De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas
15 de novembro de 2013
Para medir as taxas potenciais de atividade das enzimas extracelulares de solo, substratos sintéticos que são obrigados a um corante fluorescente são adicionados a amostras de solo. A actividade enzimática é medida como o corante fluorescente é libertado do substrato por meio de uma reacção catalisada por enzimas, onde mais elevado de fluorescência indica mais a degradação do substrato.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar as taxas máximas potenciais de degradação de substratos-alvo por enzimas extracelulares presentes em solos. Isso é realizado primeiramente combinando solo úmido de campo e tampão em um homogeneizador, e em seguida transferindo alíquotas das amostras homogeneizadas para uma placa de amostras de poços profundos e placas padrão de poços profundos. As placas de poços profundos são incubadas e centrifugadas antes que 250 microlitros sejam transferidos de cada poço das placas de poços profundos para os poços correspondentes de uma placa preta com fundo plano.
Placas de 96 poços. As três placas são então lidas no fluorímetro e os dados resultantes são analisados. Em última análise, as atividades potenciais de enzimas extracelulares do solo são determinadas pela taxa na qual o corante fluorescente é liberado do substrato por meio de uma reação catalisada por enzima, na qual uma maior fluorescência indica maior degradação do substrato.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é a capacidade de medir atividades enzimáticas em um grande número de amostras aproveitando o formato de microplaca de 96 poços profundos. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao percebermos a possibilidade de aumentar o volume das amostras em comparação com a microplaca padrão, adaptando outros protocolos ao formato de placa de poços profundos. As implicações desta técnica permitem-nos vincular melhor a fisiologia microbiana a processos em escala de ecossistema.
A demonstração visual é essencial para esta técnica, pois existem muitas sutilezas e manuseios de amostras que não são fáceis de seguir em um procedimento escrito. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de ecologia microbiana e biogeoquímica do solo, como, por exemplo, como os microrganismos do solo respondem a alterações em seu ambiente e como suas respostas fisiológicas afetam processos ecossistêmicos críticos, tais como a decomposição e o ciclo de nutrientes. Embora este método possa fornecer informações sobre a decomposição da matéria orgânica do solo e o ciclo de nutrientes em ecossistemas terrestres, ele também pode ser aplicado a sistemas marinhos e de água doce.
Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades com habilidades de pipetagem e questões relacionadas à sensibilidade ao tempo neste protocolo. Além disso, a grande quantidade de dados gerada neste procedimento pode ser avassaladora para usuários iniciantes. Para iniciar a preparação do ensaio, rotule três placas de poços profundos como amostra MUB padrão para quatro metil e beone e padrão MUC para sete amino quatro metil cumarina.
Despeje cada padrão e substrato em reservatórios limpos e previamente rotulados separados, dispostos em linhas. Em seguida, pipete o padrão MUB apropriado para as respectivas cavidades da placa de padrão MUB conforme listado no protocolo textual. Repita este processo para os padrões MUC nas cavidades correspondentes da placa de padrão MUC para preparar as suspensões de solo.
Para cada amostra de solo, pese 2,75 gramas de solo úmido de campo antes de adicionar a um homogeneizador. Adicione 91 mililitros de um tampão 50 milimolar, homogeneíze em velocidade alta por um minuto. Despeje o conteúdo do homogeneizador em um recipiente de vidro limpo com, no mínimo, a largura de uma pipeta de oito canais e com um bastão de agitação.
A suspensão de solo pode ser passada por uma peneira de aproximadamente um milímetro antes de ser despejada no recipiente. Coloque o recipiente sobre uma placa de agitação e misture a suspensão de solo. Em seguida, pipete 800 microlitros da suspensão de solo na primeira coluna da placa de amostras.
Repita o mesmo para a primeira coluna das placas padrão de MUB e padrão de MUC. Enxágue o homogeneizador, a placa de agitação e a barra de agitação com água desionizada ou tampão entre as amostras de solo. Repita este processo para cada amostra de solo.
Mudando para a próxima coluna com cada amostra subsequente. Em seguida, pipete o substrato apropriado nos poços correspondentes da placa de amostras. Conforme listado no protocolo descrito no texto, prepare uma placa de amostras para cada temperatura de incubação a ser testada.
Sobreponha as placas de poços profundos com selos de placa. Inverta manualmente cada placa selada até que a solução seja completamente misturada. Coloque as placas no incubador apropriado pelo período de incubação necessário, conforme indicado no protocolo descrito no texto; registre o momento inicial como tempo zero, bem como os tempos de incubação apropriados ao final de cada período de incubação.
