Submillisecond alterações na conformação das proteínas resolvidas por Photothermal Boca deflexão

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar as mudanças conformacionais associadas à ligação de ligantes aos transdutores de cálcio em escala de tempo submilissegundo. A transição conformacional entre a proteína APO e a proteína ligada ao cálcio é desencadeada pela clivagem fotoquímica de um composto de cálcio engaiolado, o cálcio DM nitro, que leva à liberação fotoquímica de cálcio livre. A alteração associada no índice de refração é medida como um deslocamento do feixe sonda utilizando um detector sensível à posição quádruplo.

Em seguida, as curvas de desvio do feixe fototérmico são medidas em função da temperatura para a amostra e para o padrão. A análise conjunta das curvas de desvio do feixe fotoacústico fornece informações sobre o mecanismo da comutação conformacional induzida por cálcio em termos de variações de volume e entalpia. A principal vantagem do desvio do feixe fototérmico em relação aos métodos existentes, como o fluxo turbulento, é que esta técnica permite a detecção simultânea de variações de volume e entropia em escala de tempo submilissegundo.

A demonstração visual desta técnica é necessária, pois o alinhamento preciso do instrumento é fundamental para a recuperação dos parâmetros termodinâmicos. O procedimento será demonstrado por Walter Gonzalez, aluno de pós-graduação do meu laboratório. Realize a preparação da amostra e todas as manipulações com a amostra em um ambiente escuro para evitar qualquer liberação não desejada. Neste vídeo, os passos são demonstrados sob luz, por motivos de filmagem.

Para começar, solubilize o DM Nitro em tampão 50 milimolar de heaps com 100 milimolar de cloreto de potássio, pH 7,0, até uma concentração final de 400 micromolar. Adicione cloreto de cálcio a partir da solução estoque 0,1 molar para atingir a proporção desejada de cálcio em relação à concentração de DN nitro. Em seguida, solubilize o composto de referência cianeto de potássio ou cromato de sódio no mesmo tampão.

No que diz respeito à amostra, consulte o protocolo textual para obter um esquema da configuração experimental básica da deflexão do feixe fototérmico. Ao montar o experimento, propague o feixe sonda através do centro de uma célula, colocada em um suporte de célula com controle de temperatura. Em seguida, utilizando um orifício de pinhole, ajuste o diâmetro do feixe sonda para um milímetro; use um segundo espelho atrás da amostra para centralizar o feixe sonda no centro do detector sensível à posição.

Focalize o feixe pro no centro do detector, de modo que a diferença na tensão entre os dois díodos superiores e os dois díodos inferiores, bem como a diferença na tensão entre os dois díodos do lado esquerdo e direito do detector, seja zero. Em seguida, ajuste o diâmetro do feixe de bombeamento, uma saída de 355 nanômetros de um laser ND YAG. Utilizando um orifício de três milímetros colocado entre dois espelhos laser de 355 nanômetros, faça o feixe de bombeamento co-propagar através do centro do vete.

É importante que ambos os feixes a laser se propaguem através do centro da célula óptica de maneira quase colinear. Para obter um ângulo de desvio mensurável e, consequentemente, alta amplitude do sinal de desvio do feixe fototérmico ou PBD, utilize um composto de referência para alinhar os feixes de sonda e de bombeamento, de modo a obter um sinal PBD satisfatório, caracterizado por uma boa relação sinal-ruído e amplitude PBD estável em escalas de tempo mais longas. Em seguida, posicione o feixe de bombeamento em relação ao feixe de sonda mediante ajuste incremental dos espelhos do laser de 355 nanômetros.

Meça a amplitude do sinal de referência PBD como a diferença entre os dois fotodiodos superior e inferior no detector sensível à posição. O sinal PBD deve apresentar um aumento rápido na amplitude em uma escala de tempo rápida e permanecer estável na escala de tempo de 100 milissegundos. Verifique a linearidade na amplitude do sinal PBD em relação à energia térmica liberada, medindo a dependência linear do sinal PBD em função da potência do laser de excitação e do número de Einsteins absorvidos.

