Submillisecond alterações na conformação das proteínas resolvidas por Photothermal Boca deflexão

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar as alterações de confirmação associadas à ligação do ligante aos transdutores de cálcio na escala de tempo submilissegundos. A transição de confirmação entre a proteína APO para a proteína ligada ao cálcio é desencadeada pela clivagem fotográfica de um composto de cálcio DM nitro enjaulado que leva à liberação fotográfica de cálcio livre. A mudança associada no índice de reflexão é medida como um deslocamento do feixe da sonda usando um detector sensível à posição quádrupla.

Em seguida, os traços de deflexão do feixe fototérmico são medidos em função da temperatura tanto para a amostra quanto para a referência. A análise composta dos traços de deflexão do feixe fotográfico fornece informações sobre o mecanismo de comutação de confirmação induzida por cálcio em termos de volume de reação e mudanças de entalpia. A principal vantagem da deflexão do feixe fototérmico sobre o mastro existente, como o fluxo superior, é que essa técnica permite uma detecção simultânea de mudanças de volume e entropia em escala de tempo inferior a um milissegundo.

A demonstração visual desta técnica é necessária, pois o alinhamento preciso do instrumento é fundamental para a recuperação dos parâmetros termodinâmicos. Demonstrando o procedimento estará Walter Gonzalez, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, Realize a preparação da amostra e todas as manipulações da amostra em uma sala escura para evitar qualquer desenjaulamento indesejado. Neste vídeo, as etapas são demonstradas à luz para fins de filmagem.

Para começar a solubilizar DM Nitro em pilhas de 50 milimolares, tampone 100 milimolares de cloreto de potássio, pH 7,0 a uma concentração final de 400 micromolares. Adicione cloreto de cálcio da solução de estoque 0,1 molar para obter a proporção desejável de concentração de cálcio para DN nitro. Em seguida, solubilizar o composto de referência cianeto de potássio ou cromato de sódio no mesmo tampão.

Quanto à amostra, consulte o protocolo de texto para obter um esquema da configuração experimental básica para a deflexão do feixe fototérmico. Ao configurar o experimento, propague o feixe de prob através do centro de uma célula, colocado em um suporte de célula com temperatura controlada. Em seguida, usando um orifício, ajuste o diâmetro do feixe da sonda para um milímetro, use um segundo espelho atrás da amostra para centralizar o feixe de sonda no centro do detector sensível à posição.

Concentre o feixe profissional no centro do detector de modo que a diferença na tensão entre os dois diodos superiores e os dois diodos inferiores, bem como a diferença na tensão entre os dois diodos no lado esquerdo e direito do detector seja zero. Posteriormente, molde o diâmetro do feixe da bomba, uma saída de 355 nanômetros de um laser ND YAG. Usando um orifício de três milímetros colocado entre 2.355 nanômetros, espelhos de laser copropagam o feixe da bomba através do centro do vete.

É importante que ambos os feixes de laser sejam propagados através do centro da célula óptica de maneira quase colinear. Para obter um ângulo de deflexão mensurável e, portanto, alta amplitude de deflexão do feixe fototérmico ou sinal PBD, use um composto de referência para alinhar a sonda e o feixe da bomba para obter um sinal PBD satisfatório caracterizado por uma boa relação sinal-ruído e amplitude PBD estável em escalas de tempo mais longas. Em seguida, posicione o feixe da bomba em relação ao feixe da sonda por ajuste incremental dos espelhos laser de 355 nanômetros.

Meça a amplitude do sinal de referência PBD como uma diferença entre dois fotodiodos superior e inferior no detector sensível à posição. O sinal PBD deve exibir um rápido aumento na amplitude em uma escala de tempo rápida e permanecer estável na escala de tempo de 100 milissegundos. Verifique a linearidade na amplitude do sinal PBD em relação à energia térmica liberada medindo a dependência linear do sinal PBD na potência do laser de excitação e no número de Einstein absorvidos.

Mantenha a potência do laser abaixo de aproximadamente 1000 micro joules para evitar a absorção de vários fótons. Além disso, mantenha a absorbância da amostra ou composto de referência em um comprimento de onda de excitação inferior a 0,5 para evitar a diminuição da potência do feixe da bomba. Essas etapas garantirão a linearidade do sinal PBD.

Comece com a medição dos traços PBD. Para referência, coloque a solução do composto de referência em uma célula de quartzo e posicione a célula no suporte com temperatura controlada. Detecte o sinal PBD de referência em função da temperatura na faixa de temperatura de 16 a 35 graus Celsius com um incremento de temperatura de três graus Celsius.

A cada mudança de temperatura. Verifique a posição do feixe de sonda no detector sensível à posição e reajuste a posição para o centro do detector. Se necessário, verifique a linearidade do sinal PBD conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, colocar a solução da amostra na mesma célula óptica utilizada para o composto de referência, mantendo a mesma orientação da célula ótica para a medição de referência. Prossiga para detectar os traços PBD da amostra na mesma faixa de temperatura da referência e verifique a linearidade da amplitude PBD da amostra. Considere a amplitude do sinal PBD de referência como a diferença entre o sinal PBD de disparo de pret e pós-disparo.

De maneira semelhante, determine a amplitude da fase rápida e lenta do sinal PBD da amostra. Para eliminar o parâmetro de resposta do instrumento, dimensione a amplitude do sinal PBD da amostra pela amplitude do sinal PBD. Para a referência, a razão entre o sinal da amostra e o sinal de referência fornece uma equação a partir da qual a liberação de calor para a solução e a mudança de volume não térmico associada a uma reação iniciada por foto podem ser determinadas a partir da inclinação e interceptação do gráfico da razão de amplitude multiplicada pela energia versus o termo dependente da temperatura para determinar o volume da reação e a mudança de entalpia para a escala de processo rápida e lenta, o volume e a entalpia observados mudam para o rendimento quântico apropriado.

De acordo com as equações encontradas no protocolo de texto, as amplitudes e tempos de vida das etapas individuais são analisados ajustando os dados à função dependente do tempo que descreve as mudanças de volume e entalpia. A amplitude do passo rápido corresponde à amplitude da fase rápida do sinal PBD da amostra e a amplitude da etapa subsequente corresponde à amplitude da fase lenta do sinal PBD da amostra. Para cada processo individual a partir da dependência da temperatura da constante de taxa para processos individuais, os parâmetros de entalpia e entropia de ativação podem ser prontamente determinados usando gráficos de infravermelho.

Um exemplo representativo de traços de PBD para liberação de foto de cálcio do nitro de DM de cálcio é mostrado aqui. A fase rápida corresponde à fotoclivagem do cálcio DM nitro e liberação de cálcio, enquanto a fase lenta reflete a ligação do cálcio à gaiola não fotografada. O traço PBD para a associação do cálcio ao domínio terminal C do antagonista, regulador ou sonho do elemento regulador a jusante do sensor neuronal de cálcio é mostrado aqui após a fotodissociação do cálcio.

O ligante liberado se associa ao domínio terminal C do sonho com a constante de tempo de 1,3 mais ou menos 0,3 milissegundos a 20 graus Celsius da dependência da temperatura da constante de taxa observada. A barreira de ativação para a ligação do cálcio ao domínio terminal C do sonho foi determinada em 9,2 mais ou menos 0,4 quilocalorias por mol. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de medir os traços PBD da amostra em condições idênticas às da referência.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras, alinhar instrumentação e analisar dados para obter um parâmetro termodinâmico reprodutível.