Name: Utilização de Galleria mellonella Como um organismo modelo para estudar Legionella pneumophila Infecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprenda a usar larvas de Galleria mellonella para estudar a patogênese de Legionella pneumophila em modelo in vivo. Este método permite analisar virulência bacteriana e replicação intracelular de forma ética e econômica.

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CR Harding foi apoiado pelo studentship WT086724 Wellcome Trust.

1. Preparação de L. pneumophila para a Infecção <ol><li> Prepare carvão de extracto de levedura (CYE) placas (carvão 2 g / L activada, 10 g / L de extracto de levedura, 13 g / L de agar, 10 g / L de N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic ácido (ACES), 1 g / L α-cetoglutarato, 0,4 g / L de L-cisteína HCl e 0,25 g / l pirofosfato férrico, pH 6,9). Nota: Se for necessário, adicionar à canamicina (25 ug / ml) e / ou cloranfenicol (6 ug / ml) para placas de CYE. <ol><li> Realizar todos L. pneumophila trabalho a nível de contenção de biossegurança 2 (BSL-2) em um gabinete de segurança microbiana (MSC) em conformidade com as regras locais. </li></ol></li><li> Streak L. pneumophila de -80 ° C stocks de glicerol em placas CYE </li><li> Incubar as placas durante 4 dias a 37 ° C. Nota: A incubação das placas durante 4 dias aumenta significativamente a virulência de L. pneumophila em G. mellonella sobre incubação por 3 dias. </li><li> Um dia antes da infecção, ressuspender um fu laçoll de bactérias (contendo várias colónias) em 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) ACES extracto de levedura (EJA) caldo e medir a absorvância a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro. </li><li> Semear uma nova cultura de 3 ml EJA (com antibióticos, se necessário) para um final de OD 600 de 0,1. <ol><li> Incluir uma mídia só controlar para garantir a esterilidade da mídia. </li></ol></li><li> Incubar a 37 ° C numa incubadora com agitação a 200 rpm durante 21 horas. Nota: As bactérias devem ser cultivadas para a fase pós-exponencial para a infecção 38. Crescente por 21 hr permite experimentos a serem padronizados. Nota: Se for necessário para a indução da proteína, adicionar 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante a noite. </li><li> Medir o OD 600 (bactérias devem estar em fase de crescimento pós-exponencial, OD 600 2,5-3). </li><li> Dilui-se a cultura bacteriana para dar 1 x 10 9 CFU / ml em tampão fosfato salino estéril de Dulbecco (D-PBS). Nota: Com base nos resultados anteriores, uma OD 600 de 1 corresponde a 1 x 10 9 CFU / ml, no entanto, isto deve ser confirmado por diferentes L. cepas pneumophila. Nota: se for necessária a indução de uma proteína a partir de um plasmídeo, adicionar 1 mM de IPTG para o inoculo. </li><li> Placa do inoculo, tal como descrito na secção 9, como um controlo, para assegurar o CFU esperada está presente no inoculo. </li></ol> 2. Preparação de Larvas <ol><li> Compre suficiente G. mellonella larvas de um fornecedor comercial. As larvas são enviados na fase 5 º ou 6 º instar (aproximadamente entre 2-3 cm de comprimento) e são adequados para o uso imediatamente. Nota: Um método que descreve como a traseira larvas foi descrito previamente 39. Nota: As larvas podem ser armazenadas à temperatura ambiente até duas semanas, e não necessitam de alimentos. Descartar imediatamente qualquer larvas mostrando sinais de pupação. </li><li> Prepare o recipiente para larva por placção de um círculo de 10 cm de papel de filtro na parte inferior de um prato de 10 centímetros de Petri. </li><li> Com uma pinça sem corte, coloque dez larvas saudáveis ​​de tamanho aproximadamente semelhante na placa de Petri. Nota: Descarte insalubres insetos marrons colorido ou manchadas procurando. Larvas saudáveis ​​são uniformemente cremoso colorido, sem áreas de manchas escuras e são capazes de endireitar-se rapidamente se virou. </li></ol> 3. Infecção de G. mellonella Larvas <ol><li> Prepare a plataforma injecção gravando um círculo de papel de filtro para a superfície. </li><li> Segurança gravam uma dica P1000 horizontalmente para o papel de filtro para criar uma plataforma de injeção. Isto não necessita de ser estéril. </li><li> Esterilizar uma seringa de microtitulação de 20 ul por aspiração de etanol a 70% e incubando durante pelo menos 10 min. <ol><li> Usar luvas prova de punção enquanto está a injectar, </li></ol></li><li> Remova qualquer etanol residual por aspiração e expulsão de água estéril várias vezes. </li><li> Using a seringa, 10 ml de aspirado de L. pneumophila 1 x 10 9 suspensão UFC / ml. </li><li> Tome uma larva e suavemente, mas com firmeza transformá-lo em suas costas, inclinou-se sobre a ponta P1000. </li><li> Coloque a ponta da seringa sobre o proleg frente, à direita das larvas. </li><li> Gentilmente, insira a ponta da agulha no proleg, certificando-se de que ele está dentro das larvas, e suavemente injetar todo o conteúdo da seringa. Nota: Se a seringa está inserido corretamente, deve ser possível para pegar as larvas usando apenas a seringa para colocá-lo na câmara. <ol><li> Após injecção, as larvas observar durante alguns segundos. As larvas vão começar a engatinhar depois de alguns segundos, mas não deve excretar fluido. </li></ol></li><li> Resumidamente observar as larvas de algumas horas após a infecção; infecção com 10 7 CFU L. pneumophila 130b não causa sintomas nas primeiras 5-8 horas pi Portanto, se as larvas estão virando cinza / preto antes desse ponto, tele experimento deve ser interrompido. Nota: A inoculação de larvas com IPTG 1 mM não afecta a viabilidade das larvas ao longo