Name: Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T20:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Aprenda a usar células humanas bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade. Este método permite avaliar a atividade metabólica celular sem destruir amostras, facilitando triagens de alta vazão em toxicologia.

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Estes esforços de pesquisa foram apoiadas pela Divisão de Ciência da Fundação Nacional de Química, Bioengenharia, ambiental e sistemas de transporte (CBET) sob os números prêmio Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental (NIEHS) CBET e CBET-0853780-1159344 e do National Institutes of Health, sob o número prêmio 1R43ES022567-01, e do Instituto Nacional do Câncer, do Programa de Imagem Câncer sob o número prêmio CA127745-01. O IVIS Lumina instrumento utilizado neste trabalho foi obtido a partir do Programa de Instrumentação Exército dos EUA Defense University Research.

1. Preparação celular <ol><li> Recuperar um frasco de bioluminescentes HEK293 de azoto estoque congelada líquido e fazê-los crescer em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,01 mM de aminoácidos não essenciais, 1 x antibiótico-antimicótico e 0,01 mM de piruvato de sódio num t 75 frascos de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. Nota: Os meios de comunicação e componentes complementares varia de acordo com linhas de células e, portanto, deve ser escolhido de acordo. </li><li> Atualizar média a cada 2-3 dias até atingir ~ 80% de confluência. Nota: A quantidade de células necessárias irá basear-se no desenho experimental. Se necessário, mais as células podem ser obtidas por sub-culturas. </li><li> Células colheita para testes. <ol><li> Remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS), agitando suavemente o balão e, em seguida, descartando o gasto de PBS. </li><li> Adicionar tripsina e incubar a 37 ° C durante 2 min,ou até que as células foram separadas do balão. </li><li> Recolha das células isoladas com PBS e transferi-las para um tubo de centrífuga limpo. Nota: Se as linhas de células não aderentes são usados, celas separadas por centrifugação e lave uma vez com PBS. </li></ol></li><li> Determinar a contagem total de células utilizando um hemacitómetro, ou outro sistema de contagem de células. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em fresco, médio pré-aquecido. </li><li> Sementes de igual número de células em poços individuais de uma placa multi-bem opaco. Neste exemplo, a placa 5 x 10 5 células em um mL de volume em cada poço de uma placa de 24 cavidades preta 1. Placa de um volume igual de meio em poços em triplicado para actuar como controlo negativo. Nota: o número de células colocadas em cada poço, é flexível e pode ser optimizado para as experiências individuais. Para cada linha celular bioluminescente, determinar experimentalmente a relação entre o número de células e biolumiNESCent saída, bem como a célula mínima detectável contar antes de quaisquer testes de toxicidade. Para fazer isso, a bioluminescência medida através de uma vasta gama de tamanhos da população (por exemplo, 1 x outubro 3-01 x 10 6 culas) em condições padronizadas de imagem. </li><li> Tratar as células com o composto de teste (s), como descrito abaixo. </li></ol> 2. Preparação química <ol><li> Preparar o produto químico a ser testado como uma solução de reserva concentrada. Neste exemplo, o uso de 100 mg / ml de solução de um antibiótico da família da bleomicina. Nota: Para minimizar os potenciais efeitos tóxicos à base de veículo, especialmente se um solvente orgânico é utilizado como um veículo para a adição de produtos químicos, recomenda-se que a concentração de Estoque ser de pelo menos 1000 vezes a concentração pós-aplicação desejada. </li><li> Adicionar o material químico preparado directamente para as células. Neste exemplo, a dose do antibiótico de interesse em concentrações finais de 100, 200, 300 e 400 ug / ml em triplicate poços. Adicione três poços de células não tratadas como controlos. Nota: A concentração final do produto químico alvo devem ser selecionados com base em objetivos experimentais específicos. Uma vasta gama de concentrações é normalmente testados para obter um espectro completo dos efeitos tóxicos. </li></ol> 3. Imagem e Análise de Dados <ol><li> Imediatamente após a adição de produtos químicos, coloque a placa na câmara de imagem do instrumento adequado para aquisição de imagem e medição da bioluminescência. </li><li> Bioluminescência de medida a cada 15 minutos ao longo de um período de 24 horas utilizando um tempo de integração de 10 minutos para cada leitura. Nota: O tempo de integração usado neste exemplo é em uma base por placa e pode ser ajustado para a medição sobre uma base por poço usando outros luminómetros de escolha. O tempo de integração também podem ser ajustados com base na linha celular escolhida bioluminescente. Porque bioluminescência é produzida de forma autônoma sem destruição celular ou qualquer estímulo externo, lermentos podem ser tomadas em qualquer ponto de tempo desejado para cumprir objetivos experimentais específicos. </li><li> Quantificar a intensidade bioluminescente de cada poço através da identificação de uma região de interesse usando software compatível. Mostrar a saída de luz, quer como o fluxo total (fotões / segundo) ou a radiância média (fotões / segundo / cm steridian 2 /) de cada amostra. </li></ol>

