Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as propriedades mecânicas e os estados de dobramento de parceiros de ligação de proteínas de fusão utilizando espectroscopia de força única molécula baseada em MF. Isso é alcançado imobilizando covalentemente parceiros de ligação proteicos em uma lâmina de vidro e em um cantiléver de MF para obter uma geometria de tração bem definida como segundo passo. A superfície de vidro é indentada com o cantiléver, o que permite o estabelecimento da ligação entre receptor e ligante.

Em seguida, o cantiléver é recolhido com velocidade constante para desdobrar domínios proteicos individuais e associar o complexo receptor-ligante; os resultados obtidos revelam elementos estruturais terciários que atuam como barreiras de energia ao longo do caminho de desdobramento, os quais são evidenciados em modelos de elasticidade polimérica. Informações cinéticas e energéticas adicionais sobre os parceiros de ligação podem ser obtidas mediante o ajuste de modelos cinéticos ao espectro dinâmico de força. O objetivo geral deste procedimento é estudar os caminhos de desdobramento de proteínas sob força.

Este método pode fornecer informações sobre a estabilidade mecânica de proteínas. Pode ser aplicado a qualquer sistema de receptor proteico e ligante que possa ser modificado com um grupo funcional acessível. Pesquisadores que utilizam este método pela primeira vez podem ter dificuldades, pois o tempo é crucial e o manuseio dos cantiléveres pode ser difícil.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de biofísica, como a maneira pela qual uma proteína com múltiplos domínios se desdobra. Para começar, coloque duas lamínulas de vidro de 24 milímetros de diâmetro e 0,5 milímetro de espessura no suporte A-P-T-F-E e, em seguida, submeta as lamínulas à sonicação em uma mistura 50:50 de etanol e água ultrapura por 15 minutos.

Quando a sonicação estiver completa, enxágue as lamínulas com água ultrapura e ataque-as em uma solução piranha por 30 minutos. Após 30 minutos, remova as lamínulas, enxágue-as com água ultrapura e seque-as sob um fluxo suave de nitrogênio. Em seguida, submerja as lamínulas em uma mistura na proporção de 45:5:1 de etanol, água ultrapura e tridimetilaminopropil silano.

Coloque as amostras submersas em um agitador à temperatura ambiente por 60 minutos a aproximadamente 50 rotações por minuto. Em seguida, mergulhe a lamínula sequencialmente em etanol a 100%, seguido por água ultrapura, duas vezes cada. Novamente, seque as lamínulas sob um fluxo suave de nitrogênio.

Uma vez secos, aqueça as lamínulas em estufa a 80 graus Celsius por 30 minutos. Armazene as lamínulas não utilizadas sob Argonne por até seis semanas para realizar a aminoilação das pontas em cantilever de silicone. Primeiro, coloque quatro cantilevers de silicone sobre uma lâmina de vidro limpa e trate-os com ozônio UV por 15 minutos.

Em seguida, submergir as alavancas durante três minutos em uma solução 50:50 de etanol e tris-amino propil dimetil oxis ileno, juntamente com 0,25% de água ultrapura. A seguir, lavar as alavancas sequencialmente por 60 segundos em béqueres de tolueno, etanol e água ultrapura. Secar cuidadosamente as alavancas em papel de filtro entre as lavagens após a lavagem final.

Coloque as alavancas em uma lâmina de vidro limpa e aqueça a 80 graus Celsius por 30 minutos. Prepare dois tubos de TEP com dissulfeto com agentes redutores adicionando primeiramente cortando a ponta de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros para aumentar seu diâmetro e, em seguida, pipetando 100 microlitros da solução estoque de perlas em cada tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de TBS à suspensão de perlas de TEP nos tubos, e lave as perlas agitando brevemente o tubo microcentrífugo em vórtex.

Em seguida, pelote as esferas centrifugando as amostras a 850 Gs por três minutos. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta micrométrica e lave as esferas mais duas vezes com um mililitro de TBS. Após cada lavagem, faça uma centrifugação; após a lavagem final, adicione uma solução concentrada de proteína a três miligramas por mililitro às esferas de TEP numa proporção de um para dois e misture suavemente a suspensão, agitando com a ponteira de uma micropipeta para evitar a introdução de bolhas de ar.

Em seguida, coloque a mistura em suspensão de perlas de proteína TEP em um agitador rotativo por 2,5 horas. Incube as alavancas com olhos de aminoácidos e lamínulas em tampão de borato de sódio com pH de 8,5 durante 45 minutos para desprotonar os grupos amina primários na superfície. Em seguida, aqueça o pó de N-H-S-P-E-G malame até a temperatura ambiente e prepare 210 microlitros a 25 micromolar, misturando-o por vortexagem em tampão de borato de sódio 8.