do curso do experimento. </li><li> Do mesmo modo, injecta-se um total de 10 larvas por cada condição, incluindo 10 larvas injectadas com D-PBS para servir como um controlo para analisar a mortalidade das larvas. </li><li> Tape placas de Petri fechada e coloque em contenção secundária. </li><li> Incubar numa incubadora bacteriano padrão a 37 ° C, durante a duração da experiência. </li></ol> 4. O pré-tratamento das larvas com um inibidor químico <ol><li> Antes da infecção, as larvas se preparar para injecção, tal como descrito na secção de 3,1-3,6. </li><li> Injectar 10 mL de uma solução de citocalasina D 100 pM para a frente, para a esquerda proleg de 10 larvas. Nota: Inibidor é injectado num proleg diferente da suspensão bacteriana para reduzir o prejuízo para as larvas. </li><li> Injectar 10 mL de DMSO em 10 larvas como um controlo. </li><li> Incubar larvas em37 ° C durante 4 h. </li><li> Injetar larvas pré-tratados como descrito na seção 3 na frente, certo proleg com 1 x 10 7 UFC de L. WT pneumophila ou um controle PBS. </li></ol> 5. Análise da Mortalidade larval <ol><li> Aos 18 hr pós infecção (pi), examine todas as larvas infectadas para a mortalidade. </li><li> Para verificar a mortalidade, use uma pinça sem corte para virar as larvas e procurar o movimento das pernas, as larvas saudável deve endireitar-se rapidamente. Pigmentação indica uma reação imunológica forte à infecção. Se houver qualquer movimento, contam como vivo. </li><li> Número recorde de larvas mortas e vivas. </li><li> Repita esse processo em todos os outros pontos de tempo escolhido. Nota: Se a incubação continuou por mais de três dias, as pupas podem ser vistos. Remova qualquer pupas e eutanásia por congelamento a - 20 ° C antes de metamorfose pode ocorrer. </li></ol> 6. Extração de hemolinfa <ol><li> Aleatoriamente selecionar trêslarvas e colocar num tubo de 14 ml em pontos de tempo seleccionados, tais como 5 e 18 horas pi, </li><li> Colocar este tubo em gelo durante 5-10 minutos, até que nenhum movimento das pernas, as larvas podem ser observadas. </li><li> Coloque as larvas anestesiados para uma placa de Petri e, usando um bisturi, fazer uma incisão entre dois segmentos próximos da cauda das larvas. </li><li> Esprema as larvas em um tubo de centrífuga de 1,5 ml estéril para recolher a hemolinfa. <ol><li> Hemolinfa Piscina de pelo menos três indivíduos. Uma larva dá entre 15-50 mL de hemolinfa dependendo do tamanho. Nota: Durante a extracção, hemolinfa que é muito fácil para interromper o intestino, resultando na contaminação potencial das amostras. Reduzir a contaminação por corte as larvas perto da cauda (distância a partir do intestino), no entanto, a selecção de antibiótico será sempre necessária quando o plaqueamento as bactérias. Nota: Para evitar hemolinfa escureçam e coagulante, processo hemolinfa dentro de 10 minutos após a coleta. </li></ol></li><li> Descartar o corpo de larvas para um novo tubo de 14 ml de Falcon, de vedação e lugar, a - 20 ° C durante a noite para assegurar que as larvas estão mortas. </li><li> Autoclave larvas mortas e dispor de acordo com as regras locais. </li></ol> 7. Determinação da Viabilidade de hemócitos <ol><li> Extrair hemolinfa como descrito acima. </li><li> Misturar 20 ul de hemolinfa foi extraída com 20 mL de 0,02% (v / v) de azul de tripano em PBS em um poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Carga 10 mL de hemolinfa em um hemocitômetro e contar células (azul) não viáveis. </li><li> Conte cada amostra em triplicado para reduzir o erro. </li></ol> 8. Processamento de Extraído Hemócitos para imunofluorescência Microscopia <ol><li> Misture a hemolinfa reunidas extraída de, pelo menos, três larvas e pipeta para uma lamela de vidro de 10-15 mm de uma placa de 24 poços. Nota: Lamelas não necessitam de tratamento como hemócitos pode aderir ao vidro. </li><li> Adicionar 0,5 ml de D-PBS e misture bem por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Centrifuga-se o prato durante 10 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente (RT), utilizando um suporte de placa de centrífuga anti-aerossol. </li><li> Examine cada cavidade utilizando um microscópio invertido para verificar se os hemócitos aderiram. </li><li> Remover o sobrenadante e lava-se cuidadosamente as células três vezes por adição de 0,5 ml de D-PBS para a parede do poço, balançando o prato 2-3x e removendo o D-PBS com uma pipeta. </li><li> Fixar as células por adição de 0,5 ml de 4% (v / v) de paraformaldeído (PFA) em PBS. </li><li> Incubar as células de entre 20-30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células três vezes com D-PBS, como antes. </li><li> Adicionar 0,5 ml de 15 mM NH 4 Cl em PBS para extinguir a PFA residual e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Lave as células três vezes com D-PBS. Nota: Nesta fase, as lamelas podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C. </li><li> Adicionar 0,5 ml de 0,1% de Triton X-100 em PBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para permeabilizar as células. </li&gt; <li> Bloco durante 1 hora com solução de bloqueio (2% (w / v) de BSA em PBS). </li><li> Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro, com o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio na diluição indicada pelo fabricante. </li><li> Lavar 3x com PBS. </li><li> Incubar durante 1 hora com o anticorpo secundário e DAPI para visualização de bactérias como acima. </li><li> Lavar 3x com PBS. </li><li> Montar as lamelas utilizando uma gota de reagente de montagem sobre lâminas de vidro. </li><li> Incubar durante a noite no escuro à temperatura ambiente para secar