Name: Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a investigar o papel das isozimas lipoxigenase na degeneração nigroestriatal relacionada à doença de Parkinson usando camundongos deficientes em LOX. Este método revela funções isoformas-específicas e interações gene-ambiente.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIGMS 056062.

Não há nada para revelar.

O projeto deste estudo de interação gene-ambiente nos permitiu obter novas informações sobre a dupla natureza da isozyme 5-LOX na via nigrostriatal. Ao realizar o HPLC para medir as monoaminas estriais após o tratamento salino ou MPTP em transgênicos sem a isozice de 5-LOX e seus ninhadas de tipo selvagem, pudemos notar que sua deficiência parece ser protetora em condições tóxicas(Figura 1),mas em condições normais, a falta da enzima reduz os níveis de dopamina striatal e pode ser deletério. Assim, podem...

O uso de modelos de interação gene-ambiente fornece uma abordagem para imitar fatores de risco que provavelmente influenciam a doença idiopática de Parkinson (DP) e oferece a oportunidade de discernir insights mecanicistas que dificilmente serão elucidados pelo uso de um sistema genético ou toxicantesozinho 1,2. Aqui ilustramos este ponto e descrevemos a aplicação do modelo de camundongos 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) modelo de degeneração nigrostriatal3 para entender melhor a seletividade da atividade de isozínia lipoxygenase (LOX) sobre neuroinflamação e toxicidade4. Embora um papel para isozymes LOX tenha sido amplamente avaliado em distúrbios periféricos5,6, bem como doença de SNC, incluindo AVC7 e Doença de Alzheimer8,9, o papel da família de isozymes na função nigrostriatal e degeneração relacionada à DPN não é bem compreendido e merece estudo. A neurotoxina MPTP demonstra degeneração preferencial da via nigrostriatal e recapitula o esgotamento da dopamina sttartal e a perda de células dopaminérgicas nigral que sustentam prejuízos motoricos em pacientes com DP10. Embora este modelo não reproduza o quadro completo de comportamentos de DP não motor e motor e patologia corporal lewy α-sinuclein-positiva, tem sido útil para elucidar novos alvos mecanicistas que contribuem para danos nigrostriais e para testes translacionais em estágio inicial, pois é o modelo não invasivo mais bem caracterizado disponível para produzir de forma confiável a morte celular nigral acompanhada pela perda de dopamina striatal11-15. O uso amplo do camundongo MPTP, com paradigmas que vão do agudo, subaguto ao crônico16-18,permitiu que a padronização da dosagem resultasse em danos leves a graves de nigrostriatal19,20 com ativação de diferentes mecanismos de toxicidade dependendo do regime de tratamentonº 18,21,22. Consequentemente, isso permite que seja direcionada uma "janela de lesão" que pode resultar em lesão nigrostriatal aprimorada ou reduzida, dependendo do agente terapêutico ou modelo transgênico utilizado23-25.
Também essenciais para estudos de biologia translacional e de descoberta são as técnicas utilizadas para avaliar danos e as evidências que tais métodos fornecem. Para o modelo de mouse MPTP, Métricas estabelecidas para avaliar a lesão são a medição de marcadores de tom dopaminérgico estriatal, incluindo dopamina e seus metabólitos pelo HPLC, e análise de manchas ocidentais de hidroxilase tyrosina (TH), a enzima que limita a taxa na síntese de dopamina, e indicadores de eventos degenerativos como a ativação glial utilizando análise de manchas ocidentais e imunohistoquímica4. Embora sejam procedimentos neuroquímicos clássicos, bioquímicos e histológicos, as técnicas fornecem leituras críticas e reprodutíveis sobre a extensão dos danos dentro da via nigrostriatal dopaminérgica, indicam mecanismos de toxicidade e provaram ser ferramentas valiosas na compreensão de eventos degenerativos em DP.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP-HCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0896</td><td>para modelagem de DP</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído (paraformaldeído) a 4%, tamponado com fosfato (PFA)</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>BUP0157</td><td>para fixação por imersão Reagente</td></tr><tr><td>ACS de ácido perclórico, 70% (PCA)</td><td>244252 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>para extração</td></tr> <tr><td>de ácido HPLCTris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>para homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>para homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>para homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de fosfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5726</td><td>para homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>para ensaio de proteína Lowry</td></tr><tr><td>Sacarose, biologia molecular, &ge; 99,5% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>para crioproteção</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, pó, pH 7,4 (para PBS 0,01 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>para</td></tr><tr><td>kit de ensaio de proteína IHC BCA</td><td>Pierce/Thermo</td><td>23225</td><td>para determinação de proteína</td></tr><tr><td>Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12 poços</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EC60052BOX</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Amostra Tampão (4x)</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Novex Sharp Prestained Protein Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5800</td><td>escada de proteína</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio, eletroforese, 98,5% (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Álcool Metílico, Anidro, Reagente&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>SPM1057C</td><td>metanol para transferência</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl), reagente ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>solução salina e tampões</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado Cravo</td><td></td><td>n/a</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Solução de Ponceau S em ácido acético a 5%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-Tirosina Hidroxilase (TH), ovelha policlonal</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB1542</td><td>para imunofluorescência&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-tirosina hidroxilase (TH), produtos biológicos policlonais</td><td>P40101-0</td> de <td>Pel-Freez</td> do coelho <td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; Actina, coelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2066</td><td>para imunotransferência de imunotransferência</td></tr><tr><td>Proteína Ácida Fibrilar Anti-Glial (GFAP), coelho policlonal</td><td>Chemicon / Millipore</td><td>AB5804</td><td>para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Proteína Ácida Fibrilar Anti-Glial (GFAP), camundongo monoclonal</td><td>Covance Inc.