Name: Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a isolar gotículas lipídicas celulares de leveduras e placentas humanas por centrifugação em gradiente de densidade. Este método permite visualizar, extrair e quantificar a pureza das gotículas por Western Blot.

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Este trabalho foi apoiado pelo prêmio American Heart Association 13SDG14500046 para PD, uma Educação Energia Sustentável &amp; Centro de Pesquisa Award (Univ. of Tennessee) para PD, e de Educação Médica dos Médicos e Fundação de Pesquisa (Univ. of Tennessee) prêmio para JM A autores agradecem Caroline Leplante (Yale Univ.) para o protocolo para a conversão de levedura para esferoplastos; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) para o uso de suas incubadoras agitação, mesa centrífuga e Western Blot equipamentos de análise, e do Centro de Biotecnologia Ambiental (Univ. Tennessee) para o uso de seu ultra-centrífuga; Günther Daum para anticorpos levedura (Graz Univ of Technology, na Áustria.); o pessoal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia (Univ. Tennessee Medical Center) para assistência técnica .

1. Isolando lipídicas gotas de (cisão) Células de levedura Isolamento de gotículas do organismo modelo popular brotamento Saccharomyces cerevisiae é quase idêntico ao seguinte protocolo 6. As diferenças nas preparações são anotados. 1. Crescer células de levedura <ol><li> Prepare a mídia. Combine 36 g de YE5S pó por litro de dH 2 O em garrafas de vidro ou frascos de cultura. Serão necessários cerca de 2 L de mídia. Autoclave a mídia a 121 ° C por 20 min. Permita que os meios de comunicação para arrefecer à temperatura ambiente. Para S. cerevisiae substituir YE5S com YPD. </li><li> Coloque 10-20 ml dos meios de comunicação YE5S resfriado em uma garrafa de cultura de 250 ml, utilizando técnicas estéreis. Inocular os meios de comunicação com uma pequena quantidade de células de levedura de uma placa de ágar utilizando uma vara de madeira estéril ou equivalente. Deixe as células crescer até à densidade óptica pretendida, a 30 ° C. Medir a densidade óptica a umcomprimento de onda de 595 nm utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Coloque a mídia restante nos frascos de 2,8 L. Usar não mais do que 1 L de balão por meios de 2,8 L para assegurar uma mistura adequada durante o crescimento celular na incubadora de agitação. O rendimento final de células molhadas deve ser cerca de 10 g para ser capaz de adquirir gotículas lipídicas suficientes para análise proteômica e lipidomas. </li><li> Introduzir nas células do passo 1.2 em balões 2,8 L, tendo cada um 1 L de meios que foram preparados no passo 1.1. </li><li> Crescer as células com a densidade desejada, a 30 ° C. </li><li> Certifique-se que as células têm gotículas lipídicas. Reserva 1 ml das células. Medir a densidade óptica (OD) da amostra. Adicionar 0,1 ml de um estoque de 100 mM de BODIPY 493/503, em etanol por OD de células na amostra. Colocar 3 mL da amostra entre uma lâmina de vidro e uma lamela de vidro. Visualizar sob um microscópio fluorescente com um filtro de GFP (Figura 1A). </li><li> Sedimentar as células do passo 1.5 a 4 &amp; #176; C a 3.800 g durante 10 min. Trabalhar em lotes de acordo com a capacidade dos tubos de centrífuga. </li><li> Deitar fora a mídia YE5S e lavar as células com um tampão de EMM + 600 mM sorbitol. Sorbitol fornece suporte osmótico. </li><li> Transferência das células para um tubo de centrífuga de 50 ml estéril e sedimentar as células a 4 ° C a 2.000 g durante 10 min. Remover o sobrenadante. Pesar as células húmidas. Ressuspender as células em 2 ml de EMM (+ sorbitol 600 mM) de tampão por grama de células. </li></ol> 2. A conversão de células de levedura de fissão em esferoplastos e subsequente lise <ol><li> Adicionam-se 5 mg cada um de 1) enzima lítica de levedura e 2) de levedura de lise enzimas do fungo Trichoderma harzianum por grama de células húmidas, que foram pesadas no passo 1.9. Para S. cerevisiae aumentar estas enzimas com a mesma quantidade de Zymolyase. </li><li> Incubar as células a 30 ° C, sob agitação suave a 100 rpm durante 60 min. </li><li> Certifique-se de que os esferoplastos têm dr lipídicooplets. Ao repetir o passo 1.6 (Figura 1B). </li></ol> 3. Densidade centrifugação em gradiente <ol><li> Agregar as esferoplastos por centrifugação a 4 ° C a 2.000 g durante 5 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Suavemente ressuspender os esferoplastos peletizadas com gelo frio de 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol, e 200 ^ M de EDTA. Tenha em mente que os esferoplastos são muito frágeis. </li><li> Agregar as esferoplastos novamente usando as mesmas configurações como no passo 3.1. Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as esferoplastos utilizando uma pipeta de transferência de plástico em 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, e 200 ^ M de EDTA a uma concentração de 2 ml / g de células. </li><li> Transferir os esferoplastos em suspensão para um homogeneizador de vidro e homogeneizar em gelo, 20-30 pancadas, com o pilão solto do homogeneizador de vidro. </li><li> Transfira os esferoplastos lisadas para tubos de centrífuga e sobreposição com o mesmo volume de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão e 200 fiM de EDTA. Escolha o número de tubos de centrífuga de usar para que cada tubo é de cerca de dois terços cheio. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 100,000 xg durante 1,5 horas num rotor SW28 ou equivalente. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0). </li><li> Suavemente transferir a camada sobrenadante branco (Figura 2A), que contém as gotas, para um novo tubo (s) de centrifugação usando uma pipeta ou uma pipeta Pasteur curvada. Adicionar um volume suficiente de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão de EDTA e 200 ^ M para a amostra de modo que ele preenche mais ou menos um terço do tubo de centrifugação. </li><li> Adicionar o volume equivalente de 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão de EDTA e 200 ^ M para o topo da amostra (s) no novo tubo (s) de centrifugação. Após a adição desta amortecer os tubos devem ser de cerca de dois terços do volume. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 100,000 xg durante 1 hora num rotor SW28 ou equivalente. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0). </li><li> Suavemente transferir a camada de topo branco flutuante (Figura 2B), que irá conter as gotículas, para um novo tubo (s) de centrifugação usando uma pipeta ou uma pipeta Pasteur curvada. Adicionar 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão de EDTA e 200 ^ M para a amostra de modo a que ocupe cerca de um terço do tubo de centrifugação. </li><li> Adicionar o volume equivalente a 250 mM de sorbitol, 10 mM Tris-HCl, e tampão EDTA 200 uM para o topo da amostra (s) no novo tubo (s) de centrifugação. Após a adição desta amortecer os tubos devem ser de cerca de dois terços do volume. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 100,000 xg durante 1 hora num rotor SW28 ou equivalente. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0). </li><li> Transferir parte superior da camada branca (Figura 2C), que deve conter apenas as gotículas de lípidos e proteínas ligadas, a tubagem de diálise, e diálise O / N em 10 mM Tris-HCl e 200 ^ M de tampão de EDTA para eliminar o Ficoll. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Isolando lipídicas Gotas de placenta humana vilosidades Células Placentas foram coletadas de mulheres saudáveis ​​com gestações únicas submetidos de forma eletiva entrega cesariana antes do início do trabalho de parto espontâneo no prazo. Assuntos deu o consentimento escrito e informado para a coleção de sua placenta. A coleção, e posterior utilização, de placentas foi realizada com a aprovação da Universidade do Tennessee e Universidade do Tennessee Graduate School of Medicine, em Knoxville Institutional Review Board (# 8757B e # 3338, respectivamente). 