Centrifugue as placas seladas por três minutos a aproximadamente 2.900 ×g. Após a centrifugação, transfira 250 microlitros de cada poço das placas de poços profundos incubadas para os poços correspondentes de placas pretas planas de fundo 96 poços. Uma placa preta será usada para cada placa de poços profundos incubada.
É importante transferir as amostras das placas de poços profundos incubadas para os poços correspondentes nas placas pretas de fundo plano de 96 poços, seguindo as instruções do fabricante para o leitor de placas Flora Metric utilizado. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 365 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 450 nanômetros.
Carregue uma das placas-padrão, configure o fluorímetro em ganho automático e leia a placa. Em seguida, configure o ganho em modo manual e reduza o valor do valor ideal para o próximo número mais baixo arredondado para o múltiplo de cinco mais próximo. Para cada placa-padrão, repita a medição duas vezes para cada placa.
Em seguida, carregue a placa de amostras. Ajuste o ganho para automático e execute a placa de amostras. Execute novamente manualmente a placa de amostras para igualar o ganho mais alto de cada uma das placas padrão.
Inicie a análise dos dados inserindo os dados de fluorescência da curva padrão em uma planilha para os padrões MUB e MUC. Converta as concentrações micromolares em micromols para cada amostra. Com os dados de fluorescência da curva padrão, calcule os valores de inclinação, intercepto y e R quadrado para as concentrações padrão de MUB e MUC.
Os valores de r quadrado aceitáveis devem ultrapassar 0,98 para cada amostra. As curvas padrão podem ser visualizadas em um gráfico de dispersão, com as leituras de fluorescência plotadas como a variável dependente e a concentração padrão plotada como a variável independente. Insira os dados brutos de fluorescência da amostra mais o substrato em uma nova planilha.
Inclua também o tempo de incubação e o peso seco do solo para cada amostra, subtraia os valores do intercepto da curva padrão dos valores de fluorescência correspondentes das amostras e, em seguida, divida pelo coeficiente angular da curva padrão correspondente. Utilizando a equação da reta padrão, multiplique os mícromols da amostra por 91 mililitros, que é o volume de tampão utilizado na suspensão do solo. Divida o valor obtido pelo tempo específico de incubação da amostra e pela massa de solo seco.
Finalmente, multiplique o valor obtido por 1000 para obter as unidades desejadas. Os resultados são provenientes de um estudo climático experimental que compara solos submetidos a condições climáticas ambientes com solos expostos a tratamentos com dióxido de carbono elevado e aquecimento; os dados apresentados aqui são as atividades potenciais de enzimas extracelulares, ou EEAs, no local de aquecimento da pradaria e enriquecimento com dióxido de carbono elevado, em parcelas controle e parcelas tratadas. Neste exemplo, as atividades potenciais de aquisição de enzimas de carbono, nitrogênio e fósforo, analisadas em profundidades de solo de zero a cinco centímetros, não diferiram entre os tratamentos experimentais.
No entanto, em profundidades de solo de cinco a 15 centímetros, várias EEA potenciais diferiram significativamente. Por exemplo, as enzimas degradadoras de carbono beta 1,4-glucosidase e beta D-celobiosidase foram menores nos parcelas com dióxido de carbono elevado e aquecimento em comparação com as parcelas sob condições climáticas ambientes; as enzimas mineralizadoras de nitrogênio e fósforo também foram menores nas parcelas tratadas em comparação com as condições climáticas ambientes. A cinco a 15 centímetros de profundidade do solo.
O cálculo e a representação gráfica da soma de todas as EEAs potenciais de ciclagem de carbono, nitrogênio ou fósforo pode ser uma abordagem útil para observar padrões mais amplos relacionados aos ciclos potenciais de carbono, nitrogênio e/ou fósforo no solo. Neste exemplo, a soma das EEAs potenciais de beta um quatro glucco, beta D cello, hidrolase bio, beta xlo e alfa um quatro glucco foi calculada para representar as atividades potenciais de ciclagem de carbono. A soma das EEAs potenciais de beta um quatro N acetil glicosaminidase e peptidase L leucina aminopeptidase foi calculada para representar as atividades potenciais de ciclagem de nitrogênio.
