3.10: Isolando Ácidos Nucleicos de Levedura

Hoje mostraremos como purificar ácidos nucléicos de Saccharomyces cerevisiae, também conhecida como levedura de padeiro. Os ácidos nucléicos podem incluir DNA ou RNA. Este vídeo discutirá o isolamento dessas moléculas de células de levedura por separação de fases e cromatografia.

Embora existam muitos métodos diferentes para purificar ácidos nucléicos de leveduras, a maioria deles compartilha as mesmas etapas iniciais.

As células de levedura são primeiro propagadas selecionando uma única colônia de uma placa e inoculando em meio YPD. A mistura deve ser cultivada durante a noite a 30 ? C em uma incubadora agitada ou giratória.

As células de levedura devem ser colhidas na fase intermediária de crescimento para otimizar o rendimento. A levedura na fase logarítmica de crescimento geralmente terá uma densidade óptica ou valor "OD" de 0,5-1 quando medido em um comprimento de onda de 600 nm. Uma vez que as células tenham atingido a densidade óptica apropriada, elas são centrifugadas para formar um pellet e ressuspensas em tampão de lise para que as células sejam abertas.

Um dos aspectos mais desafiadores do isolamento de ácidos nucléicos da levedura é interromper suas paredes celulares resistentes. As paredes celulares podem ser destruídas com uma combinação de técnicas enzimáticas e físicas. A destruição da parede celular faz com que a levedura forme células esferóides chamadas esferoplastos, que podem ser lisadas por meio de técnicas padrão de lise celular.

Os esferoplastos são normalmente lisados com detergentes químicos, como dodecil sulfato de sódio ou SDS, que lisam as membranas celulares. As células também podem ser homogeneizadas. Por exemplo, contas de vidro podem ser adicionadas a células e células homogeneizadas por vórtice. Ou as paredes celulares podem ser interrompidas com som de frequência ultra-alta, usando um sonicador, para auxiliar no processo de lise.

Como mencionado, todos os procedimentos de purificação de ácidos nucleicos feitos em leveduras terão etapas semelhantes para crescer, colher e lisar células de levedura, no entanto, uma vez que as células são lisadas, vários métodos diferentes podem ser usados para isolar ácidos nucléicos. Os ácidos nucléicos podem ser purificados por meio de ligação em coluna ou separação de fases.

O DNA e o RNA são melhor isolados usando a ligação da coluna de sílica. Os ácidos nucléicos se ligam à coluna por meio da troca aniônica e podem ser eluídos da coluna uma vez separados de outros componentes celulares.

A separação de fases usa o princípio de que soluções com propriedades diferentes podem ser usadas para purificar ou concentrar certas proteínas ou ácidos nucléicos com base em sua solubilidade. A adição de clorofórmio diferencia uma pasta de componentes celulares em duas fases diferentes, a aquosa e a orgânica. A fase orgânica contém proteínas, enquanto a fase aquosa contém ácidos nucléicos. O DNA pode então ser precipitado da fase orgânica com a adição de etanol.

Os ácidos nucléicos podem ser isolados da levedura usando um protocolo de ligação em coluna. Primeiro, as células são cultivadas e colhidas por centrifugação.

O sobrenadante é removido e descartado enquanto o pellet celular é ressuspenso em tampão contendo enzima, vórtice e incubado até que as paredes celulares sejam digeridas. A digestão da parede celular e a formação de esferoplastos podem ser verificadas com microscopia ao otimizar o tratamento enzimático. Após a digestão da parede celular, o tampão de lise é adicionado às células e a mistura é vórtice.

As células lisadas devem ser centrifugadas para clarificar a mistura de detritos, deixando o ADN e as pequenas partículas e proteínas solúveis no sobrenadante. O sobrenadante é carregado em uma coluna de sílica e os ácidos nucléicos podem então se ligar após a centrifugação, o que removerá uma grande parte das impurezas solúveis.

As etapas de lavagem são realizadas com etanol ou tampão com alto teor de sal para remover as impurezas residuais dos ácidos nucléicos ligados. Finalmente, o DNA ou RNA é eluído com água ou um tampão com baixo teor de sal. Certifique-se de usar um tampão ou água livre das enzimas DNAse e RNAse.

Os ácidos nucléicos isolados da levedura têm uma variedade de usos, dependendo do seu objetivo experimental específico. O DNA isolado da levedura pode ser usado para várias técnicas diferentes de biologia molecular, incluindo: PCR, southern blotting ou digestão de enzimas de restrição.

Mudanças na expressão gênica podem ser identificadas por um processo conhecido como análise de microarray, que usa arrays de genes como este.

Se tivermos duas culturas de levedura, uma exposta ao peróxido de hidrogênio e outra um controle, o mRNA pode ser isolado dessas culturas e hibridizado em lâminas de microarray. As lâminas são analisadas e os genes modificados pelo estresse oxidativo podem ser identificados.

Neste vídeo, os pesquisadores fazem uso de um sistema robótico para preparar uma biblioteca de mutantes de levedura em todo o genoma, que são usados para avaliar a função do gene. Devido à inserção de sequências especificamente projetadas, chamadas de códigos de barras genéticos, em genes, o DNA genômico de cepas mutantes pode ser extraído de 4.000 a 6.000 indivíduos simultaneamente e submetido a análise ou sequenciamento de microarray. Com base na abundância relativa das sequências de código de barras, a aptidão de cada mutante pode ser determinada sob várias condições experimentais.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre o isolamento de ácidos nucléicos de leveduras. Agora você deve entender os aspectos básicos da purificação de ácidos nucléicos, como preparar células de levedura para lise e como realizar diferentes procedimentos de extração e isolamento. Como sempre, obrigado por assistir!