totalmente a solução de montagem. </li><li> Imagem desliza sobre um microscópio de fluorescência. </li></ol> 9. Quantificação de bacteriana CFU <ol><li> Adicione 100 g / ml spectinomicina para CYE placas para evitar a contaminação pela flora intestinal. L. 130b pneumophila tensão é naturalmente resistente à espectinomicina 40. </li><li> Antes de extração de hemolinfa, pesar 1,5 ml tubos de centrífuga. </li><li> Extraia hemolinfa como descrito na seção 6 e coloque em pesava tubes, adicionar 1 ml de 5 mg / ml de digitonina, misturar bem e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para lisar os hemócitos. </li><li> Pesar novamente o tubo com hemolinfa e determinar o peso da hemolinfa extraída. </li><li> Realize dez diluições vezes de hemolinfa em mídia EJA estéril. </li><li> Usando uma caneta, divida a base de uma placa de CYE em seis sectores iguais e rótulo. </li><li> Placa de três gotas de 25 ul de cada diluição (começando com o mais diluído) em cada secção da placa. </li><li> Incubar as placas com as tampas Upmost durante a noite a 37 ° C. </li><li> Uma vez que as gotas secaram completamente, para girar a placa por cima e incubar a 37 ° C durante, pelo menos mais dois dias. </li><li> Quantificar as bactérias extraídas por contagem das colónias em cada diluição e normalizam-se ao peso da hemolinfa extraída. </li></ol> 10. Determinação do Índice Competitiva (IC) <ol><li> Confirme que ambas as cepas crescem igualmente bem em caldo de cultura e em placas de ágar CYE prior para tentar o índice competitivo. </li><li> Preparar suspensões bacterianas mutantes resistentes WT ou canamicina como descrito na seção 1 e misture em uma proporção de 1:1. <ol><li> Diluições em série da placa do inóculo para CYE espectinomicina (100 mg / ml) e CYE spectinomicina / canamicina </li></ol></li><li> Infectar larvas e extracto de hemolinfa em momentos adequados, tal como descrito acima. </li><li> Determinar a contagem de viáveis ​​por meio da extração de hemolinfa e chapeamento de diluições em série para spectinomicina CYE e CYE spectinomicina / canamicina. </li><li> Calcular o índice competitiva (IC), como se segue: IC = (saída de mutante / saída WT) / (inoculo mutante / WT inoculo). </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O Galleria mellonella modelo larval para a infecção Legionella pneumophila é uma ferramenta útil para estudos in vivo de patogênese. Aqui mostra-se que um certo número de aspectos da infecção de macrófagos pode ser recapitulado no G. modelo mellonella, incluindo o papel do Dot / Icm T4BSS na virulência e replicação bacteriana e da localização do Dot / Icm efetuador SIDC. Além disso, demonstra-se que um inibidor químico de polimerização de actina reduz significativamente a mortalidade das larvas, que imita os resultados obtidos em macophages 47 e provas de que a internalização das bactérias é necessário para fazer com que a mortalidade das larvas. Anteriormente, demonstrou-se que as variações na virulência de L. cepas pneumophila visto em outros modelos de infecção pode ser verificado em G. mellonella e que a indução de fatores de virulência em fase de crescimento pós-exponencial é necessário para a virulência bacteriana <sup&gt; 36, confirmando que G. mellonella é um modelo adequado para L. infecção pneumophila. Determinando o CFU de L. pneumophila de larvas infectadas quer isoladamente ou em infecções mistas aumenta grandemente a utilidade do modelo. Anteriormente, vários fatores têm sido descoberto que têm efeitos sutis sobre replicação bacteriana em um ou mais modelos de infecção 29,48-51. Embora as larvas não possuem um sistema imunitário adaptativo, a presença da resposta imune inata proporciona selecção mais forte em comparação com os macrófagos sozinhos, o que pode servir para amplificar fenótipos subtis. Portanto, é possível que, enquanto essas cepas provavelmente não afetará significativamente a mortalidade larval, eles podem demonstrar diminuição da replicação bacteriana ou adequação no G. modelo mellonella. , Bem como a replicação de L. pneumophila nas larvas, mostramos esgotamento hemocyte significativa no final de infecção. Como L.pneumophila é esperado para lisar as células hospedeiras, no final do seu ciclo de replicação, medir o esgotamento de hemócitos também pode servir como uma medida indirecta da replicação bacteriana. Esgotamento hemócitos foi previamente correlacionado com a mortalidade de insetos em infecção 3,52, embora os resultados recentes sugerem que esta situação é mais complexa do que a primeira belived 37. Recentemente, demonstrou-se que a carência de larvas leva a um aumento da susceptibilidade à infecção por meio de uma supressão das respostas imunes 53. Nos ensaios aqui descritos, as larvas não foram alimentados durante a duração do estudo e não se sabe como bem larvas alimentadas com responderia a L. infecção pneumophila. Uma das vantagens de G. mellonella como um organismo modelo é a facilidade de extracção e quantificação de hemócitos de larvas infectadas. Vídeos anteriores demonstraram vários métodos para extração de hemócitos de insetos 54,55 no entanto, o conheceuhod aqui apresentada é simples e adequado para processamento imediato. Uma vez extraído, hemócitos pode ser facilmente quantificado, utilizado para imunofluorescência, a microscopia electrónica de transmissão 36 ou 56 por citometria de fluxo ou cultivadas e infectadas ex vivo 3 permitindo que a resposta das células à infecção a ser investigada em detalhe. Isto aumenta significativamente a flexibilidade do modelo. Uma ressalva para imunofluorescência em G. mellonella é a oferta limitada de anticorpos validados