Name: Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a injetar partículas de polímeros biodegradáveis em linfonodos para desenvolvimento de vacinas terapêuticas. Este método permite controle preciso da liberação de componentes imunológicos no microambiente linfático.

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Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação PhRMA e um Prêmio de Pesquisa e Estudos da Universidade de Maryland, College Park. Agradecemos ao Prof. Darrell Irvine pelo apoio ao trabalho inicial realizado na conclusão da "Engenharia In situ do microambiente de linfonodos através da injeção intranodal de partículas de polímeros liberantes adjuvante". 5

Todos os estudos em animais neste protocolo foram concluídos em conformidade com as diretrizes federais, estaduais e locais, e utilizando protocolos revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Maryland.
1. Síntese de Micro e Nanopartículas estabilizadas lipídicas
<ol><li>Em um frasco de vidro de 7 ml(s), combine lipídios DOPC, DSPE-PEG e DOTAP a uma relação molar de 60:20:20 para preparar uma mistura lipídica mestre.<ol>
<li>Para sintetizar uma única amostra: Transfira 242,9 μl, 287,4 μl e 71,9 μl, de DOPC, DSPE-PEG e DOTAP, respectivamente, para o frasco utilizando pipetas sorológicas de vidro de 2 ml.</li>
		<li>Para sintetizar várias amostras: Multiplique cada volume lipídico acima pelo número de amostras e combine em um único frasco, em seguida, transfira alíquotas iguais desta mistura lipídica em frascos correspondentes a cada amostra a ser preparada.</li>
		<li>Lipídios secos sob um fluxo suave de gás nitrogênio por 10 minutos, ou colocados no forno a vácuo durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em um único frasco de vidro vazio de 20 ml, dissolva 80 mg de PLGA em 5 ml de diclorometano para cada amostra de partícula para gerar uma solução de caldo de polímero de 16 mg/ml.</li>
	<li>Adicione 5 ml de solução de polímero ao frasco(s) contendo os lipídios secos, tampa e vórtice por 30 segundos.</li>
	<li>Para sintetizar micropartículas:<ol>
<li>Comece a sonicar a fase orgânica contendo o polímero, lipídio e outra carga insolúvel em água no gelo a 12 W usando um sonicator.</li>
		<li>Crie a emulsão água-em-óleo (w/o) usando uma pipeta para adicionar 500 μl de H2O destilado, ou H2O contendo 1 mg de peptídeo, proteína ou outra carga solúvel em água.</li>
		<li>Continue sonicando por 30 segundos a 12 W no gelo, balançando suavemente o frasco para cima e para baixo e de um lado para o outro em torno da ponta do sonicator para garantir a emulsificação completa.</li>
		<li>Crie a emulsão água-em-óleo-na-água (w/o/w) derramando a emulsão w/o em 40 ml de H2O em um béquer de 150 ml.</li>
		<li>Homogeneize por 3 min a 16.000 rpm usando um homogeneizador digital.</li>
		<li>Adicione uma barra de agitação magnética, transfira o béquer para uma placa de mexida e deixe a emulsão w/o/w mexer durante a noite para remover o excesso de solvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para sintetizar nanopartículas:<ol>
<li>Comece a sonicar a fase orgânica contendo o polímero, lipídio e outra carga insolúvel de água no gelo a 14 W.</li>
		<li>Crie a emulsão de w/o usando uma pipeta para adicionar 500 μl de H2O destilado, ou H2O contendo 1 mg de peptídeo, proteína ou outra carga solúvel em água.</li>
		<li>Continue sonicando por 30 segundos a 14 W no gelo.</li>
		<li>Crie a emulsão w/o/w derramando a emulsão w/o a 40 ml de H2O em um béquer de 150 ml e sonicando por 5 min a 16 W no gelo. Balance suavemente o frasco para cima e para baixo e lado a lado ao redor da ponta do sonicator para garantir a emulsificação completa.</li>
		<li>Adicione uma barra de agitação magnética, transfira o frasco para uma placa de mexida e deixe a emulsão w/o/w mexer durante a noite para remover o excesso de solvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na manhã seguinte, lave e colete partículas:<ol>
<li>Despeje a emulsão através de 40 μm coador de células de malha de nylon em um tubo cônico de 50 ml.</li>
		<li>Partículas centrífugas por 5 min a 5.000 x g para micropartículas ou 5 min a 24.000 x g para nanopartículas.</li>
		<li>Decanteante supernaspetivo e lave partículas reutilizando-se em 1 ml de H2O.</li>
		<li>Transfira partículas suspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Centrífuga por 5 min a 5.000 x g para micropartículas ou 5 min a 24.500 x g para nanopartículas.</li>
		<li>Lave partículas mais duas vezes removendo supernasces, resusus pendentes em 1 ml H2O, e centrifugando como na etapa 1.6.5. Após a lavagem, suspenda partículas em 1 ml H2O para uso imediato ou liofilize para armazenamento prolongado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Medição do Rendimento da Síntese
<ol><li>Preweigh um frasco vazio de vidro de 20 ml. Adicione 100 μl de suspensão de partículas ao frasco pré-varrido após a tubulação para cima e para baixo com uma micropipette para misturar.</li>
	<li>Lyophilize as partículas ou seque sob um fluxo suave de nitrogênio.</li>
	<li>Pesar o frasco contendo o polímero seco. Determine o rendimento de partículas no frasco subtraindo o peso original do frasco da massa do frasco contendo as partículas secas.</li>
