Análise videomorfométrica da vasoconstrição pulmonar hipoxica de artérias intra-pulmonares usando fatias pulmonares cortadas por precisão de murina

O objetivo geral deste procedimento é analisar a vasoconstrição pulmonar hipóxica de artérias pulmonares intrínsecas com diâmetros internos de 20 a 100 micrômetros. Isso é realizado primeiro preenchendo as vias aéreas dos pulmões com parafina de baixo ponto de fusão. O segundo passo consiste em usar um vibratomo para cortar os pulmões isolados em fatias com espessura de 200 micrômetros.

Em seguida, o aros é removido das secções pulmonares por incubação em meio aquecido a 37 graus Celsius, borbulhado com gás normóxico. Assim, as secções movem-se lentamente no fluido. Então, uma secção pulmonar individual é transferida para uma câmara de superfusão com fluxo contínuo, seguida por análise morfométrica em vídeo da vasorreatividade da artéria em corte transversal.

No final, são avaliadas alterações na área luminal do vaso em resposta a diferentes tratamentos. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia intravital de microvasos subpleurais, é que a medição da tensão vascular em artérias pulmonares proximais isoladas permite a análise quantitativa da reatividade da VA em artérias pulmonares com diâmetros entre 20 e 100 micrômetros. A demonstração do procedimento será feita por Anna Goldenberg e dois técnicos deste laboratório.

Imediatamente após sacrificar um camundongo por dislocação cervical, abra a cavidade abdominal, afaste os alças intestinais e seccione os grandes vasos abdominais para sangrar o animal. Em seguida, use uma tesoura fina para perfurar o diafragma. Isso faz com que os pulmões colabem devido à entrada de ar na cavidade pleural.

Continue cortando para destacar o diafragma da abertura torácica inferior. Agora corte as costelas e a clavícula lateralmente. Para remover a parte ventral da caixa torácica, retire o timo.

Encha uma seringa com tampão de perfusão morno. Em seguida, faça um pequeno orifício no ventrículo esquerdo do coração. Ajuste a saída do tampão de perfusão e perfunda lentamente a vasculatura pulmonar através do ventrículo direito até que os pulmões pareçam brancos.

Em seguida, remova as glândulas salivares, os pequenos músculos e o tecido conjuntivo da traqueia. Desconecte a traqueia do tecido conjuntivo circundante e insira um pedaço de fio de costura entre o esôfago e a traqueia para posterior ligadura. Em seguida, use uma tesoura microcirúrgica para cortar um pequeno orifício na parte superior da traqueia, entre duas cartilagens traqueais vizinhas.

Após encher uma seringa com agarose de ponto de fusão baixa aquecida a 37 graus Celsius, conecte-a a uma cânula plástica flexível e pressione o êmbolo lentamente até que o ar seja removido da cânula. Insira a cânula no pequeno orifício na traqueia e fixe-a cuidadosamente no lugar com fio de algodão. Em seguida, encha lentamente as vias aéreas com a agarose e observe os pulmões.

No início, o pulmão direito começa a se expandir, seguido pelo pulmão esquerdo. Após 30 a 40 segundos, o enchimento é concluído e ambos os pulmões estão inflados até um volume comparável à situação in vivo, que é cerca de 1,2 a 2,0 mililitros. Dependendo do sexo, idade e peso, é importante injetar a mistura de ovo rapidamente o suficiente para que não se solidifique durante o procedimento, mas não tão rapidamente a ponto de danificar os pulmões.

Após os pulmões serem preenchidos simultaneamente, retire a cânula de plástico e ligue a traqueia com o fio de algodão para evitar o vazamento dos aros. Em seguida, corte a traqueia acima da ligadura e remova os pulmões e o coração em bloco do tórax, transferindo os órgãos para tampão Ringer frio em gelo para solidificar os agros, o que ocorre em poucos minutos durante a espera. Use cola instantânea para fixar um pedaço de cortiça de champanhe ao suporte do espécime do vibrátomo, servindo como suporte para o tecido pulmonar. Após a solidificação dos agros, separe os lobos pulmonares individuais.

Em seguida, cole um lobo ao suporte do espécime com cola super forte. Para obter cortes transversais das pequenas artérias intra-aser, pegue o lobo cranial do pulmão direito e cole-o com a superfície do hilo ao suporte, utilizando um vibratome equipado com uma lâmina de barbear nova, cortando a partir da periferia, dividindo o lobo pulmonar em fatias de 200 mícrons de espessura. Para obter cortes transversais das artérias pre-aser maiores, alinhe o hilo do pulmão esquerdo com a rolha de champanhe e cole o lobo nesta orientação ao suporte, depois corte a partir da periferia para remoção dos aros.

Transfira as seções de órgãos para um béquer de vidro contendo cerca de 200 mililitros de MEM a 37 graus Celsius. Coloque o béquer em uma câmara de aquecimento e borbulhe com gás normóxico para que as seções pulmonares se movimentem lentamente no meio. Após cerca de duas horas, as placas de aros que preenchiam o ar terão sido removidas do tecido pulmonar e as seções terão sedimentado no fundo do béquer.

Para a análise morfométrica por vídeo de artérias intra-pulmonares, transfira um corte de pulmão para a câmara de superfusão com fluxo contínuo, que está montada sobre um microscópio e preenchida com 1,2 mililitros de MEM gaseificado normóxico. Fixe o corte de pulmão na base da câmara com fios de náilon conectados a um anel de platina. Inicie a perfusão da câmara com meio gaseificado normóxico.