Mantenha a potência do laser abaixo de aproximadamente 1000 microjoules para evitar a absorção de múltiplos fótons. Além disso, mantenha a absorbância da amostra ou do composto de referência em um comprimento de onda de excitação inferior a 0,5 para evitar a redução da potência do feixe de bombeamento. Essas etapas garantirão a linearidade do sinal PBD.

Inicie com a medição dos traços de PBD. Como referência, coloque a solução do composto de referência em uma cubeta de quartzo e posicione a cubeta no suporte controlado por temperatura. Detecte o sinal de PBD de referência como uma função da temperatura na faixa de temperatura de 16 a 35 graus Celsius, com um incremento de temperatura de três graus Celsius.

A cada alteração de temperatura, verifique a posição do feixe do sensor no detector sensível à posição e reajuste-a para o centro do detector. Se necessário, verifique a linearidade do sinal do PBD conforme descrito no protocolo no texto.

Em seguida, coloque a solução da amostra na mesma célula óptica utilizada para o composto de referência, mantendo a mesma orientação da célula óptica da medição de referência. Prossiga com a detecção dos traços PBD da amostra na mesma faixa de temperatura utilizada para o referência e verifique a linearidade da amplitude do PBD da amostra. Considere a amplitude do sinal PBD de referência como a diferença entre o sinal PBD pré-gatilho e pós-gatilho.

De maneira semelhante, determine a amplitude da fase rápida e da fase lenta do sinal PBD da amostra. Para eliminar o parâmetro de resposta do instrumento, normalize a amplitude do sinal PBD da amostra pela amplitude do sinal PBD de referência. Para a referência, a razão entre o sinal da amostra e o sinal de referência fornece uma equação a partir da qual a liberação de calor para a solução e a variação de volume não térmica associada a uma reação fotoinduzida podem ser determinadas a partir do coeficiente angular e do intercepto do gráfico da razão das amplitudes multiplicada pela energia em função do termo dependente da temperatura, permitindo determinar a variação de volume e entalpia da reação para os processos rápido e lento. Em seguida, normalize as variações de volume e entalpia observadas de acordo com o rendimento quântico apropriado.

De acordo com as equações encontradas no protocolo textual, as amplitudes e tempos de vida para os passos individuais são analisados ajustando os dados à função dependente do tempo que descreve as mudanças de volume e entalpia. A amplitude do passo rápido corresponde à amplitude da fase imediata do sinal PBD da amostra e a amplitude do passo subsequente corresponde à amplitude da fase lenta do sinal PBD da amostra. Para cada processo individual, a partir da dependência com a temperatura da constante de velocidade para os processos individuais, os parâmetros de entalpia e entropia de ativação podem ser facilmente determinados usando gráficos IR.

Um exemplo representativo de traços de PBD para a liberação fotoinduzida de cálcio a partir do DM nitro de cálcio é mostrado aqui. A fase rápida corresponde à clivagem fotoinduzida do DM nitro de cálcio e à liberação de cálcio, enquanto a fase lenta reflete a ligação de cálcio à gaiola não fotodegradada. O traço de PBD para a associação de cálcio ao domínio C-terminal do sensor neuronal de cálcio downstream regulatory element antagonist, regulator, ou dream é mostrado aqui após a fotodissociação de cálcio.

O ligando liberado pela luz se associa ao domínio C-terminal da dream com uma constante de tempo de 1,3 ± 0,3 milissegundos a 20 graus Celsius, a partir da dependência térmica da constante de velocidade observada. A barreira de ativação para a ligação de cálcio ao domínio C-terminal da dream foi determinada como sendo 9,2 ± 0,4 quilocalorias por mol. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de medir os traços de PBD da amostra em condições idênticas às do referencial.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras, alinhar instrumentação e analisar dados para obter um parâmetro termodinâmico reprodutível.