Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

O objetivo geral deste procedimento é isolar gotículas lipídicas de tecido. Isso é realizado primeiramente dissecando e separando o tecido placentário. Em seguida, as células do oleína são homogeneizadas.

Em seguida, os organoides são separados por várias etapas de centrifugação. Por fim, a camada flutuante contendo as gotículas lipídicas é coletada e as gotas lipídicas são caracterizadas. Em última instância, a microscopia de fluorescência e a análise sanguínea por western blot são utilizadas para demonstrar a pureza da fração de gotículas lipídicas.

A principal vantagem desta técnica é que é possível isolar gotículas lipídicas da maioria das células aórticas. Observe que em certos tecidos, o número de gotículas pode ser inferior àquele que reduz a camada G flutuante e a quantidade de gotículas. As placentas foram coletadas de mulheres saudáveis com gestações únicas submetidas a parto cesáreo eletivo antes do início do trabalho de parto espontâneo, em gestantes a termo que deram consentimento informado por escrito para a coleta de suas placentas.

A coleta e o uso subsequente de placentas foram realizados com aprovação da Universidade do Tennessee e da Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade do Tennessee em Knoxville. No gabinete de segurança biológica, transfira a placenta para um recipiente estéril autesterilizável e lave cuidadosamente o sangue da placenta e das membranas utilizando soro fisiológico estéril. Descarte o soro fisiológico sanguinolento em um béquer de um litro como resíduo biológico líquido.

Coloque a placenta sobre um campo estéril com a superfície lisa, que contém o cordão umbilical, voltada para cima, utilizando tesoura de ponta fina e pinça. Remova o cordão umbilical e as membranas fetais. Em seguida, vire a placenta de modo que a superfície materna fique voltada para cima.

Em seguida, remova o tecido da placa basal subjacente a cerca de três milímetros da superfície. Disseque um COTA de cada vez, evitando a placa coriônica, e colete o tecido viloso em um béquer de 250 mililitros com solução salina. Depois, utilize solução salina estéril a 0,9% e uma pinça para lavar o tecido várias vezes em um béquer separado, agitando-o, utilizando o béquer de um litro para o descarte do líquido.

Transfira uma ponta de codênea de cada vez para uma placa de Petri de 150 milímetros. Segure com pinça e use uma lâmina de barbear para raspar o tecido dos vasos para dentro da placa de Petri. Coloque o tecido raspado em um béquer separado contendo solução salina estéril a 0,9%.

Repita para todos os fragmentos de tecido. Após lavar o tecido raspado na solução de dissociação celular, remova o excesso de líquido e pese para digerir o tecido placentário. Após preparar a mistura de digestão do tecido, divida o tecido transferindo 60 gramas do tecido coletado total para um frasco estéril de Helen Meyer de 500 mililitros.

Adicione a mistura de digestão do tecido ao frasco contendo o tecido e incube a 37 graus Celsius em um agitador durante 45 minutos. A 150 RPM, colete as células dissociadas após a incubação, inclinando o frasco para permitir que o tecido se sedimente. Colete o sobrenadante.

Tendo o cuidado de não coletar tecido UND dissociado. Adicione uma quantidade igual de HBSS ao sobrenadante antes de transferir para tubos cônicos estéreis de 15 mililitros. Repita a dissociação e a coleta do sobrenadante com as porções restantes do tecido associado a UND para cada lote, seguindo centrifugação a 1000 vezes.

Centrifugar por 15 minutos a quatro graus Celsius e aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet. As células dos vilos placentários estão predominantemente na porção branca do pellet, sobreposta aos glóbulos vermelhos. Transferir as células dos vilos presentes na porção branca do pellet para um tubo cônico estéril de 50 mililitros e manter no gelo.

Após coletar as células das três etapas de digestão, utilize um filtro celular de náilon de 100 micrômetros inserido na parte superior de um tubo cônico estéril de centrífuga de 50 mililitros para filtrar a suspensão. Se a filtração da suspensão celular desacelerar, levante levemente o filtro para criar vácuo dentro do tubo e, em seguida, centrifugue a 4 graus Celsius e 1000 vezes a gravidade durante 10 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet para homogeneizar as células dos vilos placentários utilizando meio de lise hipotônico recém-preparado, ou HLM, em uma cabine de segurança biológica; adicione quatro vezes o volume do pellet celular de HLM gelado às células.