A fosfatase foi utilizada para representar atividades potenciais de ciclagem de fósforo. As EEA potenciais para o ciclagem de carbono, nitrogênio e fósforo total tenderam a ser menores nos parcelas com tratamento de dióxido de carbono elevado e aquecimento, comparados aos parcelas com condições climáticas ambientes, nas profundidades de cinco a quinze centímetros do solo. No entanto, essa tendência foi significativa apenas para as atividades de ciclagem de nitrogênio e fósforo total, e as EEA do solo não diferiram significativamente entre os parcelas de tratamento.
Em profundidades de solo de zero a cinco centímetros. Os resultados sugerem tendências contrastantes na atividade enzimática e no grupo funcional entre as parcelas tratadas em resposta à profundidade do solo; a razão das EEA potenciais é uma forma de avaliar as demandas microbianas por nutrientes. Aqui, as enzimas do solo, a geometria tochi, as atividades de carbono para nitrogênio, carbono para fósforo ou nitrogênio para fósforo diferem significativamente entre as parcelas tratadas em profundidades de solo de zero a cinco centímetros.
No entanto, as razões potenciais de carbono para fósforo e de nitrogênio para fósforo foram mais altas nas parcelas com dióxido de carbono elevado e tratamento de aquecimento. Em comparação com as condições climáticas ambientes, nas profundidades do solo de cinco a quinze centímetros a temperatura pode influenciar fortemente as EEA do solo. Ainda assim, em ensaios laboratoriais típicos, as enzimas do solo são medidas em uma única temperatura que pode não corresponder às condições de temperatura em C dois.
Os gráficos de Aran são utilizados para visualizar a energia de ativação e são construídos usando o logaritmo da atividade enzimática em função da temperatura inversa convertida para graus kelvin no eixo x. A energia de ativação é comumente definida como a energia mínima necessária para catalisar uma reação química e é usada aqui como um indicador da sensibilidade térmica de reações catalisadas por enzimas. Uma energia de ativação mais alta indica maior sensibilidade térmica da enzima.
Da mesma forma, as energias de ativação correspondem diretamente aos valores do coeficiente térmico Q10. As cinéticas enzimáticas potenciais para EEAs de carbono, nitrogênio e fósforo foram avaliadas entre os dois tratamentos nas duas profundidades do solo, e os resultados demonstraram que a sensibilidade térmica das EEAs não diferiu significativamente entre os tratamentos em nenhuma das profundidades. Após dominar a técnica, 12 amostras podem ser inoculadas em placas de microtitulação de 96 poços em 30 minutos ou menos.
Além disso, após os tempos de incubação prescritos, você normalmente pode centrifugar, transferir e ler as placas novamente no urômetro dentro de meia hora enquanto realiza este procedimento. É importante pipetar de forma consistente. Qualquer presença de ar durante a pipetagem afetará negativamente seus resultados após a execução deste procedimento.
Outros métodos, como extração e sequenciamento de DNA, podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas ao papel da composição da comunidade microbiana do solo na função do solo após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de ecologia microbiana explorarem o ciclo de nutrientes e processos biogeoquímicos em ecossistemas terrestres. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como quantificar atividades enzimáticas potenciais.
Além disso, você deve ser capaz de interpretar os dados para refletir possíveis respostas microbianas a fatores como clima e diferentes tipos de solo em diversos ecossistemas. Não se esqueça de que, ao trabalhar com materiais fluorescentes, sempre devem ser tomadas precauções para minimizar a exposição à luz devido à sensibilidade à luz do grupo fluoro.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para quantificar taxas potenciais de atividades enzimáticas extracelulares do solo utilizando substratos fluorescentes. A técnica permite a medição de atividades enzimáticas em múltiplas amostras de forma eficiente.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Ecologia microbiana
- Biogeoquímica do solo
Contexto
- Enzimas extracelulares desempenham um papel crucial no ciclo de nutrientes do solo.
- O entendimento das atividades enzimáticas pode vincular a fisiologia microbiana aos processos do ecossistema.
- Os métodos existentes podem não lidar eficientemente com grandes volumes de amostras.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para medir atividades de enzimas do solo em formato de alto rendimento.
- Explorar como os microrganismos do solo respondem a mudanças ambientais.
- Avaliar as implicações para processos ecossistêmicos como a decomposição.
Métodos Utilizados
- Preparação de suspensões de solo e padrões em placas de poços profundos.
- Incubação e centrifugação das amostras.
- Análise fluorimétrica para medir a atividade enzimática com base na liberação de corante fluorescente.
