sob Argonne por até seis semanas para realizar a aminoilação das pontas em cantilever de silicone. Primeiro, coloque quatro cantilevers de silicone sobre uma lâmina de vidro limpa e trate-os com ozônio UV por 15 minutos.Em seguida, submergir as alavancas durante três minutos em uma solução 50:50 de etanol e tris-amino propil dimetil oxis ileno, juntamente com 0,25% de água ultrapura. A seguir, lavar as alavancas sequencialmente por 60 segundos em béqueres de tolueno, etanol e água ultrapura. Secar cuidadosamente as alavancas em papel de filtro entre as lavagens após a lavagem final.Coloque as alavancas em uma lâmina de vidro limpa e aqueça a 80 graus Celsius por 30 minutos. Prepare dois tubos de TEP com dissulfeto com agentes redutores adicionando primeiramente cortando a ponta de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros para aumentar seu diâmetro e, em seguida, pipetando 100 microlitros da solução estoque de perlas em cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de TBS à suspensão de perlas de TEP nos tubos, e lave as perlas agitando brevemente o tubo microcentrífugo em vórtex.Em seguida, pelote as esferas centrifugando as amostras a 850 Gs por três minutos. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta micrométrica e lave as esferas mais duas vezes com um mililitro de TBS. Após cada lavagem, faça uma centrifugação; após a lavagem final, adicione uma solução concentrada de proteína a três miligramas por mililitro às esferas de TEP numa proporção de um para dois e misture suavemente a suspensão, agitando com a ponteira de uma micropipeta para evitar a introdução de bolhas de ar.Em seguida, coloque a mistura em suspensão de perlas de proteína TEP em um agitador rotativo por 2,5 horas. Incube as alavancas com olhos de aminoácidos e lamínulas em tampão de borato de sódio com pH de 8,5 durante 45 minutos para desprotonar os grupos amina primários na superfície. Em seguida, aqueça o pó de N-H-S-P-E-G malame até a temperatura ambiente e prepare 210 microlitros a 25 micromolar, misturando-o por vortexagem em tampão de borato de sódio 8.A solução deve ser usada o mais rapidamente possível devido à meia-vida extremamente curta da NHS. Em pH 8,5, deposite rapidamente gotas de 30 microlitros da solução de N-H-S-P-E-G malam em uma placa de Petri e 90 microlitros em cada lâmina de vidro. Coloque cuidadosamente as ponteiras dentro das gotas de 30 microlitros.Em seguida, vire a lamínula sem a gota sobre outra com solução N-H-S-P-E-G malam para formar um sanduíche com a solução N-H-S-P-E-G MALAM. No centro, incube as microbalanças e lamínulas com a solução N-H-S-P-E-G MALAM à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue a esfera TEP e a solução de proteína reduzida a 100 GS por um minuto e colete o sobrenadante.Em seguida, dilua a solução proteica com TBS. Alcance uma concentração proteica durante a conjugação à superfície na faixa de 0,5 a dois miligramas por mililitro. Em seguida, reserve as soluções proteicas reduzidas e diluídas por alguns minutos enquanto lava as alavancas e lamínulas.Lave as lamínulas em três béqueres sequenciais contendo água ultrapura. Remova o líquido residual das lamínulas tocando cuidadosamente as bordas em papel filtro. Em seguida, monte as lamínulas em um suporte adequado para amostras compatível com o instrumento de FM e seque o líquido residual sob um fluxo suave de nitrogênio.Aplicar 20 microlitros da solução proteica diluída como uma gota no centro das lamínulas. Em seguida, lavar as ponteiras em três béqueres sequenciais contendo água ultrapura, seguido por gotas de 30 microlitros da segunda solução proteica diluída. Incubar as lamínulas e ponteiras pegiladas com as respectivas soluções proteicas diluídas à temperatura ambiente por uma a duas horas em uma câmara de umidade.Em seguida, utilize uma pipeta para lavar as lamínulas pelo menos 10 vezes com um mililitro de TBS e, depois, armazene-as em TBS até a medição. Lave também os cantiléveres utilizando três béqueres sequenciais contendo TBS para remover proteínas não ligadas e armazene-os igualmente em TBS. Monte os cantiléveres funcionalizados e as lâminas de vidro em um modelo de FM-A que seja adequado para medições em líquidos e que permita uma faixa de velocidade acessível no piezo Z de aproximadamente 200 a 5.000 nanômetros por segundo.Ao montar, pode-se minimizar a exposição ao ar, garantindo que as superfícies permaneçam cobertas com tampão durante todo o processo após o ajuste correto do feixe a laser. Deixe o sistema equilibrar por pelo menos 30 minutos para reduzir quaisquer efeitos de deriva e reajuste, se necessário. Em seguida, inicie as medições após a ligação bem-sucedida da coesão.O Docker em par mostra os traços registrados de força e distância exibidos aqui. Apresentam um padrão de pico característico. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio proteico, sendo o último pico correspondente à dissociação do complexo receptor-ligante.Os traços registrados de força em função da distância foram então transformados para o espaço de força em função do comprimento de contorno e agrupados em um histograma de posição de barreira. Os dados mostram um incremento no comprimento de contorno de aproximadamente 89 nanômetros, que pode ser claramente atribuído ao desdobramento do domínio xin para investigar a paisagem energética da interação coesiva do docker. Um total de 186 traços de dados foi obtido em quatro velocidades diferentes de agrupamento.O espectro dinâmico de forças resultante, mostrado como grandes círculos azuis, representa as forças de ruptura mais prováveis em uma determinada taxa de carregamento. Esses valores foram então ajustados ao modelo Bell-Evans, cujo ajuste forneceu valores para Koff e delta X, que se mostraram em bom acordo com resultados previamente publicados. Uma vez dominada, a parte experimental desta técnica pode ser realizada em oito a nove horas.Após este procedimento, a mutagênese direcionada pode ser realizada em um experimento subsequente para determinar os aminoácidos cruciais para a ligação, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biofísica de molécula única explorarem as paisagens de dobramento proteico. Utilizamos esse método para estudar as propriedades mecânicas das SOEs de celulose, que estão entre os sistemas proteicos mais mecanicamente estáveis conhecidos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar espectroscopia de força em nível de molécula única em pares de receptor proteico e ligante.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Aprenda a investigar sistemas receptor-ligante do celulossoma usando espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM. Este método revela propriedades mecânicas e estados de dobramento de proteínas.

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