Isolando Ácidos Nucleicos de Levedura

Isolating Nucleic Acids from Yeast

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Isolating Nucleic Acids from Yeast

3.2: Drosophila Maintenance

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06:49 min

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May 10, 2013

Overview

Uma das muitas vantagens do uso de levedura como sistema modelo é que grandes quantidades de biomacromléculas, incluindo ácidos nucleicos (DNA e RNA), podem ser purificadas a partir das células cultivadas.

Este vídeo abordará as etapas necessárias para realizar a extração de ácido nucleico. Começaremos delineando brevemente o crescimento e a colheita, e a lise das células de levedura, que são os passos iniciais comuns ao isolamento de todas as biomacromoleculas. Em seguida, discutiremos dois métodos únicos de purificação para a separação de ácidos nucleicos: ligação de coluna e separação de fases. Além disso, demonstraremos várias maneiras pelas quais esses métodos são aplicados em laboratório, incluindo a preparação de ácidos nucleicos para técnicas de biologia molecular, como PCR e manchas do sul, quantificação da expressão genética em resposta a estímulos ambientais e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes.

Procedure

Hoje vamos mostrar como purificar ácidos nucleicos de Saccharomyces cerevisiae, também conhecido como levedura de padeiro. Ácidos nucleicos podem incluir DNA ou RNA. Este vídeo discutirá o isolamento dessas moléculas das células de levedura por separação de fases e cromatografia.

Embora existam muitos métodos diferentes para purificar ácidos nucleicos da levedura, a maioria deles compartilha os mesmos passos iniciais.

As células de levedura são primeiramente propagadas selecionando uma única colônia de uma placa e inoculando na mídia YPD. A mistura deve ser cultivada durante a noite a 30 °C em uma incubadora agitada ou rotativa.

As células de levedura devem ser colhidas na fase de crescimento do registro médio para otimizar o rendimento. A levedura na fase de registro de crescimento geralmente terá uma densidade óptica ou valor “OD” de 0,5-1 quando medido em um comprimento de onda de 600 nm. Uma vez que as células atingiram a densidade óptica apropriada, elas são centrifadas para formar uma pelota, e resuspended em tampão de lise para que as células sejam quebradas.

Um dos aspectos mais desafiadores de isolar ácidos nucleicos da levedura é interromper suas paredes celulares resistentes. Paredes celulares podem ser destruídas com uma combinação de técnicas enzimáticas e físicas. A destruição da parede celular faz com que a levedura forme células esferoides chamadas esferoplastos que podem ser lísedas através de técnicas padrão de lise celular.

Os esferoplastos são tipicamente lysed com detergentes químicos, como sulfato de dodecyl de sódio ou SDS, que lise membranas celulares. As células também podem ser homogeneizadas. Por exemplo, contas de vidro podem ser adicionadas às células e células homogeneizadas pelo vórtice. Ou paredes celulares podem ser interrompidas com som de alta frequência, usando um sonicator, para ajudar no processo de lise.

Como mencionado todos os procedimentos de purificação de ácido nucleico feitos na levedura terão etapas semelhantes para o crescimento, colheita e levedura, no entanto, uma vez que as células são lised, vários métodos diferentes podem ser usados para isolar ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos podem ser purificados através da ligação da coluna ou da separação de fases.

DNA e RNA são mais isolados usando a ligação da coluna de sílica. Os ácidos nucleicos se ligarão à coluna através da troca de íons e podem ser elucidos da coluna uma vez separados de outros componentes celulares.

A separação de fases usa o princípio de que soluções com diferentes propriedades podem ser usadas para purificar ou concentrar certas proteínas ou ácidos nucleicos com base em sua solubilidade. A adição de clorofórmio diferencia um chorume de componentes celulares em duas fases diferentes, a aquosa e orgânica. A fase orgânica contém proteínas enquanto a fase dos aqueos contém ácidos nucleicos. O DNA pode então ser precipitado a partir da fase orgânica com a adição de etanol.

Os ácidos nucleicos podem ser isolados da levedura usando um protocolo de ligação de coluna. Primeiro, as células são cultivadas e colhidas por centrifugação.

O supernante é removido e descartado enquanto a pelota celular é resuspended em tampão contendo enzimas, vórtice e incubado até que as paredes celulares sejam digeridas. A digestão da parede celular e a formação de spheroplast podem ser verificadas com microscopia ao otimizar o tratamento enzimante. Após a digestão da parede celular, o tampão de lise é adicionado às células e a mistura é vórtice.

As células líficas devem ser centrifuadas para esclarecer a mistura de detritos, deixando DNA e pequenas partículas e proteínas solúveis no sobrenante. O supernante é carregado em uma coluna de sílica e os ácidos nucleicos são então permitidos a se ligar após a centrifugação, que removerá uma maior parte das impurezas solúveis.

As etapas de lavagem são realizadas com etanol ou tampão de sal alto para remover impurezas residuais dos ácidos nucleicos ligados. Finalmente, o DNA ou RNA é elucido com água ou um tampão baixo em sal. Certifique-se de usar um tampão ou água livre das enzimas DNAse e RNAse.

Ácidos nucleicos isolados da levedura têm uma variedade de usos dependendo do seu objetivo experimental específico. O DNA isolado da levedura pode ser usado para uma série de diferentes técnicas de biologia molecular, incluindo: PCR, mancha do sul ou digestão enzimática de restrição.