contra G. proteínas mellonella. No entanto, estudos têm demonstrado a criação de anticorpos contra as proteínas de larvas 57 e anticorpos contra as proteínas imuno-relacionadas humanos foram encontrados para reconhecer G. proteínas mellonella 11, demonstrando o potencial de imunofluorescência em G. hemócitos mellonella. A facilidade de G. infecção mellonella permite rápidos, telas de médio rendimento que poderiamser utilizado para comparar a virulência das várias espécies de Legionella e as estirpes e poderia ser utilizado para analisar ainda factores de virulência previamente identificados, tais como moléculas de adesão 58 ou o sistema de secreção de tipo 2 59, que são necessários para virulência em outros modelos. Além disso, a utilização deste modelo irá permitir a identificação e a caracterização adicional de novos factores de virulência incluindo as proteínas efectoras segregadas e translocados. Recentemente, tem sido mostrado que a actividade da fosfolipase C de L. pneumophila tem um papel em G. mellonella virulência 60 e que a proteína efectora Dot / Icm SdhA é necessária para a virulência 37. Além disso, foi demonstrado recentemente que existe uma correlação entre os fenótipos observados em G. mellonella e no camundongo linhagem A / J 37. Isto sublinha o valor desta ferramenta para complementar protozoário unicelular ambiental e de acolhimento e murimodelos de infecção ne. O G. mellonella modelo vai se tornar ainda mais valioso no futuro, uma vez que a seqüência genômica larval estará disponível e as ferramentas mais genéticos são estabelecidas. Passos nessa direção incluem a recente publicação que detalha o transcriptoma imune relacionados com 61 ea formação de uma iniciativa para avançar silenciamento gênico em Lepidoptera spp 62. Usando G. larvas mellonella, que tem uma série de leituras simples e rápidos de virulência bacteriana que podem ser utilizados para investigar a patogênese de L. pneumophila. Estabelecimento destes ensaios de triagem e mais ampla de L. cepas pneumophila sorogrupos e vai aumentar a utilidade desta nova ferramenta e vai contribuir para a nossa compreensão da L. patogênese pneumophila.

Os modelos animais de infecção provaram inestimável para a determinação de fatores de virulência bacteriana. No entanto, os modelos de invertebrados ganharam maior atenção como uma alternativa viável aos modelos tradicionais de mamíferos de infecção. As larvas da traça da cera, Galleria mellonella está cada vez mais a ser usado para estudar uma série de agentes patogénicos humanos importantes, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-1 negativas bactérias 2,3 e vários fungos patogénicos 4,5. Usando um modelo de insectos tem um número de vantagens em relação aos modelos de mamíferos tradicionais, como um invertebrado, G. mellonella não está sujeito às limitações éticas de modelos de mamíferos. Além disso, as larvas podem ser facilmente mantida, infectados por injecção, sem anestesia, são submetidos a pré-tratamento com inibidores químicos 6 e manter a incubação a 37 ° C 7. Curiosamente, uma boa correlação entre a patogenicidade de vários microorganismos em G. mellonella e modelos de infecção de mamíferos tem sido estabelecida 2,8. O aumento da compreensão do sistema imunológico de G. mellonella também ajudou na caracterização deste organismo modelo. Embora insetos não têm um sistema imunológico adaptativo como encontrado em mamíferos, eles têm defesas celulares e úmero sofisticadas, incluindo a produção de peptídeos antimicrobianos 9. Hemócitos são o principal mediador das defesas celulares e são o tipo de células mais numerosas encontrado na hemolinfa (ou sangue) de G. mellonella 10, Estas células são fagócitos profissionais e executar funções semelhantes a macrófagos e neutrófilos humanos por ambos tendo-se e degradar as bactérias num compartimento phago-lisossomal 10,11 e formando nódulos torno bactérias invasoras, restringir fisicamente a replicação bacteriana 12. Legionella pneumophila é um agente patogénico respiratório que provoca Pneumoni graveum (doença dos legionários) em populações suscetíveis, como idosos ou imunocomprometidos 13. Legionella é encontrado onipresente em fontes de água, tanto ambientais e antrópicos, onde é um patógeno de várias espécies de água doce amebas 14,15. Legionella sobrevive e replica dentro destes fagócitos profissionais utilizando um complexo multi-proteína conhecida como o Dot / Icm (defeituoso no tráfico organelo multiplicação / intracelular) do tipo 4 sistema de secreção (T4SS) para translocar mais de 275 proteínas efectoras dentro da célula hospedeira 16-20. Essas proteínas servem para subverter os caminhos normais fagocíticas célula hospedeira, levando à criação da Legionella contendo vacúolo (LCV). O LCV evita a fusão com os lisossomas e recruta vez do retículo endoplasmático (ER) de vesículas derivado, o que resulta em um compartimento especializado que se assemelha a RE rugoso 21,22. L. pneumophila é considerado um percurso humano acidentalogen; as mesmas estratégias que permitem replicar dentro de amebas, também permitir a replicação nos macrófagos alveolares humanos 23. Hospedeiros mamíferos têm sido caracterizadas como modelos para a infecção por Legionella humana, incluindo ratos e cobaias 24,25. No entanto, a maioria das estirpes de ratinhos são resistentes à infecção por Legionella 26 com a excepção de o consanguínea albino A / J de ratinho, o qual desenvolve um ligeiro, auto-limitante de infecção de 24. Embora o modelo de cobaia se assemelha mais de perto a doença humana 25, a falta de mutantes e aumento do custo desencoraja a sua utilização 27. Além