Análise videomorfométrica da vasoconstrição pulmonar hipoxica de artérias intra-pulmonares usando fatias pulmonares cortadas por precisão de murina

O objetivo geral deste procedimento é analisar a vasoconstrição pulmonar hipóxica de artérias intrapulmonares espelhadas com diâmetros internos de 20 a 100 mícrons. Isso é feito primeiro preenchendo as vias aéreas dos pulmões com aros de baixo ponto de fusão. O segundo passo é usar um vibrador para cortar os pulmões isolados em fatias de 200 mícrons de espessura.

Em seguida, o aros é removido das seções pulmonares por incubação a 37 graus Celsius, meio quente, que é borbulhado com gás normóxico. Assim, as seções se movem lentamente no fluido. Em seguida, uma seção pulmonar individual é transferida para um fluxo através da câmara de superfusão, seguida por análise morfométrica em vídeo da reatividade vaso da artéria transversal.

Em última análise, são avaliadas as alterações na área luminal do vaso em resposta a diferentes tratamentos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a microscopia intravital de microvasos subpleurais, é a medida da tensão vascular em artérias pulmonares proximais isoladas, pois permite a análise quantitativa da reatividade do VA de artérias intrapulmonares com diâmetros entre 20 e 100 micrômetros. Demonstrando o procedimento estarão Anna Goldenberg e dois técnicos deste laboratório.

Imediatamente após matar um camundongo por luxação cervical, abra a cavidade abdominal, mova as alças intestinais para o lado e corte os grandes vasos abdominais para sangramento. Em seguida, use uma tesoura fina para penetrar no diafragma. Isso faz com que os pulmões entrem em colapso como resultado da entrada de ar na cavidade pleural.

Continue cortando para separar o diafragma da abertura torácica inferior. Agora corte as costelas e a clavícula lateralmente. Para remover a parte ventral da caixa torácica, retire o timo.

Encha uma seringa com tampão de perfusão quente. Em seguida, faça um pequeno orifício no ventrículo esquerdo do coração. Ajuste o fluxo de saída do tampão de perfusão e perfunda a vasculatura pulmonar lentamente através do ventrículo direito até que os pulmões pareçam brancos.

Em seguida, remova as glândulas salivares, pequenos músculos e tecido conjuntivo da traqueia. Desconecte a traqueia do tecido conjuntivo circundante e insira um pedaço de algodão de costura entre o esôfago e a traqueia para ligadura posterior. Em seguida, use uma micro tesoura para cortar um pequeno orifício na parte superior da traqueia entre duas cartilagens traqueais vizinhas.

Depois de encher uma seringa com 37 graus Celsius, quente e baixo ponto de fusão, conecte-a a uma cânula de plástico flexível e empurre o êmbolo lentamente até que o ar seja removido da cânula. Insira a cânula no pequeno orifício da traqueia e fixe-a cuidadosamente no lugar com algodão de costura. Em seguida, encha lentamente as vias aéreas com o aros e observe os pulmões.

No início, o pulmão direito começa a se expandir, seguido pelo pulmão esquerdo. Após 30 a 40 segundos, o enchimento é concluído e ambos os pulmões são inflados a um volume comparável à situação in vivo, que é de cerca de 1,2 a 2,0 mililitros. Dependendo do sexo, idade e peso, É importante injetar a rosa do ovo rápido o suficiente para que ela não se solidifique durante o procedimento, mas não tão rápido a ponto de danificar os pulmões.

Depois que os pulmões estiverem cheios simultaneamente, puxe a cânula de plástico e ligue a traqueia com o algodão de costura para evitar vazamento do aros. Posteriormente, corte a traqueia acima da ligadura e para separar os pulmões e o coração em bloco do tórax, transfira os órgãos para um tampão de campainha gelado para solidificar os agros, o que acontece em poucos minutos enquanto espera. Use super cola para prender um pedaço de rolha de champanhe ao suporte da amostra do vibrador para atuar como uma inclinação para o tecido pulmonar Depois que o agros solidificar, separe os lobos pulmonares individuais.

Em seguida, super cola, um lóbulo para o suporte da amostra. Para obter seções transversais das pequenas artérias intra-asner, pegue o lobo cranial do pulmão direito e cole-o com a superfície do hilo no suporte, usando um vibrato equipado com uma lâmina de barbear fresca cortada da periferia, cortando o lóbulo do pulmão em fatias de 200 mícrons de espessura. Para obter seções transversais das artérias pré-aser maiores, alinhe o hilo do pulmão esquerdo com a rolha de champanhe e cole o lóbulo nesta orientação ao suporte, depois corte da periferia para remoção do aros.

Transfira as seções do órgão para um copo de vidro cheio de cerca de 200 mililitros de 37 graus Celsius. O MEM colocou o béquer em um gabinete de aquecimento e borbulhou com gás normóxico para que as seções pulmonares se movam lentamente no meio. Após cerca de duas horas, as placas aros que enchem o ar terão sido removidas do tecido pulmonar e as seções terão se depositado no fundo do copo.

Para análise morfométrica de vídeo das artérias intrapulmonares, transfira uma seção pulmonar para o fluxo através da câmara de superfusão, que é montada em um microscópio e preenchida com 1,2 mililitros de gás normóxico. MEM. Fixe a seção pulmonar na parte inferior da câmara com cordas de náilon conectadas a um anel de platina. Comece a perfundir a câmara com meio gaseificado normóxico.