Utilize um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10x para examinar a seção pulmonar em busca de artérias em corte transversal com diâmetros internos entre 20 e 100 micrômetros. Após localizar um vaso candidato razoável, utilize a objetiva de 20x para capturar uma imagem de uma artéria pré-acinosa ou, como mostrado aqui, a objetiva de 40x para capturar uma imagem de uma artéria intra-acinosa para a medição do diâmetro interno do vaso. Antes de iniciar o experimento, configure o software para capturar imagens da artéria em corte transversal a cada minuto durante todo o experimento.

Após acionar a fotografia, continue a perfusão da câmara com meio gasoso normóxico por 10 minutos. Em seguida, banhe a seção pulmonar em U 466 19 por 10 minutos sem fluxo, a fim de analisar a contratilidade da artéria, utilizando apenas vasos cujas áreas luminas foram reduzidas em pelo menos 30% com o U 466 19. Lave o fármaco com meio gasoso normóxico por 10 minutos.

Em seguida, dilate a artéria pela aplicação de res por 10 minutos sem fluxo baixo. Novamente, remova a droga com uma lavagem de 10 minutos com meio gaseificado normóxico a uma taxa de fluxo de seis mililitros por minuto, seguida por 10 minutos a um fluxo de 0,7 mililitros por minuto. A seguir, incube a fatia pulmonar com meio gaseificado hipóxico elevado por 40 minutos.

Também direcione a mistura gasosa hipóxica para o espaço aéreo da câmara de perfusão por meio de um conjunto adicional de tubos. Remova o meio hipóxico com uma lavagem de 20 minutos com meio gaseificado normóxico e troque o fluxo gasoso de hipóxico para normóxico no espaço aéreo da câmara para verificar a viabilidade do vaso. Ao final do experimento, adicione U 466 19 à câmara de perfusão e incube por 20 minutos sem fluxo para induzir vasoconstrição.

Repita esses passos com uma nova seção de pulmão para medir a reatividade vascular de outro vaso. Inicie a análise carregando as imagens das artérias em corte transversal em um programa de análise de imagem. Em seguida, utilize um cursor para delinear a área luminal do vaso.

A secagem da mão é necessária, pois evita artefatos devido, por exemplo, a células sanguíneas aderidas à parede vascular. Continue a analisar as imagens em corte transversal de maneira semelhante. Cada imagem deve ser analisada quando uma condição no fluxo através da câmara de incubação é alterada para outra; no entanto, analisar a cada duas imagens é suficiente quando as condições não estão mudando.

A vasoconstrição pulmonar hipóxica é observável nestas imagens de contraste de fase de uma artéria pré-ASIN seccionada, que corre em estreita proximidade com um brônquio seccionado. As imagens foram obtidas nos pontos temporais indicados pelos círculos no gráfico: no início da medição, no final da medição com U 466 19, no final da exposição às RAs após 30 ou 40 minutos em meio enriquecido com gás hipóxico, após lavagem com meio enriquecido com gás normóxico e após a aplicação final de U 466 19. A reatividade vascular é registrada como mudanças relativas da área luminal da artéria seccionada em função do tempo. A área no início do experimento é definida como 100%, e a vasoconstrição é expressa como valores relativos à área inicial.

Neste caso, a exposição à hipóxia induz uma redução de 60% na área luminal para uma apresentação mais clara da resposta hipóxica. A fase inicial do experimento, na qual a reatividade vascular foi testada, não é mostrada aqui, e o valor obtido imediatamente antes da exposição ao oxigênio reduzido é definido como 100%. O outro tipo de vaso examinado nestes estudos são as artérias intra-ASIN, localizadas nas dobras dos septos alveolares. Neste conjunto de experimentos, analisa-se o impacto de sidal, um abridor não seletivo dos canais de potássio sensíveis ao ATP mitocondrial, sobre a vasoconstrição pulmonar hipóxica de pequenas artérias intra-asner, para esta finalidade.

As fatias são incubadas em meio hipóxico. Na ausência ou presença de 50 micromolar de sidal, controles de incubação são realizados em meio gasoso normóxico para uma apresentação mais clara da resposta à normóxia ou hipóxia ou hipóxia mais sidal. Os valores obtidos imediatamente antes da exposição ao meio gasoso normóxico ou hipóxico são definidos como 100%. A artéria exposta à pineal não exibe uma redução na área, como ocorre com a artéria incubada em meio hipóxico sem aditivos.

No meio normóxico, nenhuma alteração na área luminal é detectável. Os registros de pequenas artérias intra-ASIN expostas ao meio gástrico hipóxico com ou sem 50 micromolares de sidal são apresentados como médias mais ou menos SEM. Neste gráfico, os dados relativos em relação ao valor no início da incubação hipóxica são mostrados.

Nenhuma reatividade vascular é detectável. Nos cortes de pulmão expostos a gás hipóxico, a constrição vascular induzida por U 466 19 no meio não é afetada pela droga. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar cortes finos de pulmão com precisão, cortar fatias de pulmão e como utilizá-las para a medição quantitativa da reatividade vascular de pequenas artérias intra-alveolares com diâmetros entre 20 e 40 micrômetros, localizadas nos septos alveolares, e de artérias pré-alveolares maiores com diâmetros entre 40 e 100 micrômetros, que correm adjacentes a brônquios e bronquíolos.