disso, vários modelos de invertebrados têm sido desenvolvidos para a infecção por Legionella pneumophila incluindo Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 e várias espécies de amebas 30-32. No entanto, estes modelos têm fraquezas, virulência do C. elegans </em&gt; Sistema não é Dot / Icm-dependente 28, o que limita a utilidade deste modelo. O modelo de Drosophila revelou-se eficaz na investigação de fatores de virulência bacteriana 29 e parece ser promissor no entanto, este modelo não foi totalmente caracterizada. Amebas unicelulares são os anfitriões ambientais de L. pneumophila e são ideais para investigar a ação de fatores de virulência em um nível molecular 33 porém faltam várias importantes mediadores da resposta da célula hospedeiro mamífero para infecção, como caspases 34. Os pontos fracos dos modelos existentes, juntamente com o alto custo e as preocupações éticas relacionadas com a experimentação de mamíferos, tem levado à busca de outros organismos modelo apropriadas 29,35. Temos demonstrado recentemente que G. mellonella é um modelo adequado para L. pneumophila patogênese 36,37. Este protocolo detalha as técnicas experimentais utilizadas para infectarção G. larvas mellonella, analisando moralidade larval, extraindo hemócitos para contagem e imunofluorescência e determinar replicação viável UFC conta de larvas infectadas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material/ Equipamento</td></tr><tr><td>ACES extrato de levedura (AYE) caldo</td><td></td><td></td><td>4 g ACES, 4 g de extrato de levedura, 0,4 g &#945;-cetoglutarato, pH 6,9, 400 ml H2O, autoclavado, 4 ml de solução de ferro*, 4 ml de solução de cisteína* *adicione ingredientes estéreis após a autoclavagem</td></tr> de <tr>placas <td></td><td></td><td>de extrato de levedura tamponada com carvão (CYE)</td><td>Como acima, com a adição de 0,6 g de carvão ativado e 6 g de</td></tr><tr><td>solução de ferro estéril de ágar (pirofosfato férrico)</td> <td>Sigma</td><td>P6526</td><td>0,6 mM solução, estéril filtrada</td></tr><tr><td>solução de cisteína estéril</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td>3,3 mM, esterilizado filtrado</td></tr><tr><td>G. mellonella (waxworms)</td><td>Livefood UK</td><td>W250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-Tetrametil Rodamina Isotiocianato ( TRITC)</td> <td>Sigma</td><td>H9037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Legionella LPS</td><td>Cambridge Biosciences</td><td>PA1-7227</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td><td>Jackson Immunoreach</td><td>711-485-152</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &# 946; -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td> <td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos fosfato tamponado solução salina (D-PBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Paraformaldeído</td><td>Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio (NH4Cl)</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Biomol International</td><td>BML-T109-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[cabeçalho]</td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Microtiter Seringa</td><td>Sigma</td><td>24544</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células, duplo, Centrífuga </td><td></td><td></td> Neubauer VWR 631-0926 <td></td>melhorada</tr><tr><td></td><td>Para placas de centrifugação </td>Microscópio de fluorescência Qualquer microscópio com filtros apropriados para os fluoróforos necessários <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Microscópio <td></td><td></td><td>invertido</td><td>Para contagem de células viáveis </td></tr><tr><td>Luva à prova de punção</td><td>Pele</td><td></td><td></td> de tartaruga</tr></tbody></table>

utilização de<em&gt; galleria mellonella</em&gt; como um organismo modelo para estudar<em&gt; legionella pneumophila</em&gt; infecção

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, o agente causador de uma pneumonia grave denominada doença do legionário, é um importante patógeno humano que infecta e replica dentro de macrófagos alveolares. A sua virulência depende do sistema Dot / Icm secreção de tipo IV (T4SS), que é essencial para estabelecer um vacúolo permissiva replicação conhecido como o vacúolo que contém a Legionella (LCV). L. infecção pneumophila pode ser modelado em ratos no entanto a maioria das linhagens de camundongos não são permissivas, levando à busca de modelos de infecção da novela. Mostrámos recentemente que as larvas da traça da cera Galleria mellonella são adequados para investigação de L. infecção pneumophila. G. mellonella é cada vez mais usado como um modelo de infecção por patógenos humanos e existe uma boa correlação entre a virulência de várias espécies bacterianas no inseto e em modelos de mamíferos. Um componente-chave de defesas imunológicas do larvas são hemócitos, profissãofagócitos ai, que ocupam e destroem invasores. L. pneumophila é capaz de infectar, formar um LCV e replicam no interior dessas células. Aqui demonstramos protocolos para analisar L. virulência pneumophila no G. modelo mellonella, incluindo como crescer L. infecciosa pneumophila, pré-tratamento das larvas com inibidores, infectar as larvas e como extrair células infectadas para quantificação e microscopia de imunofluorescência. Nós também descrevem a forma de quantificar a replicação bacteriana e fitness em ensaios de competição. Estas aproximações permitem o rápido rastreio de mutantes para determinar factores importantes em L. virulência pneumophila, descrevendo uma nova ferramenta para ajudar a nossa compreensão desse complexo patógeno.