- Análise de dados envolvendo curvas padrão para quantificação.
Resultados Principais
- O método permite a análise simultânea de múltiplas amostras.
- Uma fluorescência mais alta indica maior degradação do substrato.
- As curvas padrão fornecem quantificação confiável das atividades enzimáticas.
Conclusões
- Essa técnica aprimora a compreensão dos processos microbianos em solos.
- Pode ser adaptada para uso em sistemas marinhos e de água doce.
- Demonstrações visuais são essenciais para a implementação eficaz do método.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio fluorométrico de alto rendimento permite a quantificação rápida de atividades enzimáticas extracelulares potenciais em amostras de solo, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos para pipelines de agroquímicos e biotecnologia ambiental. Ao medir a degradação do substrato em condições não limitantes, o método fornece confiança preditiva nas respostas funcionais microbianas a estressores ambientais, orientando decisões iniciais de descoberta em pesquisas de agricultura sustentável e biorremediação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa vias metabólicas microbianas mediante a quantificação da atividade de enzimas envolvidas nos ciclos do carbono, nitrogênio e fósforo como indicadores funcionais da fisiologia microbiana.
- Valor Operacional: Permite a triagem em alto rendimento de amostras ambientais para reduzir os riscos associados a hipóteses sobre mecanismos de aquisição de nutrientes e resposta ao estresse.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara suspensões padronizadas de solo em placas de poços profundos para minimizar limitações de difusão e garantir interações enzima-substrato reprodutíveis em grandes conjuntos de amostras.
- Valor Operacional: Aproveita o formato de placa de 96 poços profundos para processamento escalonável e paralelo de até 12 amostras em menos de 30 minutos, apoiando a padronização de ensaios e a eficiência do fluxo de trabalho.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Relaciona a atividade enzimática microbiana a processos em escala de ecossistema, como decomposição e ciclagem de nutrientes, fornecendo um modelo de sistema relevante para doenças na avaliação de riscos ambientais à saúde.
- Valor Operacional: Permite comparações entre diferentes locais quando normalizado pelo peso seco do solo, tempo de incubação e volume do tampão, possibilitando continuidade translacional entre medições laboratoriais e previsões funcionais relevantes para o campo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer leituras quantitativas baseadas em fluorescência que apoiam a verificação de hipóteses, a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos antes das etapas de identificação de compostos líderes em programas de biotecnologia ambiental.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre respostas funcionais microbianas a mudanças ambientais por meio da medição quantitativa de atividades enzimáticas potenciais como indicadores da capacidade metabólica.
- Triagem: Permite prontidão e reprodutibilidade do ensaio por meio da preparação padronizada de suspensão de solo e incubação em placas de poços profundos, minimizando a variabilidade técnica em formatos de alto rendimento.
- Análises: Gera medições quantitativas de variáveis dependentes (intensidade de fluorescência ao longo do tempo) que permitem o cálculo de taxas de atividade enzimática utilizando curvas-padrão, apoiando comparações entre condições baseadas em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta medições laboratoriais de atividade enzimática potencial à continuidade pré-clínica por meio da modelagem de tendências no ciclo de nutrientes sob condições elevadas de CO2 e temperatura.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para triagem de respostas funcionais microbianas em diversos tipos de solo e condições ambientais, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de ciclagem de nutrientes microbianos sob condições laboratoriais controladas.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio do formato de placas de poços profundos, suspensões tamponadas de solo e leitura fluorimétrica normalizada por ganho.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não em fases iniciais de descoberta, permitindo a priorização ajustada ao risco de alvos microbianos com base em perfis de atividade funcional sob condições de estresse.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao quantificar tendências nas atividades de ciclagem de carbono, nitrogênio e fósforo como indicadores da resiliência funcional do ecossistema.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas de ecologia microbiana, preparação de suspensões de solo e análise de dados fluorimétricos.
- Depende do acesso a placas de poços profundos, leitores de placas com ajustes de ganho variáveis e centrífugas capazes de 2.900 G.
- Necessita padronização entre equipes nas medições de massa seca do solo, no tempo de incubação e no manuseio de substratos para garantir a comparabilidade dos dados.
- Requer considerações de adaptação ao ser estendido a sistemas marinhos ou de água doce, devido às diferenças na força iônica e nas condições nativas de pH.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade à instabilidade de compostos fluorescentes e a interferência potencial de impurezas do solo, exigindo manuseio cuidadoso do substrato e proteção contra a luz.
