Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

O objetivo geral deste procedimento é isolar gotículas lipídicas do tecido. Isso é feito primeiro dissecando e separando o tecido placentário. Em seguida, as células da oleína são homogeneizadas.

Em seguida, as organelas são separadas por várias etapas de centrifugação. Finalmente, a camada flutuante contendo as gotículas lipídicas é coletada e as gotas lipídicas são caracterizadas. Em última análise, a microscopia de fluorescência e a análise de sangue ocidental são usadas para mostrar a pureza da fração de gotículas lipídicas.

A principal vantagem dessa técnica é que é possível isolar gotículas lipídicas da maioria das células da aorta. Observe que, em certos tecidos, o número de gotículas pode ser inferior àquelas que reduzem a camada G flutuante e o número de gotículas. As placentas foram coletadas de mulheres saudáveis com gestações únicas submetidas a cesariana eletiva antes do início do trabalho de parto espontâneo a termo, as mulheres que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a coleta de sua placenta.

A coleta e o uso subsequente de placentas foram realizados com a aprovação da Universidade do Tennessee e da Escola de Pós-Graduação em Medicina da Universidade do Tennessee em Knoxville. Conselho de revisão institucional na capa de segurança biológica, transfira a placenta para um recipiente autoclavável estéril e lave cuidadosamente o sangue da placenta e das membranas usando solução salina estéril. Descarte a solução salina sangrenta em um copo de um litro como resíduo biológico líquido.

Coloque a placenta em um campo estéril com esta superfície lisa com o cordão umbilical voltado para cima com uma tesoura e uma pinça afiadas e de ponta fina. Remova o cordão umbilical e as membranas fetais. Em seguida, vire a placenta para que a superfície materna fique voltada para cima.

Em seguida, remova o tecido da placa basal sobrejacente a cerca de três milímetros da superfície. Disseque uma COTA de chumbo de cada vez, evitando a placa coriônica, e colete o tecido viloso em um béquer de 250 mililitros com solução salina. Em seguida, use solução salina estéril a 0,9% e fórceps para enxaguar o tecido várias vezes em um béquer separado, girando usando o béquer de um litro para resíduos líquidos.

Transfira uma codi de cada vez para uma placa de Petri de 150 milímetros. Segure com uma pinça e use uma lâmina de barbear para raspar o tecido dos vasos em uma placa de Petri. Coloque o tecido raspado em um béquer separado contendo solução salina estéril a 0,9%.

Repita para todas as peças de tecido. Depois de enxaguar o tecido raspado na célula de dissociação, drene-o do excesso de líquido e peso para digerir o tecido placentário. Depois de preparar a mistura de digestão de tecidos, divida o tecido transferindo 60 gramas do tecido total coletado para um frasco estéril de 500 mililitros Helen Meyer.

Adicione a mistura de digestão de tecidos ao frasco que contém o tecido e incube a 37 graus Celsius em um agitador por 45 minutos. A 150 RPM para coletar as células dissociadas após a incubação e inclinar o frasco para permitir que o tecido se assente. Colete o super natin.

Tomando cuidado para não coletar tecido desassociado da UND. Adicione uma quantidade igual de HBSS ao sobrenadante antes de transferir para tubos de centrífuga estéreis de 15 mililitros. Repita a dissociação e a coleta do sobrenadante com as porções restantes de tecido associado à UND para cada lote após centrifugação 1000 vezes.

A gravidade por 15 minutos a quatro graus Celsius aspira o sobrenadante sem perturbar o chumbinho. As células das vilosidades placentárias estão predominantemente na porção branca do pellet que recobre os glóbulos vermelhos. Transferir as células das vilosidades da parte branca do sedimento para um tubo de centrifugação cónico estéril de 50 mililitros e manter no gelo.