<ol><li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+really+FDA+approved%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FDA+Consumer+Health+Information%22%5BJournal%5D)">Is it really FDA approved?</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicology+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li>
<li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+cell+culture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li>
<li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+human+ADME%2FTox+drug+properties+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li>
<li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li>
<li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li>
<li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+bacterial+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of bacterial bioluminescence.</a> Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).</li>
<li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+%28lux%29+in+a+mammalian+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441(2010).</li>
<li>Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).</li>
<li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li>
<li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+8371%2C+Sensing+Technologies+for+Global+Health%2C+Military+Medicine%2C+Disaster+Response%2C+and+Environmental+Monitoring+II%3B+and+Biometric+Technology+for+Human+Identification+IX%22%5BJournal%5D)">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li>
<li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase%2C+firefly+luciferase%2C+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441(2011).</li>
</ol>

DM Close, SA Ripp, e GS Sayler são fundadores e proprietários de 490 BioTech, Inc.

Este método demonstra o uso de células de mamíferos bioluminescentes autonomamente como um ensaio de rastreio de citotoxicidade in vitro que permite que as células vivas de ser monitorada continuamente durante a sua vida. Este protocolo é flexível e pode ser modificado para acomodar condições experimentais específicas, conforme necessário. Por exemplo: a experiência aqui apresentada é apropriada para rastrear os efeitos tóxicos agudos, mas pode ser adaptado para avaliar efeitos de actuação lenta ou lon...