1. Isolamento de células das vilosidades da placenta humana Parte 1 do protocolo é uma modificação de um protocolo publicado anteriormente por 26 Petroff et al. Prepare as seguintes soluções: <ul><li> De NaCl (1 L): Dissolver 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) em dH 2 O, para se obter uma solução de 1 litro. Filtro de esterilizar (0,2; MM membrana). </li><li> Solução salina equilibrada de 10x Hank (10x HBSS) (1 L): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); de 0,6 g de KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g de D-glucose (M 180,16 g / mol). Dissolve-se cada um dos componentes em dH 2 O, para se obter uma solução de 1 litro. Filtro de esterilizar (0,2 membrana mm). </li><li> Tampão de digestão de enzima (0,6 ml): combinar 70 ml 10x HBSS com 3,3 ml de 7,5% de Na Biscarbonate, 17,5 mL de HEPES 1 M, e 266,1 ml de dH2O; filtro de esterilizar (membrana de 0,2 um). Armazenar a 4 ° C. </li><li> DNase I: imediatamente antes da utilização, adicionar 5 ml estéril 0,9% de NaCl para um frasco de DNase. Mantenha no gelo até o uso ou armazenar a -20 ° C. </li></ul><ol><li> Preparando placenta para dissecção <ol><li> Obter uma placenta humana e processo tão perto do tempo de entrega possível. Usar um recipiente selado, tal como um refrigerador para transportar a placenta. Tenha cuidado ao ladoling materiais biológicos humanos. </li><li> Na capa de segurança biológica, transferir a placenta para um recipiente estéril autoclave, e lavar cuidadosamente o sangue a partir de placenta e de membranas utilizando solução estéril a 0,9% de NaCl (salina). Descarte sangrenta salina no 1 L proveta como lixo biológico líquido. </li><li> Coloque a placenta em um campo estéril, com a superfície lisa, tendo o cordão umbilical voltada para cima. Com nítidas, tesoura de ponta fina e pinças remover membranas fetais e do cordão umbilical. </li><li> Vire a placenta de forma que a superfície materna (superfície áspera) é voltado para cima. Remover o tecido sobreposta placa basal, cerca de 3 mm a partir da superfície. </li></ol></li><li> Dissecando a placenta <ol><li> Dissecar um cotilédone de cada vez evitando a placa coriônica. Colete tecido das vilosidades em um copo de 250 ml com solução salina. </li><li> Lavar tecido várias vezes em um copo separado com 0,9% de NaCl por agitação com uma pinça, utilizando o copo de 1 L para resíduos líquidos. </li><li> Transferir um cotilédone de cada vez para uma placa de Petri 150 milímetros. Segure com uma pinça e raspar tecido com lâmina de barbear de navios na placa de Petri. Colocar o tecido raspado num copo separado, contendo 0,9% de NaCl. Repita o procedimento para todas as peças de tecido. </li><li> Transferir pequena porção do tecido da peneira de dissociação de células e enxaguar com 0,9% de NaCl extensivamente até o eluato torna-se clara. Repetir para todo o tecido. </li><li> Depois de enxaguar o tecido raspado do crivo de dissociação celular, drenar o excesso líquido e peso. Neste ponto, o tecido pode ser armazenado S / N, num balão de Erlenmeyer estéril a 4 ° C em DMEM. </li></ol></li><li> A digestão enzimática do tecido placentário <ol><li> Preparar a mistura de digestão do tecido: 100 ml de tampão de diluição de enzima pré-aquecido, 1 ml de DNase I e 20 ml de 2,5% de tripsina 10x. </li><li> Dividir o tecido, a transferência de 60 g a partir de tecido recolhido total (geralmente cerca de 250-300 g) para um balão de Erlenmeyer esterilizado de 500 ml. </li><li&gt; Adicionar a mistura de digestão de tecido para o balão de Erlenmeyer contendo o tecido, e incubar a 37 ° C num agitador durante 45 minutos a 150 rpm. </li></ol></li><li> Coletar as células dissociadas <ol><li> Após os primeiros 45 min de dissociação, defina o recipiente de digestão em uma inclinação até que o tecido se instala. </li><li> Recolher o sobrenadante, tomando cuidado para não coletar tecido não dissociada. Adicionar uma quantidade igual de HBSS para o sobrenadante foi recolhido e transferir para tubos estéreis de 15 ml de centrífuga. Para porções adicionais de tecido não dissociado, repetir procedimento a partir do passo 3.2 com o tecido não dissociado. </li><li> Centrifuga-se o homogeneizado a 4 ° C a 1.000 g durante 15 min. </li><li> Para cada lote, após a centrifugação, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. As células das vilosidades da placenta são predominantemente na parte branca da pelota, sobrepondo-se as células vermelhas do sangue. </li><li> Transferência das células das vilosidades (parte branca da pelota) para a sterile 50 ml tubo de centrifugação cónico e manter em gelo. </li><li> Depois de recolher as células a partir de todas as três fases de digestão, filtrar a suspensão através de um filtro de 100 mm de células de nylon inserida no topo de um tubo de centrífuga de 50 ml estéril cónica. Se a filtração da suspensão de células diminui, levante sobre o filtro para extrair um vácuo no interior do tubo. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 1.000 g durante 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. </li></ol></li></ol> 2. Homogeneização de células das vilosidades da placenta <ol><li> Antes de iniciar o processo de isolamento, preparar 50 ml de lise hipotónico Médio (HLM) contendo 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e EDTA 1 mM. Adicionar os inibidores da protease de HLM imediatamente antes da utilização e manter o meio em gelo. </li><li> Na capa de segurança biológica, adicionar 4 vezes o volume do pelete celular HLM gelada para as células. Forma suave e profunda voltar a suspender as células por pipetagem as células-se-and-baixo com uma pipeta de 10 ml. </li><li> Incubar as células em suspensão em gelo durante 10 min. </li><li> Transferência das células para o homogeneizador de Dounce, a qual deve estar em gelo. Lentamente homogeneizar as células através da aplicação de 20-25 movimentos suaves com o pilão folgada do homogeneizador. </li><li> Centrifugar o lisado celular a 4 ° C a 3000 xg durante 10 min para remover as células não rompidas, núcleos e restos celulares. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo SW28 (ou uma alternativa que pode ser centrifugado a 25.000 x g). Centrifugar a 4 ° C a 25000 x g durante 20 min para remover as mitocôndrias. </li></ol> 3. Isolando gotículas lipídicas por ultracentrifugação <ol><li> Preparar 50 ml de carbonato de sódio 100 mM (M 106 g / mol) de tampão (pH 11,5) e 50 ml de solução a 60% (w / w) de sacarose. Adicionar os inibidores de protease para o tampão de carbonato de sódio imediatamente antes da utilização e manter em gelo. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante a partir do passo 2.6 para um tubo de centrífuga de 50 ml, ajustara 20% de sacarose e de transferência para a parte inferior de um tubo de ultracentrífuga para o rotor SW28, ou equivalente. Sobrenadante densidade sobreposição ajustado com ~ 10 ml de tampão de carbonato de sódio 100 mM gelado (pH 11,5) e 0,5-1 ml de gelado HLM para encher o tubo. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 130,000 g durante 45 min, utilizando rotor basculante SW28. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0). </li><li> Recolher a camada flutuante, ajustar para 10% de sacarose e transferir para a parte inferior de um tubo de ultracentrífuga 13,2 ml para um rotor SW41Ti, ou equivalente. Sobreposição densidade ajustada sobrenadante com cerca de 5 ml de tampão de carbonato de sódio 100 mM gelado (pH 11,5) e 0,5 mL de HLM gelada. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 274,000 g durante 60 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0) para minimizar a interrupção da camada de gotículas de lipídios. </li><li> Recolher cuidadosamente a camada superior flutuante (Figura 2D), contendogotículas lipídicas com uma pipeta de 1 ml e repita o passo 3.4. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 274,000 g durante 30 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0). </li><li> Recolher cuidadosamente a camada flutuante de cor branca top contendo gotículas lipídicas com uma pipeta Pasteur dobrada em três tubos de 1,5 ml contendo 100 mL HLM. </li></ol> Fração gotículas lipídicas Caracterização (Protocolos 1 e 2) A recuperação e a pureza da fracção de gotículas de gordura pode ser verificada por Western Blot combinada com luz ou microscopia electrónica. Além disso, as alíquotas após diferentes passos de centrifugação pode ser recolhida e retida para determinar a eficiência de purificação. Em Western Blotting, é mais apropriado comparar o volume da fração de gotículas de gordura que representa o equivalente a todo o lisado celular de comparar gotículas lipídicas para outras frações de membrana em tEle função do teor de proteína total de 24.