Mudanças na expressão genética podem ser identificadas por um processo conhecido como análise de microarray, que usa matrizes genéticas como esta.

Se tivermos duas culturas de levedura, uma exposta ao peróxido de hidrogênio e outra um controle, o mRNA pode ser isolado dessas culturas e hibridizado em slides de microarray. Os slides são analisados e os genes que são modificados pelo estresse oxidativo podem ser identificados.

Neste vídeo, pesquisadores fazem uso de um sistema robótico para preparar uma biblioteca de mutantes de levedura em todo o genoma, que são usados para avaliar a função genética. Devido à inserção de sequências especificamente modificadas, chamadas de códigos de barras genéticos, em genes de DNA genômico de cepas mutantes podem ser extraídos de 4.000 a 6.000 indivíduos simultaneamente e submetidos à análise de microarray ou sequenciamento. Com base na abundância relativa das sequências de código de barras, a aptidão de cada mutante pode ser determinada sob múltiplas condições experimentais.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre isolar ácidos nucleicos de levedura. Agora você deve entender os aspectos básicos da purificação de ácidos nucleicos como preparar células de levedura para lise e como realizar diferentes procedimentos de extração e isolamento. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Today we will be showing you how to purify nucleic acids from Saccharomyces cerevisiae, also known as baker’s yeast. Nucleic acids can include DNA or RNA. This video will discuss the isolation of these molecules from yeast cells by phase separation and chromatography.

Though many different methods exist to purify nucleic acids from yeast, most of them share the same initial steps.

Yeast cells are first propagated by selecting a single colony from a plate and inoculating into YPD media. The mixture should be grown overnight at 30 °C in a shaking or rotating incubator.

Yeast cells should be harvested in the mid-log phase of growth to optimize yield. Yeast in the log phase of growth will usually have an optical density or “OD” value of 0.5-1 when measured at a wavelength of 600 nm. Once cells have reached the appropriate optical density, they are centrifuged to form a pellet, and resuspended in lysis buffer so that cells are broken open.

One of the most challenging aspects of isolating nucleic acids from yeast is disrupting its tough cell walls. Cell walls can be destroyed with a combination of enzymatic and physical techniques. The destruction of the cell wall causes yeast to form spheroid cells called spheroplasts that can be lysed via standard cell lysis techniques.

Spheroplasts are typically lysed with chemical detergents such as sodium dodecyl sulfate or SDS, which lyse cellular membranes. Cells can also be homogenized. For instance, glass beads can be added to cells and cells homogenized by vortexing. Or cell walls can be disrupted with ultra-high frequency sound, using a sonicator, to aid in the lysis process.

As mentioned all nucleic acid purification procedures done in yeast will have similar steps for growing up, harvesting, and lysing yeast cells, however once cells are lysed, several different methods can be used to isolate nucleic acids. Nucleic acids can be purified through column binding or phase separation.

DNA and RNA are best-isolated using silica column binding. Nucleic acids will bind to the column through anion exchange and can be eluted from the column once separated from other cellular components.

Phase separation uses the principle that solutions with different properties can be used to purify or concentrate certain proteins or nucleic acids based on their solubility. The addition of chloroform differentiates a slurry of cell components into two different phases, the aqueous and organic. The organic phase contain proteins while the aqueos phase contains nucleic acids. The DNA can then be precipitated from the organic phase with the addition of ethanol.

Nucleic acids can be isolated from yeast using a column binding protocol. First, cells are grown up and harvested by centrifugation.

The supernatant is removed and discarded while the cell pellet is resuspended in enzyme-containing buffer, vortexed, and incubated until cell walls are digested. Cell wall digestion and spheroplast formation can be verified with microscopy when optimizing enzyme treatment. After cell wall digestion, lysis buffer is added to the cells and the mixture is vortexed.

The lysed cells should be centrifuged to clarify the mixture of debris, leaving DNA and small particulates and soluble proteins in the supernatant. The supernatant is loaded onto a silica column and nucleic acids are then allowed to bind following centrifugation, which will remove a bulk of the soluble impurities.

Washing steps are performed with ethanol or high salt buffer to remove residual impurities from the bound nucleic acids. Finally, the DNA or RNA is eluted with water or a buffer low in salt. Be sure to use a buffer or water that is free of the enzymes DNAse and RNAse.

Nucleic acids isolated from yeast have a variety of uses depending on your specific experimental goal. DNA isolated from yeast can be used for a number of different molecular biology techniques including: PCR, southern blotting, or restriction enzyme digestion.

Changes in gene expression can be identified by a process known as microarray analysis, which uses gene arrays like this one.

If we have two yeast cultures, one exposed to hydrogen peroxide and one a control, mRNA can be isolated from these cultures and hybridized on microarray slides. The slides are analyzed and the genes that are modified by oxidative stress can be identified.

In this video, researchers make use of a robotic system to prepare a library of genome-wide yeast mutants, which are used to evaluate gene function. Due to the insertion specifically-engineered sequences, called genetic barcodes, into genes genomic DNA from mutant strains can be extracted from 4,000 to 6,000 individuals simultaneously and subjected to microarray analysis or sequencing. Based on the relative abundance of the barcode sequences, the fitness, of each mutant can be determined under multiple experimental conditions.

You’ve just watched JoVE’s video on isolating nucleic acids from yeast. You should now understand the basic aspects of purifying nucleic acids such how to prepare yeast cells for lysis and how to perform different extraction and isolation procedures. As always, thanks for watching!

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