Isolando Ácidos Nucleicos de Levedura

Hoje vamos mostrar como purificar ácidos nucleicos de Saccharomyces cerevisiae, também conhecido como levedura de padeiro. Ácidos nucleicos podem incluir DNA ou RNA. Este vídeo discutirá o isolamento dessas moléculas das células de levedura por separação de fases e cromatografia.

Embora existam muitos métodos diferentes para purificar ácidos nucleicos da levedura, a maioria deles compartilha os mesmos passos iniciais.

As células de levedura são primeiramente propagadas selecionando uma única colônia de uma placa e inoculando na mídia YPD. A mistura deve ser cultivada durante a noite a 30 °C em uma incubadora agitada ou rotativa.

As células de levedura devem ser colhidas na fase de crescimento do registro médio para otimizar o rendimento. A levedura na fase de registro de crescimento geralmente terá uma densidade óptica ou valor "OD" de 0,5-1 quando medido em um comprimento de onda de 600 nm. Uma vez que as células atingiram a densidade óptica apropriada, elas são centrifadas para formar uma pelota, e resuspended em tampão de lise para que as células sejam quebradas.

Um dos aspectos mais desafiadores de isolar ácidos nucleicos da levedura é interromper suas paredes celulares resistentes. Paredes celulares podem ser destruídas com uma combinação de técnicas enzimáticas e físicas. A destruição da parede celular faz com que a levedura forme células esferoides chamadas esferoplastos que podem ser lísedas através de técnicas padrão de lise celular.

Os esferoplastos são tipicamente lysed com detergentes químicos, como sulfato de dodecyl de sódio ou SDS, que lise membranas celulares. As células também podem ser homogeneizadas. Por exemplo, contas de vidro podem ser adicionadas às células e células homogeneizadas pelo vórtice. Ou paredes celulares podem ser interrompidas com som de alta frequência, usando um sonicator, para ajudar no processo de lise.

Como mencionado todos os procedimentos de purificação de ácido nucleico feitos na levedura terão etapas semelhantes para o crescimento, colheita e levedura, no entanto, uma vez que as células são lised, vários métodos diferentes podem ser usados para isolar ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos podem ser purificados através da ligação da coluna ou da separação de fases.

DNA e RNA são mais isolados usando a ligação da coluna de sílica. Os ácidos nucleicos se ligarão à coluna através da troca de íons e podem ser elucidos da coluna uma vez separados de outros componentes celulares.

A separação de fases usa o princípio de que soluções com diferentes propriedades podem ser usadas para purificar ou concentrar certas proteínas ou ácidos nucleicos com base em sua solubilidade. A adição de clorofórmio diferencia um chorume de componentes celulares em duas fases diferentes, a aquosa e orgânica. A fase orgânica contém proteínas enquanto a fase dos aqueos contém ácidos nucleicos. O DNA pode então ser precipitado a partir da fase orgânica com a adição de etanol.

Os ácidos nucleicos podem ser isolados da levedura usando um protocolo de ligação de coluna. Primeiro, as células são cultivadas e colhidas por centrifugação.

O supernante é removido e descartado enquanto a pelota celular é resuspended em tampão contendo enzimas, vórtice e incubado até que as paredes celulares sejam digeridas. A digestão da parede celular e a formação de spheroplast podem ser verificadas com microscopia ao otimizar o tratamento enzimante. Após a digestão da parede celular, o tampão de lise é adicionado às células e a mistura é vórtice.

As células líficas devem ser centrifuadas para esclarecer a mistura de detritos, deixando DNA e pequenas partículas e proteínas solúveis no sobrenante. O supernante é carregado em uma coluna de sílica e os ácidos nucleicos são então permitidos a se ligar após a centrifugação, que removerá uma maior parte das impurezas solúveis.

As etapas de lavagem são realizadas com etanol ou tampão de sal alto para remover impurezas residuais dos ácidos nucleicos ligados. Finalmente, o DNA ou RNA é elucido com água ou um tampão baixo em sal. Certifique-se de usar um tampão ou água livre das enzimas DNAse e RNAse.

Ácidos nucleicos isolados da levedura têm uma variedade de usos dependendo do seu objetivo experimental específico. O DNA isolado da levedura pode ser usado para uma série de diferentes técnicas de biologia molecular, incluindo: PCR, mancha do sul ou digestão enzimática de restrição.

Mudanças na expressão genética podem ser identificadas por um processo conhecido como análise de microarray, que usa matrizes genéticas como esta.

Se tivermos duas culturas de levedura, uma exposta ao peróxido de hidrogênio e outra um controle, o mRNA pode ser isolado dessas culturas e hibridizado em slides de microarray. Os slides são analisados e os genes que são modificados pelo estresse oxidativo podem ser identificados.

Neste vídeo, pesquisadores fazem uso de um sistema robótico para preparar uma biblioteca de mutantes de levedura em todo o genoma, que são usados para avaliar a função genética. Devido à inserção de sequências especificamente modificadas, chamadas de códigos de barras genéticos, em genes de DNA genômico de cepas mutantes podem ser extraídos de 4.000 a 6.000 indivíduos simultaneamente e submetidos à análise de microarray ou sequenciamento. Com base na abundância relativa das sequências de código de barras, a aptidão de cada mutante pode ser determinada sob múltiplas condições experimentais.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre isolar ácidos nucleicos de levedura. Agora você deve entender os aspectos básicos da purificação de ácidos nucleicos como preparar células de levedura para lise e como realizar diferentes procedimentos de extração e isolamento. Como sempre, obrigado por assistir!