</td><td>SMI-22R</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugada&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>31462</td><td>para imunofluorescência</td></tr><tr><td>de cabra anti-ovelha, peroxidase conjugada</td><td>Pierce / Thermo</td><td>31480</td><td>para imunofluorescência</td></tr><tr><td>cabra anti-mouse, peroxidase conjugada</td><td>Pierce / Thermo</td><td>31430</td><td>para imunofluorescência</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente</td><td>Pierce / Thermo</td><td>34078</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>CL-XPosure Filme 7 pol x 9,5 pol&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34089</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>21059</td><td>para immunoblotting</td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado, reagente ACS, &ge; 99,0%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Soro de Burro Normal</td><td>Millipore</td><td>S30-100ML</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288</td><td>para</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino IHC (BSA), liofilizado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-01</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de burro, Alexa Fluor 568-rotulado&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A10042</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-095-147</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Millipore</td><td>S26-100ML</td><td>para IHC</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4001</td><td>para IHC; 10 &micro; l cada uma das soluções A e B por 1 ml de PBS (de acordo com as instruções) Kit de</td></tr> <tr><td>substrato de peroxidase DAB, 3,3'-diaminobenzidina</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>para IHC; por 5 ml de ddH2O, adicione 2 gotas de solução de estoque tampão, 2 gotas de DAB e 1 gota de H2O2 (H2 O2 é adicionado imediatamente antes do uso)</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>para etapa de têmpera em IHC</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Biocare Medicals</td><td>CP290A</td><td>para</td></tr><tr><td>IHC Cresyl Violet Solution, Força Regular&nbsp;</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PS102-01</td><td>contracoloração para Iba1 IHC</td></tr><tr><td>95% Etanol, álcool reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td>desidratação para IHC</td></tr><tr><td>100% Etanol absoluto</td><td>Mallinckrodt</td><td>7019-10</td><td>desidratação para IHC</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>descoloração para IHC</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>agente de limpeza para IHC</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522</td><td>meio de montagem para DAB IHC</td></tr><tr><td>O.C.T. Composto - Meio de Incorporação de Seção Congelada&nbsp;</td>Meio de embeddium <td>EMOCTCS</td> <td>da American MasterTech Scientific</td><td>para corte de criostato</td></tr><tr><td>Permanganato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>para descontaminar solução DAB</td></tr><tr><td>Cloridrato de dopamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>850217</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido homovanílico (HVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1252</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido perclórico (PCA) - 70%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71504</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido 1-octanossulfônico (OSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>O8380</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>Água destilada destilada de grau HPLC (ddH2O)</td><td>Millipore</td><td></td><td>para HPLC</td></tr><tr><td>0,22 e micro; m GSTF membrana</td><td>Millipore</td><td></td><td>para filtração</td></tr><tr><td>Corning Netwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3477</td><td>inserção de poliestireno com fundo de malha de poliéster, para IHC</td></tr><tr><td>Disruptor de células ultrassônico (Soniprep 150)</td><td>MSE</td><td>MSE.41371.274</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5414R</td><td></td></tr><tr><td>ESA MD-150 coluna de fase reversa&nbsp;</td>Bomba de HPLC <td>ESA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Ultimate 3000)</td><td>Amostrador automático de HPLC Dionex</td><td>ISO-3100BM</td><td></td></tr><tr><td>(Ultimate 3000)</td><td>Dionex</td><td>WPS-3000TSL</td><td></td></tr><tr><td>Detector eletroquímico</td><td>ESA</td><td>Coulochem III</td><td></td></tr><tr><td>Guard Cell</td><td>ESA</td><td>5020</td><td></td></tr><tr><td>Célula analítica</td><td>ESA</td><td>5011A</td><td></td></tr><tr><td>Software Chromeleon</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E400</td><td>Nikon</td><td>E400</td><td>microscópio de luz / fluorescente</td></tr><tr><td>Gaiola de rato descartável</td><td>Ancare</td><td>N10HT</td><td></td></tr><tr><td>Microfiltro superior</td><td>Ancare</td><td>N10MBT</td><td></td></tr><tr><td>5-LOX- camundongos deficientes</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>004155</td><td></td></tr><tr><td>12/15-LOX-camundongos deficientes</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>002778</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de parkinson