A solução deve ser usada o mais rapidamente possível devido à meia-vida extremamente curta da NHS. Em pH 8,5, deposite rapidamente gotas de 30 microlitros da solução de N-H-S-P-E-G malam em uma placa de Petri e 90 microlitros em cada lâmina de vidro. Coloque cuidadosamente as ponteiras dentro das gotas de 30 microlitros.

Em seguida, vire a lamínula sem a gota sobre outra com solução N-H-S-P-E-G malam para formar um sanduíche com a solução N-H-S-P-E-G MALAM. No centro, incube as microbalanças e lamínulas com a solução N-H-S-P-E-G MALAM à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue a esfera TEP e a solução de proteína reduzida a 100 GS por um minuto e colete o sobrenadante.

Em seguida, dilua a solução proteica com TBS. Alcance uma concentração proteica durante a conjugação à superfície na faixa de 0,5 a dois miligramas por mililitro. Em seguida, reserve as soluções proteicas reduzidas e diluídas por alguns minutos enquanto lava as alavancas e lamínulas.

Lave as lamínulas em três béqueres sequenciais contendo água ultrapura. Remova o líquido residual das lamínulas tocando cuidadosamente as bordas em papel filtro. Em seguida, monte as lamínulas em um suporte adequado para amostras compatível com o instrumento de FM e seque o líquido residual sob um fluxo suave de nitrogênio.

Aplicar 20 microlitros da solução proteica diluída como uma gota no centro das lamínulas. Em seguida, lavar as ponteiras em três béqueres sequenciais contendo água ultrapura, seguido por gotas de 30 microlitros da segunda solução proteica diluída. Incubar as lamínulas e ponteiras pegiladas com as respectivas soluções proteicas diluídas à temperatura ambiente por uma a duas horas em uma câmara de umidade.

Em seguida, utilize uma pipeta para lavar as lamínulas pelo menos 10 vezes com um mililitro de TBS e, depois, armazene-as em TBS até a medição. Lave também os cantiléveres utilizando três béqueres sequenciais contendo TBS para remover proteínas não ligadas e armazene-os igualmente em TBS. Monte os cantiléveres funcionalizados e as lâminas de vidro em um modelo de FM-A que seja adequado para medições em líquidos e que permita uma faixa de velocidade acessível no piezo Z de aproximadamente 200 a 5.000 nanômetros por segundo.

Ao montar, pode-se minimizar a exposição ao ar, garantindo que as superfícies permaneçam cobertas com tampão durante todo o processo após o ajuste correto do feixe a laser. Deixe o sistema equilibrar por pelo menos 30 minutos para reduzir quaisquer efeitos de deriva e reajuste, se necessário. Em seguida, inicie as medições após a ligação bem-sucedida da coesão.

O Docker em par mostra os traços registrados de força e distância exibidos aqui. Apresentam um padrão de pico característico. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio proteico, sendo o último pico correspondente à dissociação do complexo receptor-ligante.

Os traços registrados de força em função da distância foram então transformados para o espaço de força em função do comprimento de contorno e agrupados em um histograma de posição de barreira. Os dados mostram um incremento no comprimento de contorno de aproximadamente 89 nanômetros, que pode ser claramente atribuído ao desdobramento do domínio xin para investigar a paisagem energética da interação coesiva do docker. Um total de 186 traços de dados foi obtido em quatro velocidades diferentes de agrupamento.

O espectro dinâmico de forças resultante, mostrado como grandes círculos azuis, representa as forças de ruptura mais prováveis em uma determinada taxa de carregamento. Esses valores foram então ajustados ao modelo Bell-Evans, cujo ajuste forneceu valores para Koff e delta X, que se mostraram em bom acordo com resultados previamente publicados. Uma vez dominada, a parte experimental desta técnica pode ser realizada em oito a nove horas.

Após este procedimento, a mutagênese direcionada pode ser realizada em um experimento subsequente para determinar os aminoácidos cruciais para a ligação, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biofísica de molécula única explorarem as paisagens de dobramento proteico. Utilizamos esse método para estudar as propriedades mecânicas das SOEs de celulose, que estão entre os sistemas proteicos mais mecanicamente estáveis conhecidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar espectroscopia de força em nível de molécula única em pares de receptor proteico e ligante.