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

<html> As etapas críticas dentro deste protocolo Certifique-se para ser consistente com os meios e as densidades celulares durante o crescimento das células em cultura. Gotículas lipídicas celulares são únicos na medida em que as suas proteínas associadas são altamente dependentes do ambiente no qual as células são cultivadas 17. Portanto, os meios de comunicação em que as células são cultivadas e da densidade das células devem ser cuidadosamente m...

Gotículas lipídicas celulares são organelas dinâmicas que servem múltiplas funções nas células. Eles são centros de armazenamento de lípidos neutros, que podem ser convertidas em energia ou utilizadas para a síntese de fosfolípidos. As gotículas de desempenhar um papel central em condições fisiológicas e patológicas, incluindo a aterosclerose, obesidade e doenças metabólicas relacionadas, e também as doenças infecciosas 1,2. Além disso, eles são fontes interessantes para combustíveis de biodiesel. Muita informação sobre os papéis celulares de gotículas lipídicas foi obtida a partir de análise proteômica e lipidomas de gotículas purificados a partir de organismos de grande alcance 3. Estes organismos incluem as bactérias, levedura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematóides 14, e voa 15,16. Dado o interesse no papel de gotículas lipídicas em doenças metabólicas humanos, as gotas foram também isolados a partir de células animais em cultura e umtecidos nimal. Linhas de células cultivadas têm incluído 3T3-L1 adipócitos 17, de ovário de hamster chinês (CHO), células K2 18, 19,20 hepatocyes humanos, e linhas de células epiteliais 21. Tecidos animais a partir do qual as gotas foram isolados incluíram rato músculo esquelético 22, fígado 23, e glândulas mamárias 23. Como mencionado acima, o objetivo da maioria dos estudos de isolamento gota é realizar análise proteômica sobre os fatores ligados e lipidomas no neutro e fosfolipídios. Desde lipídios neutros - os mais numerosos componentes de gotículas lipídicas - são menos densos do que a maioria dos outros materiais celulares, o isolamento de gotículas tem sido tradicionalmente realizada usando gradiente de densidade centrifugação. Essa técnica é a peça central de ambas as preparações apresentadas aqui. As técnicas anteriores são combinados e 6,24 modificado para uma apresentação visual do isolamento de gotículas a partir de células de levedura de fissão cultivadase células humanas noncultured obtido a partir de tecido placentário. O objectivo é o de mostrar a ampla aplicabilidade desta técnica, escolhendo dois tipos de células muito diferentes de pontos para o isolamento a partir das gotículas. Esta técnica deve ser útil para aqueles que desejam isolar gotas da maioria dos organismos. Protocolo 1 descreve o isolamento de gotículas lipídicas a partir da levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe, a qual tem sido utilizada como um modelo para observar a formação de gotículas durante a divisão celular eucariótica 25. A levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento tem sido amplamente utilizado como organismo-modelo para estudar a biologia das gotículas de lípidos. Protocolo n ° 1 é aplicável a ambos os organismos e as diferenças nos preparativos são realçados. Protocolo 2 descreve o isolamento de gotículas lipídicas de células das vilosidades da placenta, que são, por sua vez obtida a partir de placenta humana prazo. Ocoleção de placentas prazo proporciona uma oportunidade única de forma segura e eticamente obter 200-250 g de tecido humano prontamente disponível 26, que contém um número significativo de gotículas lipídicas. Isto está em contraste com a maior parte do trabalho de isolamento de gotículas de gordura em eucariotas superiores, onde as gotículas são originários a partir de células cultivadas. Nestes estudos, os ácidos gordos são, muitas vezes adicionado à cultura para promover a síntese de lípidos neutros e, assim, o crescimento de gotículas. Isto está em contraste com o trabalho aqui onde gotículas lipídicas são formadas sob condições nativas no tecido placentário. As purezas das fracções de gotículas de lípido são determinados por análise de Western Blot, utilizando anticorpos de marcadores de organelos. Estes dois protocolos irá produzir fracções de gotículas lipídicas que são adequados para análise proteómica e lipidomas subsequente.