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

A atividade lipoxygenase (LOX) tem sido implicada em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, mas seus efeitos na patogênese da doença de Parkinson (DP) são menos compreendidos. Modelos de interação gene-ambiente têm utilidade em desmascarar o impacto de vias celulares específicas na toxicidade que podem não ser observadas usando apenas um modelo de doença genética ou toxicante. Para avaliar se isozymes LOX distintos contribuem seletivamente para a neurodegeneração relacionada à DP, os camundongos transgênicos(ou seja, 5-LOX e 12/15-LOX deficientes) podem ser desafiados com uma toxina que imita lesões celulares e morte na doença. Aqui descrevemos o uso de uma neurotoxina, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP), que produz uma lesão nigrostriatal para elucidar as distintas contribuições de isozimes LOX para neurodegeneração relacionada à DP. O uso de MPTP em camundongos, e primatas não humanos, é bem estabelecido para recapitular o dano nigrostriatal em DP. A extensão da lesão induzida pelo MPTP é medida pela análise hplc da dopamina e seus metabólitos e análise de manchas ocidentais semi-quantitativas de estriato para hidroxilase de tyrosina (TH), a enzima limitante de taxa para a síntese de dopamina. Para avaliar marcadores inflamatórios, que podem demonstrar sensibilidade lox isozyme-seletiva, proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) e imunohistoquímica Iba-1 são realizadas em seções cerebrais contendo nigra substantia, e a análise de manchas ocidentais GFAP é realizada em homogeneados estriais. Esta abordagem experimental pode fornecer novas percepções sobre as interações gene-ambiente subjacentes à degeneração nigrostriatal e DP.

Este paradigma de exposição à toxina pode produzir um esgotamento significativo e detectável de dopamina 20% em animais injetados por MPTP vs. soro fisiológico. É importante notar que diferentes lotes de MPTP podem produzir um pouco mais ou menos lesões; assim, para uma melhor precisão, recomenda-se um experimento preliminar em camundongos de tipo selvagem antes do uso em transgênicos quando um novo lote de neurotoxina é utilizado. O uso de lesões leves a moderadas permite observar o impacto do transgene; uma lesão grave...

Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.

Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

O objetivo geral do experimento a seguir é compreender o papel das enzimas isoformas da lipoxigenase na degeneração nigroestriatal relacionada à doença de Parkinson. Para isso, um neurotoxina que produz lesão Nigro SAL é cuidadosamente preparada. Em seguida, camundongos deficientes em locks são injetados diariamente com a solução de MPTP durante quatro dias consecutivos, sete dias após a última injeção.As amostras são coletadas e utilizadas para análises bioquímicas ou imunohistoquímicas. Os resultados mostram que 1215 travas não afeta a toxicidade do MPTP na via nigroestriatal. No entanto, cinco travas contribuem para a lesão sob condições de toxicidade.O método TS pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da doença de Parkinson. Sugerir qual é o impacto das interações entre genes e ambiente na vulnerabilidade nistri. Utilizando modelos de genes e ambiente, fomos capazes de discernir funções seletivas de ISO e compreender o papel dos cinco lipes.Pessoal devidamente treinado deve usar equipamento de proteção individual apropriado durante todo o seguinte procedimento. Comece realizando todos os cálculos necessários para o preparo da solução de neurotoxina. Em seguida, o

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