Utilize uma pipeta de 10 mililitros para ressuspender suavemente e completamente. Suspenda as células pipetando para cima e para baixo. Após incubar as células em gelo por 10 minutos, transfira-as para um homogenizador gelado e homogeneíze lentamente as células com o pistilo de encaixe solto, aplicando de 20 a 25 movimentos suaves.

Centrifugue o lisado a 3000 ×g e quatro graus Celsius por 10 minutos para remover as células não rompidas. Em seguida, colete o sobrenadante em um novo tubo antes de centrifugar novamente a 25.000 ×g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Para remover as mitocôndrias e isolar as gotículas lipídicas por ultracentrifugação, colete o sobrenadante em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Ajuste para 20% de sacarose e transfira para o fundo de um tubo de ultracentrifugação para rotor S SW 28 ou equivalente; sobreponha o sobrenadante ajustado em densidade com cerca de 10 mililitros de tampão de carbonato de sódio gelado, 100 milimolar, e 0,5 a 1 mililitro de HLM gelado para preencher o tubo, utilizando uma centrífuga com rotor de balde oscilante S SW 28 a 130.000 × g e 4 °C por 45 minutos. Em seguida, colete a camada flutuante, ajuste para 10% de sacarose e transfira para o fundo de um tubo de ultracentrifugação de 13,2 mililitros para rotor SW 41 TI ou equivalente; sobreponha o sobrenadante ajustado em densidade com cerca de cinco mililitros de tampão de carbonato de sódio gelado, 100 milimolar, e 0,5 mililitros de HLM gelado, seguido de centrifugação a 274.000 × g e 4 °C por 60 minutos. Em um rotor SW 41 TI, utilize uma pipeta de um mililitro para coletar cuidadosamente a camada flutuante superior contendo gotículas lipídicas.

Ajuste o volume para 10% de sacarose e transfira novamente para um tubo de ultracentrifugação de 13,2 mililitros antes de sobrepor com cinco mililitros de tampão de carbonato de sódio gelado a 100 milimolares e 0,5 mililitros de HLM gelado. Após a centrifugação por 30 minutos, use uma pipeta de PE curvada para coletar cuidadosamente a camada superior flutuante de cor branca, contendo as gotículas lipídicas, em três tubos de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de HLM. Caracterize as gotículas lipídicas de acordo com o protocolo descrito no texto, conforme mostrado nesta figura; a presença de gotículas lipídicas isoladas de células vilosas placentárias humanas a termo foi verificada por coloração com o corante fluorescente específico para lipídios neutros BODIPY 493/503 e visualizada por microscopia de fluorescência.

Mostrado aqui, a pureza das frações de gotículas lipídicas isoladas foi avaliada por meio de western blotting com proteínas marcadoras para gotículas lipídicas, incluindo para lippin, duas calnexina para o retículo endoplasmático, o marcador GOI, GM1 30 COX4 para mitocôndrias e membrana plasmática e MEK1. Após a precipitação, as gotículas lipídicas foram tratadas com acetona fria e as proteínas extraídas. As frações foram submetidas a western blotting para lippin.

Dois, a proteína de gotículas lipídicas foi detectada no sobrenadante pós-nuclear e na camada branca flutuante isolada contendo gotículas lipídicas. Proteínas específicas para membranas plasmáticas, como MK um e GM um 30, não foram detectadas nas frações de gotículas lipídicas em nenhuma das camadas abaixo da camada flutuante para a rotação quatro e rotação cinco. Conforme relatado anteriormente, a proteína calnexina e uma marcação fraca da proteína da membrana mitocondrial CO X quatro foram detectadas em outras partes da fração de gotículas lipídicas.

Esses resultados são consistentes com relatos anteriores que mostram que gotículas lipídicas interagem com mitocôndrias em células de mamíferos e com o RE. Após este procedimento, outros métodos, como abordagens proteômicas e lipidômicas, podem ser realizados para investigar questões adicionais, como quais fatores estão ligados às gotículas.