Em os EUA, farmacêuticos e outros produtos destinados ao consumo humano requer ampla avaliação antes de serem aprovadas para uso do consumidor pela Food and Drug Administration. Os encargos financeiros para executar este teste é colocada no revelador 1, o que aumenta substancialmente os custos de desenvolvimento de novos compostos e, portanto, se traduz num aumento de custos para os consumidores. Enquanto, tradicionalmente, grande parte desta seleção utilizou assuntos animais para atuar como proxies para hospedeiros humanos, este provou ser um grande ônus financeiro, com um valor estimado de 2,8 bilhões dólares gastos anualmente em ADME / Tox (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade ) triagem sozinho 2 e evidências sugerindo que os modelos animais não é possível prever com segurança respostas toxicológicos humanos 3. Por conseguinte, os testes in vitro de células humanas à base de cultura ganhou popularidade nos últimos dois décadas devido à sua relativamente baixade custos, maior produtividade e melhor representação de biodisponibilidade humana e toxicologia 4. Baseados em métodos de rastreio de cultura celular correntes toxicidade empregar vários parâmetros, tais como a medição de níveis de ATP, o rastreio da actividade de enzimas citoplasmáticos endogenamente disponíveis, sondando a integridade da membrana celular, ou o seguimento do nível de actividade mitocondrial, para avaliar a viabilidade celular 5 , 6. No entanto, independentemente da extremidade escolhido, estes métodos requerem a destruição da amostra antes da medição pode ser feita, portanto, apenas a produção de dados num único ponto de tempo. Como resultado, um grande número de amostras têm de ser preparados e tratados em paralelo para estudos toxicológicos básicos cinética, mais uma vez aumentando o custo e o trabalho necessários para o desenvolvimento de novos compostos. Em alternativa, os ensaios de luciferase utilizando secretada como Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8 e 9 Metridia luciferasetêm sido desenvolvidos, que eliminam a necessidade de lise celular e necessitam de uma fracção dos meios para a medição de ponto de extremidade, no entanto, estes ainda estão limitados a amostragem em pontos de tempo predeterminados e também requerer a adição de substratos exógenos de luz de activação. Para evitar o detrimento da destruição da amostra requerida, bem como para eliminar o custo de substratos, uma linha celular humana foi modificado que expressa a bioluminescência completo (lux), cassete do gene (luxCDABEfrp) para permitir a monitorização contínua de células vivas que é semelhante para imagens de células vivas com base fluorescente-dye, mas sem os procedimentos adicionais de investigação photon-ativadores e microscópica. Esta linha celular é capaz de constitutivamente produzindo um sinal óptico para a detecção contínua, directa, sem a necessidade de estimulação externa, evitando assim a destruição da amostra. Mecanisticamente, o sinal bioluminescente gerado a partir destas células resultars quando a enzima luciferase luxAB formada catalisa a oxidação de um aldeído gordos de cadeia longa (sintetizado e regenerado pelos produtos do gene luxCDE utilizando os substratos endógenos), na presença de riboflavina fosfato reduzido (FMNH 2, que é reciclada a partir de FMN pelo gene frp produto) e oxigénio molecular 10. A expressão da cassete de lux na célula hospedeira, por conseguinte, permite que a luz seja produzida e detectada sem destruição celular ou adição de substrato exógeno. Da mesma forma, a interação entre os genes lux ea FMN disponível endogenamente, e O dois co-substratos, bem como a exigência de manutenção de um ambiente capaz de suportar a conversão de FMN para FMNH 2, garante que o sinal bioluminescente resultante só pode ser detectada de viver as células activas metabolicamente. Estes requisitos foram anteriormente explorados para demonstrar que lux-bassaída bioluminescente ed correlaciona fortemente com o tamanho da população celular 11 e que a exposição composto tóxico prejudica a produção autobioluminescent de uma forma dose-resposta 12. Aqui usamos um autobioluminescent rim embrionário humano previamente caracterizadas (HEK293) 11 linha de células para demonstrar a triagem automatizada toxicológico de um antibiótico da família da bleomicina com ADN conhecida actividade prejudicial como um exemplo representativo, para validar a aplicação de células de mamífero autobioluminescent para os ensaios de toxicidade.