Use um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10 x para escanear a seção pulmonar em busca de artérias seccionadas transversais com diâmetros internos entre 20 e 100 mícrons. Uma vez que um vaso candidato razoável seja localizado, use a objetiva 20 x para tirar uma foto de um vaso pré-asner ou, como mostrado aqui, a objetiva 40 x para tirar uma foto de uma artéria intra asner para medição do diâmetro interno do vaso. Antes de iniciar o experimento, configure o software para tirar fotos da artéria transversal a cada minuto durante todo o experimento.

Depois de disparar a fotografia, continue a perfusão da câmara com meio gast normóxico por 10 minutos. Em seguida, banhe a seção pulmonar em U 466 19 por 10 minutos sem fluxo para analisar a contratilidade da artéria usando apenas vasos cujas áreas luminais foram reduzidas em pelo menos 30%Com o U 466 19. Lave o medicamento com meio normóxico por 10 minutos.

Em seguida, dilate a artéria pela aplicação de res por 10 minutos sem fluxo baixo. Novamente, remova o medicamento com uma lavagem de 10 minutos com meio gasoso normóxico a uma taxa de fluxo de seis mililitros por minuto, seguido de 10 minutos a um fluxo de 0,7 mililitros por minuto. Em seguida, incubar o corte pulmonar com meio gaseificado com alta hipóxia por 40 minutos.

Flua também a mistura de gases hipóxicos para o espaço aéreo da câmara de perfusão por meio de um conjunto adicional de tubos. Remover o meio hipóxico com uma lavagem de 20 minutos com meio gasoso normóxico e mudar do fluxo de gás hipóxico para o fluxo de gás normóxico para o espaço aéreo da câmara para verificar a viabilidade do recipiente. No final do experimento, aplicar U 466 19 na câmara de perfusão e incubar por 20 minutos sem fluxo para induzir vasoconstrição.

Repita essas etapas com uma seção pulmonar fresca para medir a reatividade vaso de outro vaso. Comece a análise carregando as imagens das artérias seccionadas transversais em um programa de análise de imagens. Em seguida, use um cursor para delinear a área luminal do vaso.

A secagem das mãos é necessária, pois evita artefatos devido, por exemplo, às células sanguíneas presas à parede vascular. Continue a analisar as imagens transversais de maneira semelhante. Cada imagem deve ser analisada quando uma condição no fluxo através da câmara de incubação é alterada para outra, mas a análise de todas as outras imagens é suficiente quando as condições não estão mudando.

A vasoconstrição pulmonar hipóxica é observável nessas imagens de contraste de fase de uma artéria pré-ASIN de secção transversal, que corre próxima a um brônquio de secção transversal. As imagens são tiradas em pontos de tempo indicados por círculos no gráfico no início da medição, no final da medição, com U 466 19 no final da exposição a ARs após 30 ou 40 minutos em meio gaseificado hipóxico, após lavagem com meio gaseificado normóxico, e após a aplicação final de U 466 19, a reatividade vaso é registrada como alterações relativas da área luminal da seção transversal artéria contra o tempo. A área no início do experimento é definida como 100% e a vasoconstrição é dada como valores relativos à área inicial.

Nesse caso, a exposição à hipóxia induz uma redução de 60% da área luminal para uma apresentação mais clara da resposta hipóxica. A fase inicial do experimento em que a reatividade vasal foi testada não é mostrada aqui, e o valor obtido imediatamente antes da exposição ao oxigênio reduzido é fixado em 100%O outro tipo de vasos examinados nesses estudos são as artérias intra-ASIN, localizadas em reforços de septos alveolares. Neste conjunto de experimentos, o impacto do sidal, um abridor não seletivo de canais de potássio sensíveis a A TP mitocondrial na vasoconstrição pulmonar hipóxica de pequenas artérias intra-asner, é analisado para esse fim.

As fatias são incubadas em meio hipóxico. Na ausência ou presença de 50 micromolares, as incubações de controle sidal são realizadas em meio gast normóxico para uma apresentação mais clara da resposta à normóxia ou hipóxia ou hipóxia mais sidal. Os valores obtidos imediatamente antes da exposição ao meio gast normóxico ou hipóxico são fixados em 100%A artéria exposta à pineal não apresenta diminuição da área, assim como a artéria incubada em meio hipóxico sem aditivos.

Em meio normóxico, nenhuma alteração na área luminal é detectável. Os registros de pequenas artérias intra-ASIN expostas a meio gast hipóxico com ou sem 50 micromolares sidal são apresentados como médias mais ou menos MEV. Neste gráfico, são mostrados os dados relativos em relação ao valor no início da incubação hipóxica.

Nenhuma reatividade vaso é detectável. Nas fatias pulmonares expostas à hipoxia, o meio contendo vasoconstrição pineal induzida por U 466 19 não é afetado pela droga. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar a precisão do espelho, cortar fatias de pulmão e como usá-las para a medição quantitativa da reatividade VA de pequenas artérias intra-asina com diâmetros entre 20 e 40 micrômetros, que estão localizadas em Gass de septos alveolares, e de artérias pré-Athena maiores com diâmetros entre 40 e 100 micrômetros, que correm ao lado de Bronchi e Bronchioli.