Depois de coletar as células de todos os três estágios de digestão, use um filtro de células de náilon de 100 mícrons inserido na parte superior de um tubo de centrífuga cônico estéril de 50 mililitros para filtrar a suspensão. Se a filtração da suspensão celular diminuir, levante o filtro para cima para extrair um vácuo dentro do tubo, centrifugue a quatro graus Celsius e 1000 vezes a gravidade por 10 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet para homogeneizar as células das vilosidades placentárias usando meio de lise hipotônico recém-preparado ou HLM em uma capa de segurança biológica, adicione quatro vezes o volume do pellet celular de HLM gelado às células.

Use uma pipeta de 10 mililitros para resusus suave e completamente. Suspenda as células pipetando-as para cima e para baixo. Depois de incubar as células no gelo por 10 minutos, transfira-as para um homogeneizador gelado e homogeneize lentamente as células com o pilão solto, aplicando 20 a 25 movimentos suaves.

Gire o lisado a 3000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos para remover as células intactas. Em seguida, colete o sobrenadante em um novo tubo antes de girar novamente a 25.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 20 minutos. Para remover as mitocôndrias para isolar as gotículas lipídicas por ultracentrifugação, colete o super natin em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Ajuste para 20% de sacarose e transfira para o fundo de um tubo de ultracentrífuga para um rotor S SW 28 ou sobreposição equivalente do super natin ajustado à densidade com cerca de 10 mililitros de tampão de carbonato de sódio gelado, 100 milimolares e 0,5 a um mililitro de HLM gelado para encher o tubo usando uma centrífuga de rotor de caçamba oscilante S SW 28 a 130, 000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, colete a camada flutuante, ajuste para 10% de sacarose e transfira-a para o fundo de um tubo de ultracentrífuga de 13,2 mililitros para um rotor SW 41 TI ou sobreposição equivalente do sobrenadante ajustado à densidade com cerca de cinco mililitros de tampão de carbonato de sódio gelado de 100 milimolares e 0,5 mililitros de HLM gelado após centrifugação a 274, 000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 60 minutos. Em um rotor SW 41 TI, use uma pipeta de um mililitro para coletar cuidadosamente a camada flutuante superior contendo gotículas lipídicas.

Ajuste o volume para 10% de sacarose e transfira novamente para um tubo de ultracentrífuga de 13,2 mililitros antes de cobrir com cinco mililitros de tampão de carbonato de sódio gelado, 100 milimolares e 0,5 mililitros de HLM gelado. Após centrifugação por 30 minutos, use uma pipeta de PE dobrada para coletar cuidadosamente a camada flutuante superior de cor branca contendo as gotículas lipídicas em três tubos de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de HLM. Caracterize as gotículas lipídicas de acordo com o protocolo de texto como visto nesta figura, a presença de gotículas lipídicas isoladas de células de vilosidades placentárias humanas a termo foi verificada por coloração com um corante de fluorescência específico lipídico neutro boda P 4 93 5 0 3 e visualizado usando microscopia de fluorescência.

Mostrado aqui, a pureza das frações de gotículas lipídicas isoladas foi avaliada por western blotting com proteínas marcadoras para gotículas lipídicas que incluíam para lippin, duas calnexinas para o er, o marcador goi, GM um 30 CO X quatro para mitocôndrias e membrana plasmática, MEK um. Após a dilapidação, as gotículas lipídicas com acetona fria e as proteínas extraídas. As frações foram submetidas à polipina para Western blotting.

Segundo, a proteína de gotículas lipídicas foi detectada no sobrenadante pós-nuclear e na camada flutuante branca isolada contendo gotículas lipídicas. Proteínas específicas para membranas plasmáticas, como MK one e GM one 30, não foram detectadas em frações de gotículas lipídicas em nenhuma das camadas abaixo da camada flutuante para spin quatro e spin cinco. Conforme relatado anteriormente, a proteína calnexina e uma coloração fraca da proteína da membrana mitocondrial CO X quatro foram detectadas em outras partes da fração de gotículas lipídicas.

Esses resultados são consistentes com relatos anteriores que mostram que as gotículas lipídicas interagem com as mitocôndrias em células de mamíferos e com o ER r. Após este procedimento, outros métodos, como métodos proteômicos e lipidômicos, podem ser realizados para estudar questões adicionais, como quais fatores estão ligados às gotículas.