<table><tbody><tr><td>IVIS Lumina</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Outros modelos IVIS e leitores de placas baseados em PMT também podem ser usados</td></tr><tr><td>Living Imaging 2.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Atualizações mais recentes deste software estão disponíveis</td></tr><tr><td>Frascos tratados com cultura de células de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>placas tratadas com cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Costar</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Placa preta de 24 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662174 placas</td><td>de 96 ou 384 poços podem ser usadas para aplicações de maior rendimento</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Hyclone</td><td>SH30910</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Hyclone sem vermelho de fenol</td><td></td><td>SH30284</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH3091003</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sódio, 100mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Zeocina, 100 mg/ml</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05%</td><td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Células de mamíferos com base em ensaios in vitro têm sido amplamente empregados como alternativas aos testes em animais para estudos toxicológicos, mas foram limitados devido aos altos custos monetários e de tempo de preparação da amostra paralela que sejam necessárias devido à natureza destrutiva do vaga-lume métodos de rastreio baseados luciferase . Este vídeo descreve a utilização de células de mamífero de forma autónoma bioluminescentes, que não requerem a adição de um substrato destrutiva luciferina, tal como um método barato e fácil para a monitorização dos efeitos citotóxicos de um composto de interesse. As células de mamíferos que expressem estavelmente a bioluminescência completo (luxCDABEfrp) cassete do gene autonomamente produzirem um sinal óptico que um pico a 490 nm, sem a adição de um substrato luciferina caro e, possivelmente interferindo, a excitação por uma fonte de energia exterior ou a destruição da amostra que é tradicionalmente realizado durante o procedimento de imagiologia ópticas. Esta independência de estimulação externa coloca o fardo para manter a reacção bioluminescente unicamente sobre a célula, o que significa que o sinal resultante é detectado apenas activo durante o metabolismo. Esta característica faz com que a linha de células de lux que expressam um excelente candidato para o uso como um biosentinel contra os efeitos citotóxicos por causa mudanças na produção bioluminescente são indicativos de efeitos negativos sobre o crescimento e metabolismo celular. Do mesmo modo, a natureza autónoma e falta de destruição da amostra requerida permite imagiologia repetida da mesma amostra em tempo real ao longo do período de exposição tóxico e pode ser realizada através de várias amostras utilizando o equipamento existente de imagem de uma forma automatizada.

Neste estudo, a dinâmica de autobioluminescent as células HEK293 foram continuamente monitorizados ao longo de um período de 24 horas em resposta à exposição a antibióticos (Figura 1). Os efeitos tóxicos deste antibiótico, que é um membro da família de bleomicina conhecido por matar células vivas por ligação e clivagem de ADN 13, foram demonstradas por meio de um decréscimo na produção de bioluminescente em comparação com células não tratadas, o que pode ser visualizado directamente através d...

As células de mamífero que expressam a cassete de gene de bioluminescência (<em&gt; Lux</em&gt;) Produzem luz de forma autônoma. A dinâmica bioluminescentes resultantes após a exposição química têm sido demonstrados para reflectir os efeitos do tratamento sobre o crescimento e metabolismo celular, tornando essas células um, contínuo e em tempo real ferramenta de rastreio de toxicidade baixo custo que pode ser facilmente adaptado para a automatização de alto rendimento.