<table><tbody><tr><td>Protocolo 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. Crescimento de células de levedura e conversão em esferoplastos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh Minimal Media (EMM)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura com 5 suplementos (YE5S)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>YE5S media com 225 mg/ml de cada suplemento: adeninie, histidina, leucina, lisina, uracila. O equivalente para levedura em brotamento seria YPD.</td></tr><tr><td>YPD em pó</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>Para S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Lítica de Levedura</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de Lise de Trichoderma harzianum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>Para S. cerevisiae</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura de Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de vidro de 1 LBalão</td><td></td><td></td><td></td>de 250 ml</tr><tr><td>,</td><td></td><td></td><td></td> balões de 2,8 l</tr><tr><td>< resistentes>2. Isolamento de gotículas lipídicas de levedura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por Membrana de Diálise</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de Coquetel Inibidores de Protease sem EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce&nbsp;</td>Tubos de Ultracentrífuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 89 mm (para SW28)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Membrana de Diálise Spectra/Por</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Agitador controlado por temperatura</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR centrífuga</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de Centrífuga de Balde</td><td>Oscilante Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100y Rotor de Ângulo Fixo</td> Ultracentrífuga <td>75003698</td><td></td><td>Thermo-Scientific</td></tr><tr><td>LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Rotor de Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>1. Isolamento de células vilosas placentárias</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofadas descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>Panela autoclavável (recipiente), 3 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras finas, afiadas, retas</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>London Forceps</td><td>Fine Science</td><td>Tools 1108002</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de #7b Dumont</td><td>Ferramentas</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Barbear</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>Copo de tela para CD-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 mesh screen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand corantes de células 100 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsina 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I grau II, de pâncreas bovino</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td> <td>de bicarbonato de sódioSigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr>Balões <td></td><td></td><td></td><td>Erlenmeyer de 500 ml Copos</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de 250 ml Tubos</td></tr> de <tr><td>centrífuga de 15 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td>de centrífuga</tr><tr><td>de 10 ml Pipetas</td><td></td><td></td><td></td>serológicas</tr><tr><td>de 50 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td>de centrífuga</tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td><forte>2. Isolamento de gotículas lipídicas de células placentárias vilosas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de Sódio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel inibidores de protease sem EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce&nbsp;</td>Tubos de ultracentrífuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 89 mm (para SW28)</td>Tubos de centrífuga <td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14 mm x 89 mm (para SW41)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Vidro borossilicato descartável Pipetas</td><td>Pasteur Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de segurança biológica&nbsp;</td><td>Termo-Scientific Banho-maria</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador com temperatura controlada</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend XTR centrífuga</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de Centrífuga de Balde Oscilante</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga LB-M</td> Rotor de Ultracentrífuga <td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Rotor de Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor de Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 Cabra Anti-Coelho IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>diluição 1:15.000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Cabra IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris géis</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários para Protocolo 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>presente do Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Áustria</td><td>diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>presente do Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Áustria</td><td>diluição 1:5.000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>presente do Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Áustria</td><td>diluição 1:10.000</td></tr><tr><td>Vma1p (anti-ATP6V1A)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0,5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Anticorpos primários para o Protocolo 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 2 (anti-ADFP)</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>diluição 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>diluição 1:50</td></tr></tbody></table>