Aqui é demonstrado que G. mellonella é um modelo apropriado, fácil de usar para estudar L. infecção pneumophila. Anteriormente, demonstrou-se que o L. virulência pneumophila em macrófagos, amebas e modelos de mamíferos é dependente da presença do sistema de secreção Dot / Icm 41-43. G. larvas mellonella foram infectadas tal como descrito acima e a virulência do tipo selvagem (WT) e uma estirpe de Dot / Icm deficiente comparado. A infecção com 10 7 CFU da L. 130b pneumophila esforço resultou em 100% de mortalidade dentro de 24 horas pós-infecção (pi). No entanto, a L. pneumophila Δ DOTA estirpe, que não tem um sistema de secreção Dot / Icm T4SS funcional, foi avirulenta neste ensaio (Figura 1). Isto demonstra que o L. virulência pneumophila em G. mellonella depende da translocação de efetores Dot / ICM, tornando este modelo adequado para caracterização dea função destas proteínas. Recentemente, foi mostrado que a inibição da fagocitose por tratamento citocalasina aumentou a susceptibly das larvas para a infecção pelos fungos Candida albicans 6. Como L. pneumophila é um agente patogénico intracelular, foi decidido determinar se a absorção das bactérias é crucial na sua patogénese neste modelo. As larvas foram pré-tratadas com 10 ul de 100 uM citocalasina D (CyD) durante 4 horas a 37 ° C, em seguida, infectadas com 10 7 CFU da L. WT 130b pneumophila e mortalidade monitorados em 24 horas pi O tratamento com o inibidor só não afetou a sobrevivência das larvas. No entanto, pré-tratado, as larvas infectadas apresentado sobrevivência significativamente maior (P = 0,0066, teste T desemparelhado) em comparação com tratados com DMSO, os insectos infectados (Figura 2). O efeito do tratamento CyD foi abolida por 48 hr pi (resultados não apresentados), o que pode ser devido à meia-vida do fármaco no G.mellonella. Isso demonstra que a absorção de L. pneumophila em G. mellonella hemócitos é um aspecto crucial da virulência bacteriana. A fim de validar expressão e determinar a localização subcelular de uma proteína efectora em G. mellonella, hemócitos foram extraídos e processados ​​para microscopia de imunofluorescência. As larvas foram infectadas com WT e Δ DOTA L. pneumophila 130b expressando um fragmento do efector T4SS bem definida, SIDC 41-918, fundido com quatro etiquetas HA N-terminal. Este efector, foi demonstrado que se ligam a LCV através de um domínio de fosfoinositido-4--fosfato de ligação 44. Utilizando anti-HA (vermelho) e de anti-Legionella (verde) anticorpos, 4HA-SIDC 41-918 localizada no LCV em hemócitos infectados (Figura 3). Esta localização foi previamente mostrado na discoideum amebas Dictyostelium e em macrófagos de mamíferos 44,45 confirmando o comparability deste modelo. A importância das proteínas de virulência é geralmente determinada por comparação da cinética de crescimento de tipo selvagem e as bactérias mutantes. De modo a seguir a cinética de replicação bacterianas durante o curso da infecção, três larvas foram sacrificados em cada ponto de tempo (0, 5, 18, e 24 h pi), a hemolinfa recolhidas e combinadas e o CFU/0.1g de hemolinfa extraída determinada. Depois de um mergulho inicial em 5 pi h, a UFC de bactérias WT aumenta até 24 horas pi no entanto, a estirpe Δ DOTA sofre nenhuma replicação e é eliminada a 18 hr pi (Figura 4). A capacidade de L. pneumophila para provocar a lise dos macrófagos de um modo dependente-T4SS tem sido documentada 46, no entanto, não há estudos semelhantes foram realizados in vivo. A concentração de hemócitos em circulação foi determinada aos 5, 18, e 24 hr pi larvas foram infectadas com WT ou Δ <em&gt; Dota L. pneumophila 130b, hemócitos extraídos de insetos infectados e células viáveis ​​contadas usando o método de exclusão do azul de tripan. Às 5 horas pi nenhuma diferença significativa na contagem de hemócitos entre as estirpes pode ser visto (Figura 5). No entanto, às 18 horas pi houve uma queda significativa na concentração de hemócitos no WT, mas não Δ Dota, larvas infectadas. Esta diferença persistiu às 24 horas pi A queda no número de hemócitos, combinada com a presença de bactérias intracelulares, como visto por imunofluorescência, sugere que L. pneumophila replica dentro hemócitos então lisa-los, permitindo que as bactérias se submeter a várias rodadas de replicação. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> Figura 1. A infecção com L. pneumophila induz Dot / Icm-dependente de mortalidade das larvas. de 10 larvas infectadas com PBS sozinho ou 10 <sup&gt; 7 UFC de tipo selvagem (WT) ou Δ Dota L. pneumophila 130b, incubados a 37 ° C durante 72 horas e no momento da morte das larvas gravado. Todas as larvas infectadas com o WT sucumbiu a uma infecção dentro de 24 horas pós-infecção (pi), no entanto nenhuma mortalidade foi observada em larvas inoculadas com PBS sozinho ou a tensão Δ Dota. Os resultados são a média de três experiências separadas, ± desvio-padrão. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> Figura 2. A mortalidade é dependente da internalização bacteriana. De 10 L. pneumophila larvas foram pré-tratadas com 10 ul de 100 uM citocalasina D (CyD) durante 4 horas a 37 ° C, em seguida, infectadas com 10 7 WT e mortalidade monitorizada a 24 hr pi larvas pré-tratado demonstraram significativamente (P = 0,0066, teste t ímpar) reduzida mortalidade. Os resultados representam a mean de em quatro experimentos independentes ± desvios-padrão com 10 larvas por condição. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> Figura 3. Imunofluorescência de imagens de proteínas efectoras em hemócitos extraídos. Hemócitos foram extraídos a partir de larvas infectadas com L. pneumophila 130b WT ou Δ Dota expressar 4HA-SIDC 41-918 em 5 hr pi As células foram coradas com anti-HA (vermelho) e anti-Legionella (verde) anticorpos e mancha DNA DAPI (azul) para visualizar os núcleos. 4HA-SIDC 41-918 foi observada WT circundante, mas não Δ Dota, bactérias. Barra de escala de 5 mM. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> Figura 4. L. pneumophila replica dentro G. mellonella de um modo Dot / Icm-dependente. larvas foram infectadas com pneumophila WT ou Δ DOTA L. e a 0, 5, 18, ​​e 24 hr pi da hemolinfa de três insectos infectadas reunidas, colocadas em placas de CYE e o CFU determinada e normalizada para o inoculo e com o peso de hemolinfa extraída. WT L. pneumophila replicado ao longo do experimento, enquanto a tensão Δ Dota foi liberado dentro de 18 horas pi Os resultados são a média de três experimentos separados ± desvio padrão. <img alt="Figura 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> Figura 5. Infecção com WT L. Resultados pneumophila em destruição de hemócitos significativa. Hemócitos foram extraídos a 5, 18, ​​e 24 hr pi de larvas infectadas com pneumophila WT ou Δ DOTA L. e contadas as células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Nenhuma diferença nanúmero de células foi observada em 5 horas pi entre as cepas porém em 18 horas pi apenas aproximadamente 15% dos hemócitos em larvas permanecem infectados com a cepa WT em comparação com a cepa Δ Dota. Os resultados são a média de três experiências separadas, ± desvio-padrão.

A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar as larvas da traça-da-cera Galleria mellonella para analisar a patogênese do patógeno bacteriano Legionella pneumophila. Para começar, isso é realizado infectando as larvas com cepas de L. pneumophila por injeção durante as próximas 72 horas.A indução da mortalidade larval é indicada pela perda de mobilidade e pelo aparecimento de pigmentação escura; as larvas são sacrificadas para coleta do hemolinfa em diferentes momentos. O hemolinfa é então plaqueado para enumerar as bactérias e visualizar as células do inseto. Em última análise, a análise do crescimento bacteriano e o uso de microscopia de imunofluorescência fornecem informações sobre o nicho intracelular estabelecido pela *Legionella* durante uma infecção *in vivo* e as diferenças na virulência entre cepas.A principal vantagem desta técnica em relação aos modelos de camundongo e cultura celular para legionela é que ela é eticamente mais aceitável e permite uma análise rápida e economicamente viável de um grande número de cepas de Legionella em um organismo multicelular, demonstrando que o procedimento será claro. Harding, um estudante de doutorado do meu laboratório, trabalhe sempre com L. pneumophila em nível de contenção de biossegurança dois, dentro de cabines de segurança microbiana, conforme as normas locais; primeiramente, incube as placas bacterianas por quatro dias. Em seguida, um dia antes de infectar as larvas, ressuspenda um loop completo de bactérias, contendo várias colônias, em um mililitro de caldo AYE pré-aquecido e meça a absorbância da suspensão em 600 nanômetros.A seguir, inocule um novo cultivo de três mililitros de YE com uma DO600 de 0,1. Incube os cultivos a 37 graus Celsius em agitador a 200 rpm por 21 horas, até a fase pós-exponencial, para que possam ser usados na infecção. Meça a absorbância das suspensões a 600 nanômetros.Em seguida, dilua a cultura para obter um bilhão de UFC por mililitro. Em DPBS, prepare um recipiente para as larvas de melanoma G colocando um papel-filtro circular de 10 centímetros no fundo de uma placa de Petri de 10 centímetros usando pinça de ponta romba. Coloque 10 larvas saudáveis de tamanho aproximadamente igual sobre o papel-filtro e descarte os insetos doentes, de coloração marrom ou com aparência manchada.Larvas saudáveis são uniformemente de cor creme, sem áreas de escurecimento escuro, e são capazes de se mover rapidamente. Se viradas, prepare a plataforma de injeção fixando papel-filtro em uma cabine de segurança. Em seguida, fixe uma ponteira P 1000 no papel-filtro.Agora, esterilize uma seringa de microtitulação de 20 microlitros aspirando etanol 70% e incubando a seringa em etanol 70% por pelo menos 10 minutos. Remova qualquer resíduo de etanol da seringa aspirando e expelindo água estéril várias vezes. Em seguida, aspire 10 microlitros da suspensão de L. pneumophila com 1 bilhão de UFC por mililitro.Retire uma larva com cuidado, mas com firmeza. Vire-a de modo que suas costas fiquem curvadas sobre a ponta de pipeta P1000.Coloque a ponta da seringa sobre a pata pro anterior direita da larva. Em seguida, insira suavemente a ponta da agulha na pata pro. Certifique-se