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar células humanas bioluminescentes de forma autônoma para monitoramento contínuo e em tempo real da citotoxicidade. Isso é realizado primeiramente obtendo um número suficiente de células bioluminescentes autônomas em crescimento ativo. Na segunda etapa, números iguais de células são semeados em poços individuais de uma placa de múltiplos poços.Em seguida, as células são tratadas com um composto de interesse em uma faixa de concentrações. Na etapa final, o sinal bioluminescente é medido utilizando um instrumento compatível. Em última análise, a dinâmica da emissão bioluminescente pode ser utilizada para demonstrar o efeito do composto em teste sobre a atividade metabólica das células.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como aqueles que utilizam luciferase isolada de insetos ou espécies submarinas, é que nenhuma destruição da amostra ou adição de substrato é necessária para gerar um sinal detectável. O procedimento será demonstrado por James Webb, um estudante de graduação de um laboratório. Após cultivar as células bioluminescentes de interesse até 80% de confluência no meio de cultura apropriado, lave a cultura celular com PBS com movimentos suaves de rotação, a seguir adicione tripsina e incube as células a 37 graus Celsius até que se desprendam do frasco. Em seguida, colete as células ressuspendidas em PBS, transfira-as para um tubo cônico limpo e determine o número de células após a contagem; centrifugue a suspensão celular por cinco minutos a 300 Gs em temperatura ambiente e ressus. Suspenda o pellet em meio pré-aquecido fresco e, em seguida, semeie números iguais de células em poços individuais de uma placa multi-poço opaca, adicionando um volume igual de meio sem células em um conjunto de poços triplicados como controle negativo. Deixe três poços de células sem tratamento como controles, enquanto adiciona o composto experimental de interesse diretamente às células nas concentrações experimentais apropriadas, em triplicata. Imediatamente após o tratamento experimental, coloque a placa na câmara de imagemamento do instrumento apropriado para aquisição de imagens e medição de bioluminescência.Em seguida, defina o tempo de integração apropriado para cada leitura e meça a bioluminescência a cada 15 minutos durante um período de 24 horas. Por fim, utilize o software compatível adequado para identificar uma região de interesse em cada poço. Para quantificar a intensidade bioluminescente de cada amostra experimental, exiba a emissão de luz em fótons por segundo para ilustrar o fluxo total ou em fótons por segundo por centímetro quadrado por Ceridian, para demonstrar a radiância média de cada amostra.Neste estudo, a dinâmica de células HEC 2 9 3 autoluminescentes foi monitorada continuamente durante um período de 24 horas em resposta à exposição a antibióticos. Os efeitos tóxicos desse antibiótico, que pertence à família Blio Micina, conhecida por matar células vivas ao se ligar e clivar o DNA, foram demonstrados por meio da redução na produção de bioluminescência em comparação com células não tratadas, o que pode ser diretamente visualizado por meio de imagens em pseudocores. Como mostrado aqui, a natureza bioluminescente das células HEC 2 9 3 permite a triagem paralela e repetida de amostras sob diferentes condições de tratamento, permitindo a comparação de diferentes concentrações experimentais em qualquer ponto temporal para uma análise de resposta à dose fácil.Por exemplo, neste gráfico, a bioluminescência produzida pelas células após 15, 18 ou 20 horas de tratamento foi representada em função das concentrações do composto experimental adicionado, demonstrando que o aumento do tratamento com antibiótico resulta na redução da produção de bioluminescência pelas células de maneira dependente da dose. A técnica apresentada neste vídeo é adequada para acompanhar efeitos tóxicos agudos, mas pode ser adaptada para avaliar toxicidade de ação lenta ou de longo prazo mediante a realização repetida de imagens das células em intervalos de tempo crescentes, mantendo o cultivo em condições padrão de incubação entre as leituras.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Luciferase modificados xenotransplantes tumorais humanos cerebral intracraniana pode ser estabelecida em camundongos atímicos, com posterior acompanhamento do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem de bioluminescência. Em combinação com a análise de sobrevivência, o monitoramento bioluminescência é uma ferramenta de pesquisa essencial para ensaios pré-clínicos de terapias sendo considerado para o tratamento de tumores cerebrais.

Estabelecer xenoenxertos tumor intracraniano Cérebro com posterior análise do crescimento tumoral e resposta à terapia com imagem Bioluminescência

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Este artigo descreve a administração...

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.

Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

Luciferase geneticamente codificado é um repórter popular não-invasivo da expressão do gene. Uso de um automatizado do longitudinal luciferase gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) de imagem permite gravação longitudinal das células bioluminescentes sob uma ampla gama de condições. Aqui nós mostramos como jacaré pode ser usado no contexto de pesquisa de ritmos circadianos.

Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e testes pré-clínicos de murino células CD19 carro T por transdução retroviral e utilização como uma terapia contra linfoma de célula B A20 syngeneic estabelecida em camundongos BALB/c com ou sem lymphodepleting pré-condicionamento.

Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Os ritmos circadianos, que existem na maioria dos organismos, regulam a organização temporal dos processos biológicos. Os organoides 3D surgiram recentemente como um modelo in vitro fisiologicamente relevante. Este protocolo descreve o uso de repórteres bioluminescentes para observar ritmos circadianos em organoides, possibilitando investigações in vitro de ritmos circadianos em sistemas multicelulares.

Monitoramento de oscilações circadianas com um repórter de bioluminescência em organoides

Aprenda a usar células humanas bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade. Este método permite avaliar a atividade metabólica celular sem destruir amostras, facilitando triagens de alta vazão em toxicologia.

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

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