isolamento de celulares lipídicas gotas: duas técnicas de purificação começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Gotículas lipídicas são organelas dinâmicas que podem ser encontrados na maioria das células procariotas e eucariotas certos. Estruturalmente, as gotículas constituídas por um núcleo de lípidos neutros rodeadas por uma monocamada de fosfolipido. Uma das técnicas mais úteis na determinação dos papéis celulares de gotículas foi identificação proteoma de proteínas ligadas, que podem ser isolados, juntamente com as gotas. Aqui, dois métodos são descritos para isolar gotículas lipídicas e suas proteínas ligadas a partir de duas amplas eucariontes: levedura de fissão e as células das vilosidades da placenta humana. Apesar de ambas as técnicas têm diferenças, o método main - gradiente de densidade centrifugação - é compartilhado por ambas as preparações. Isto demonstra a ampla aplicabilidade das técnicas de isolamento de gotículas apresentados. No primeiro protocolo, as células de levedura são convertidas em esferoplastos por digestão enzimática das paredes celulares. Os esferoplastos resultantes são então gently lisadas em um homogeneizador folgadas. Ficoll é adicionado ao lisado para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada três vezes. Depois da primeira rotação, as gotículas lipídicas são localizadas na camada flutuante de cor branca dos tubos de centrífuga, juntamente com o retículo endoplasmático (ER), a membrana de plasma, e vacúolos. Dois rotações subsequentes são utilizados para remover estes três organelos. O resultado é uma camada que tem apenas gotículas e as proteínas ligadas. No segundo protocolo, as células das vilosidades da placenta são isolados a partir de placenta humana prazo por digestão enzimática com tripsina e DNase I. As células são homogeneizadas num homogeneizador folgada. De baixa velocidade de centrifugação e de velocidade média passos são usadas para remover as células não quebradas, os detritos celulares, os núcleos, e as mitocôndrias. É adicionada sacarose ao homogenato para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada para separar as gotículas lipídicas a partir do outro cellulafracções r. A pureza das gotículas lipídicas em ambos os protocolos, é confirmada por análise Western Blot. As frações de gotículas de ambas as preparações são adequados para a análise proteômica e lipidomas subseqüente.

Se a centrifugação em gradiente de densidade funcionou como esperado, a camada flutuante deve conter gotículas lipídicas e ser desprovido de outros organelos toda a progressão dos spins de alta velocidade. Para Protocolo 1, Western Blot foram realizadas com anticorpos para marcadores gotículas lipídicas (Erg6p) e organelas que foram encontrados para interagir com gotículas lipídicas em levedura, ER (Dpm1p), mitocôndria (Por1p), membrana plasmática (Pma1p), e vacúolos (Vma1p). <p class="j...

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar gotículas lipídicas de tecido. Isso é realizado primeiramente dissecando e separando o tecido placentário. Em seguida, as células do oleína são homogeneizadas.Em seguida, os organoides são separados por várias etapas de centrifugação. Por fim, a camada flutuante contendo as gotículas lipídicas é coletada e as gotas lipídicas são caracterizadas. Em última instância, a microscopia de fluorescência e a análise sanguínea por western blot são utilizadas para demonstrar a pureza da fração de gotículas lipídicas.A principal vantagem desta técnica é que é possível isolar gotículas lipídicas da maioria das células aórticas. Observe que em certos tecidos, o número de gotículas pode ser inferior àquele que reduz a camada G flutuante e a quantidade de gotículas. As placentas foram coletadas de mulheres saudáveis com gestações únicas submetidas a parto cesáreo eletivo antes do início do trabalho de parto espontâneo, em gestantes a termo que deram consentimento informado por escrito para a coleta de suas placentas.A coleta e o uso subsequente de placentas foram realizados com aprovação da Universidade do Tennessee e da Escola de Pós-Graduação em Medic

isolation-cellular-lipid-droplets-two-purification-techniques

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Este vídeo demonstra o isolamento lipídico de neutrófilos humanos por um sistema de solvente bifásico usando metanol e clorofórmio.

Isolamento de lipídios de neutrófilos derivados do sangue humano por separação bifásica

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ácido acético de 14C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.

Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Aprenda a isolar gotículas lipídicas celulares de leveduras e placentas humanas por centrifugação em gradiente de densidade. Este método permite visualizar, extrair e quantificar a pureza das gotículas por Western Blot.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

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