Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

O objetivo geral do experimento a seguir é medir quantitativamente a migração de células circulantes em direção a um gradiente de quimiocina. Em condições de estresse cisalhante fisiológico, isso é alcançado primeiramente cultivando uma monocamada de células endoteliais sobre inserts microporosos revestidos com colágeno e, em seguida, montando-os em uma câmara de fluxo, onde cobrem um compartimento estático separado contendo quimiocinas. Em seguida, aplica-se estresse cisalhante às células para simular as condições fisiológicas na vasculatura.

Como um segundo passo, células de interesse, como células-tronco, leucócitos ou células tumorais, são permitidas circular no sistema 3D durante a perfusão. Os componentes no compartimento estático influenciam a eficiência das interações entre as células circulantes e as células endoteliais, e consequentemente a taxa de transmigração das células-teste através da camada endotelial. Em seguida, o sistema 3D é desmontado e as células-teste transmigradas são coletadas do compartimento estático inferior, a fim de quantificar a migração celular utilizando diversos métodos de última geração. São obtidos resultados que demonstram a capacidade das células-teste circulantes de interagir com células endoteliais sob condições de fluxo fisiológico e sair da circulação com base na concentração de quimiocinas no compartimento estático.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de câmaras de fluxo laminar paralelo e ensaios de transferência estática, é que ela combina tanto o estresse cisalhante no compartimento superior quanto o gradiente quimiotático no compartimento inferior estático. Isso permite aos pesquisadores medir quantitativamente a externalização de células circulantes em direção ao gradiente quimiotático e sob condições de fluxo fisiológico. Este método também pode ser utilizado para estudar o efeito da comunicação cruzada entre as células do microambiente local e as células endoteliais na extravasação de células circulantes.

Auxiliando uma camada adicional de células em um inserto separado abaixo das células endoteliais, demonstrando o procedimento será Valentina contra Rova, uma técnica do meu laboratório. Para começar, calcule o número de insertos necessários para o experimento e coloque cada inserto em uma placa de Petri estéril separada. Esterilize-os por irradiação gama até que a dose total atinja 11 gray, com base nos arranjos individuais.

Em seguida, dilua o colágeno estoque. Dilua a solução do tipo I a 50 microgramas por mililitro utilizando ácido clorídrico 0,01 molar armazenado a quatro graus Celsius e prepare alíquotas de 154 microlitros da solução final para cada inserto. A seguir, coloque várias gotas de um Eloqua sobre a superfície do inserto em um padrão circular.

Em seguida, adicione o restante da alíquota para formar uma grande gota na superfície do inserto. Certifique-se de que a ponta da pipeta não toque o inserto em nenhum momento e de que o colágeno cubra toda a superfície do inserto, sem escorrer. Uma vez que o inserto esteja coberto, coloque a tampa na placa de Petri e posicione-a cuidadosamente sobre uma superfície plana.

Incube as inserções por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, aspire a solução de colágeno e lave a membrana com 160 microlitros de PBS. Em seguida, aspire o PBS. Substitua a tampa e enrole o recipiente com parafilm.

Se os insertos forem utilizados no mesmo dia, coloque a placa de Petri em um local seco à temperatura ambiente. Caso contrário, mantenha a placa a quatro graus Celsius e utilize o inserto dentro de sete dias. Colete as células endoteliais de veia umbilical humana cultivadas imediatamente antes do uso e re suspenda-as no meio de cultura desejado a 2,5 milhões de células por mililitro.

Ao contar as células, certifique-se de que a viabilidade celular seja superior a 98% utilizando azul de tripano, então adicione 160 microlitros da suspensão celular em cada inserto. Primeiro, coloque várias gotas pequenas sobre a superfície do inserto revestido com colágeno em formato circular e, em seguida, adicione cuidadosamente o restante da suspensão celular para formar uma única gota grande. Ao finalizar, recoloque as tampas e coloque cuidadosamente as placas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e incube por 30 minutos para permitir que as células adiram à membrana.

Após 30 minutos, retire as placas do incubador e adicione cuidadosamente cinco mililitros de meio de cultura pré-aquecido sobre cada inserto. Tendo o cuidado de garantir que o inserto permaneça no fundo do recipiente e seja completamente coberto pelo meio. Em seguida, recoloque as tampas e devolva cuidadosamente os recipientes ao incubador para continuação da cultura.

As células a 37 graus Celsius durante a noite. Para montar a câmara de fluxo primeiro, parafuse as placas superior e inferior. Em seguida, conecte as placas à unidade de troca de gás usando tubo de PVC com diâmetro interno de 1,42 milímetro e paredes de 0,8 milímetro de espessura.

Em seguida, coloque o dispositivo montado em um saco plástico limpo e esterilize-o por irradiação gama até que a dose total atinja 11 gray. O próximo passo é remover uma bandeja de incubadora, colocá-la em uma câmara de cultura estéril e esterilizá-la com etanol 70%. Em seguida, cubra a bandeja com um lenço estéril grande.