de que a agulha está dentro da larva e de que a inserção é suave.Injete todo o bolo de 10 microlitros. Se a seringa estiver inserida corretamente, deve ser possível pegar as larvas usando apenas a seringa e transferi-las para a câmara. Injete um total de 10 larvas por condição e injete outras 10 larvas apenas com DPBS como controles.O processo de injeção é o mais tecnicamente desafiador do procedimento e exigirá prática. Por fim, feche as placas com fita adesiva e coloque-as em contenção secundária. Armazene-as a 37 graus Celsius durante toda a duração do experimento.A mortalidade deve ser analisada em vários momentos após a infecção. Para examinar a mortalidade das larvas infectadas, utilize pinças de ponta romba para virar as larvas e observar o movimento das pernas. Larvas saudáveis devem se contorcer rapidamente.A pigmentação indica uma reação imune intensa à infecção. Se houver qualquer movimento, conte as larvas como vivas em diversos momentos. Selecione aleatoriamente três larvas e coloque-as em um tubo de 14 mililitros.Coloque o tubo no gelo por cinco a 10 minutos até que nenhum movimento das patas seja observado. Em seguida, transfira as larvas para uma placa de Petri. Agora, use um bisturi para fazer uma incisão entre dois segmentos próximos à cauda para coletar o hemolinfa de cada larva.Mantenha os cortes afastados do intestino para evitar contaminação por bactérias intestinais. Esprema o hemolinfa das larvas para dentro de um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mililitro. Uma única larva fornece entre 15 e 50 microlitros de hemolinfa.Agora, o hemolinfa deve ser usado dentro de 10 minutos, caso contrário coagulará, o que determina a viabilidade do inseto. Os hemócitos são misturados com 20 microlitros do hemolinfa com 20 microlitros de solução de azul de trian em um poço de uma placa de 96 poços; carregue três poços dessa maneira. Incube as reações por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, para cada reação, utilize 10 microlitros para contar as células viáveis não azuis com um hemocitômetro. Para processar os hemócitos para microscopia, pipete a coleta de hemolinfa sobre uma lamínula de vidro de 10 a 15 milímetros em uma placa de 24 poços.Em seguida, adicione 0,5 mililitros de DPBS e misture bem o hemolinfa com agitação suave. Usando um suporte para placa de centrífuga hermético a aerossóis, centrifugue a placa por 10 minutos a 500 ×g em temperatura ambiente. Em seguida, examine cada poço utilizando um microscópio invertido para verificar se os hemócitos aderiram.Em seguida, remova o sobrenadante e lave cuidadosamente as células três vezes, adicionando 0,5 mililitros de DPBS à parede do poço. Agite a placa algumas vezes e aspire o DPBS. Detalhes sobre fixação e coloração são fornecidos no protocolo descrito no texto.Para quantificar as UFC bacterianas, faça diluições seriadas decimais do hemolinfa em meio YE estéril. Em seguida, divida a base de uma placa CYE contendo micina SPECT em seis setores iguais. Plaque três gotas de 25 microlitros de cada diluição, começando com a diluição mais diluída em cada seção da placa.Incube essas placas e posteriormente conte as colônias. Larvas de G. mellonella foram infectadas com cepas selvagens e deficientes em ICM de L. pneumophila. A infecção com 10 milhões de UFC da cepa um 30 B resultou em 100% de mortalidade dentro de 24 horas.No entanto, a linhagem delta A, que não possui um sistema de secreção tipo IV ICM T funcional, era virulenta, o que determinou se a internalização das bactérias é crucial para sua patogênese. Neste modelo, as larvas foram pré-tratadas com citocalasina D e, em seguida, infectadas; o tratamento com o inibidor isoladamente não afetou a sobrevivência em 24 horas, no entanto, larvas pré-tratadas e infectadas exibiram uma sobrevivência significativamente maior em comparação com os controles. A fim de validar a expressão e determinar a localização subcelular de uma proteína efetora em *g Melan* *Legionella*, expressando um fragmento do efetor bem definido localizado na VCL.SID C fundido a quatro marcadores HA terminais foi usado para infectar as larvas e analisado por microscopia para acompanhar a cinética de replicação bacteriana. As larvas foram sacrificadas em vários momentos após a infecção e a UFC por grama de hemolinfa extraída foi determinada. Após uma queda inicial às cinco horas, as UFCs das bactérias selvagens aumentam. No entanto, a linhagem delta a não sofre replicação e é eliminada até 18 horas. Hemócitos foram extraídos dos insetos infectados e as células viáveis foram contadas utilizando o método de exclusão com azul de tripano. A cinco horas após a infecção, não houve diferença.Incyte conta entre as cepas. No entanto, após 18 horas houve uma queda significativa na concentração de hemo no tipo selvagem, mas não nas larvas infectadas com delta A. Esse resultado in vivo sugere que L. pneumophila se replica dentro das hécitos e depois as lisa.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como infectar larvas, extrair hemolinfa e processar hemócitos para analisar vários aspectos da patogênese da legionela.

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