Em seguida, remova o dispositivo do saco plástico e coloque-o na bandeja estéril do incubador. Depois, conecte o dispositivo à bomba peristáltica e programe a bomba para funcionar na velocidade de 0,2 mililitros por minuto. Pipete de cinco a sete mililitros do meio de cultura desejado em um tubo estéril de 15 mililitros para ser usado como entrada.

Em seguida, desconecte o tubo de entrada da saída puxando a agulha metálica do tubo utilizando pequenos panos estéreis para manter a esterilidade do tubo, coloque a agulha metálica de entrada no tubo de 15 mililitros com o meio e posicione o tubo de saída no tubo de 15 mililitros vazio. A seguir, ligue a bomba, de modo que o fluxo seja no sentido anti-horário. Permita que a pressão negativa aspire o meio do tubo de entrada de 15 mililitros para dentro do tubo e pare a bomba quando o meio atingir a extremidade do tubo, logo antes de entrar no dispositivo.

Em seguida, abra o dispositivo desparafusando as placas do tubo e remova cuidadosamente com uma pipeta a placa superior, transferindo de 1500 a 1.550 microlitros de meio para os poços inferiores, certificando-se de que os poços contenham quantidade suficiente de meio para formar um hemisfério que atinja um a dois milímetros acima da placa inferior. Em seguida, transfira os insertos preparados das placas de Petri para os poços da placa inferior. Utilizando uma pinça estéril, certifique-se de que não haja bolhas aprisionadas sob os insertos e aspire qualquer meio que apareça na superfície da placa inferior.

Em seguida, recoloque a placa superior sobre a placa inferior e reconecte-as. Usando os parafusos, ligue imediatamente a bomba peristáltica e permita que o meio flua através do dispositivo 3D. Eleve a extremidade de saída do dispositivo e mantenha a câmara nesta posição para evitar a formação de bolhas no espaço entre as placas.

Continue preenchendo o tubo que conecta a câmara à unidade de troca de gás com meio até que este alcance a unidade de troca de gás. Em seguida, coloque três mililitros de meio na unidade de troca de gás. Ligue a bomba e permita que as bolhas de ar escapem através dela.

Eleva a unidade para permitir que o meio preencha o tubo que dela sai e pare a bomba quando o meio estiver a dois ou três centímetros do final. Após completa priming, conecte a agulha de entrada ao tubo de saída utilizando pequenos panos estéreis. Em seguida, inverta a bomba para que o meio flua no sentido horário em direção à unidade de troca gasosa e certifique-se de que todas as bolhas de ar remanescentes sejam removidas.

Com a bomba novamente fluindo no sentido anti-horário, adicione 100 microlitros da suspensão de células-teste à unidade de troca gasosa. Em seguida, feche a tampa do respirador.

Coloque a bandeja de volta no incubador e permita que as células-teste circulem no dispositivo a 37 graus Celsius. Após o tempo desejado, remova a bandeja com o sistema em funcionamento do incubador e coloque-a na câmara de fluxo laminar. Pare a bomba, desconecte a entrada e a saída e coloque as extremidades em tubos estéreis vazios de 15 mililitros.

Em seguida, ligue a bomba e colete a suspensão celular do sistema. Coloque a suspensão celular sobre gelo até o uso. A seguir, desmonte a câmara removendo os parafusos e levantando a placa superior.

Remova os inserts da placa inferior e transfira-os para placas de Petri para coloração ou coleta de células. Por fim, remova a suspensão celular dos poços inferiores e coloque-a em tubos de 15 mililitros. Lave cada poço duas vezes com 1,5 mililitro de meio e adicione ao tubo respectivo.

Em seguida, centrifugue os tubos por cinco minutos a 200 Gs e processe as células de acordo com os objetivos experimentais específicos, como os listados no protocolo textual apresentado. Aqui há um exemplo de um dos muitos testes que podem ser realizados utilizando este sistema. A montagem consiste em células endoteliais derivadas da medula óssea cultivadas em inserts com poros de cinco mícrons, com o fator um derivado de células estromais, ou SDF um, adicionado abaixo dos inserts nas concentrações de zero, cinco ou 50 nanogramas por mililitro.

Deixou-se que as células da medula óssea circulassem no sistema 3D. As células que migraram através do inserto foram coletadas e então cultivadas em placas com meio de metilcelulose. Na presença de fatores de crescimento hematopoiéticos que induzem as células progenitoras a formar colônias, o número de colônias foi contabilizado 14 dias depois para determinar a quantidade de progenitores em cada poço e revelar sua capacidade de migrar em direção ao sdf.

Um sob condições de fluxo fisiológico. Com a adição de fibroblastos estromais cultivados no inserto inferior na câmara estática, mais células hematopoéticas migraram da circulação para a câmara com a adição de sdf, um a 50 nanogramas por mililitro, do que com apenas SDF um sozinho após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em diferentes áreas das ciências médicas e biológicas modelarem leitos vasculares específicos de tecidos in vitro e explorarem mecanismos celulares e moleculares que mediam a migração de células circulantes em direção a tecidos normais versus doentes.