	<li>Determine o rendimento total das partículas multiplicando a massa de partículas no frasco pelo fator de diluição. Para determinar o rendimento percentual, divida a massa de partículas pela massa de entrada teórica máxima e multiplique em 100%.</li>
</ol>3. Determinação do tamanho das partículas
<ol><li>Limpe a célula de fração de vidro fornecida no estilo cuvette, enchendo com água deionizada e limpando com cotonete com ponta de algodão. Transfira 10 ml de H2O destilado para a célula de facção limpa, adicione micro-barra de agitação magnética e carregue a célula fracionada no suporte celular do analisador de tamanho de partículas.</li>
	<li>Ajuste a velocidade de agitação magnética no analisador de partículas para obter a mistura completa na célula fração e feche a porta do compartimento.</li>
	<li>Alinhe os lasers à célula fração usando a interface de software de instrumento.</li>
	<li>Use a interface do software de instrumento para gravar uma leitura de linha de base com a célula fração contendo apenas H2O destilado.</li>
	<li>Pipeta a suspensão original de partículas para cima e para baixo com uma micropipette para misturar.</li>
	<li>Pipeta 10 μl de suspensão de partículas (tipicamente aproximadamente 0,5 mg) na célula fracionária. Certifique-se de que o volume da amostra de partículas adicionada à célula é suficiente para gerar força de sinal na faixa apropriada, conforme indicado na interface do software do instrumento. A massa real de partículas necessária depende do rendimento percentual e das propriedades ópticas da amostra de partículas.</li>
	<li>Feche a porta do compartimento do analisador de tamanho de partículas e meça o tamanho das partículas usando um índice refrativo de 1,60 para PLGA.</li>
	<li>Use a interface de software para calcular o diâmetro das partículas usando uma base numémia.</li>
</ol>4. Visualização de Partículas
<ol><li>Suspensão de partículas pipeta para cima e para baixo com micropipette para misturar. Suspensão de partículas diluídas a 1 mg/ml em água deionizada.</li>
	<li>Prepare um slide de microscópio adicionando 3 μl de suspensão de partículas diluídas e montando um deslizamento de tampa em um ângulo de 45° para evitar a formação de bolhas. Coloque o slide no estágio do microscópio e na imagem usando os conjuntos de filtros apropriados para cada carga fluorescente.</li>
</ol>5. Preparação de Ratos para i.LN. injecção
<ol><li>Prepare a solução de corante do rastreador:<ol>
<li>Prepare uma solução de 0,1% (w/v) de corante rastreador, dissolvendo 10 mg de pó de corante com 10 ml de H2O destilado.</li>
		<li>Esterilize a solução de corante em um frasco de vidro usando um filtro de seringa de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um dia antes da injeção, anesthetize o rato usando isoflurane de acordo com um protocolo animal aprovado pela IACUC. Para avaliar a profundidade da anestesia, realize um teste de reflexo de beliscar o dedo do pé e monitore a taxa de respiração para garantir uma taxa respiratória de aproximadamente 100-140 respirações por minuto.</li>
	<li>Raspe o cabelo na base da cauda e do traseiro usando cortadores enquanto o rato é anestesiado. Remova o cabelo do lado ventral do animal e lateralmente ao redor do lado dorsal logo acima da articulação da perna traseira (quadril).</li>
	<li>Injete corante rastreador.<ol>
<li>Para cada injeção de corante, use uma micropipette para transferir 10 μl de solução de corante em um tubo de microcentrifuuge, e aspire toda a 10 μl em uma agulha 31G presa a uma seringa de 1 ml.</li>
		<li>Injete 10 μl de solução de corante subcutânea em cada lado da base traseira onde o cabelo foi cortado, recarregando entre as injeções.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova o cabelo restante aplicando um creme depilatório leve através de cotonetes de algodão. Certifique-se de revestir a área entre a parte traseira da coxa e abdômen.</li>
	<li>Deixe o creme depilatório incubar na pele por 3 minutos. Após a incubação, mão enluvada molhada com H2O quente e esfregue suavemente creme depilatório na pele.</li>
	<li>Remova imediatamente o creme depilatório molhando a mão enluvada com H2O quente e esfregando a base da cauda e o traseiro. Repita até que o excesso de depilatório seja removido, certificando-se de manter a mão molhada para evitar irritação.</li>
	<li>Remova o depilatório residual do mouse, molhando um pano macio ou uma toalha de papel com H2O quente e em um único movimento, limpando porção inferior do mouse. Evite um movimento de esfregar para evitar abrasão ou danos na pele do mouse.</li>
	<li>Deixe que o mouse se recupere sob uma lâmpada de calor e volte a segurar.</li>
</ol>6. i.LN. Injeção de Partículas
<ol><li>No dia seguinte, anesthetize o rato usando isoflurane de acordo com um protocolo animal aprovado pela IACUC.</li>
	<li>Examine o mouse para confirmar a drenagem do corante rastreador em cada linfonodo inguinal. O linfonodo deve ser visível como uma mancha escura perto da coxa traseira e abdômen.</li>
	<li>Prepare a solução de injeção de partículas:<ol>
<li>Partículas de resuspend em H2O destiladas na concentração de injeção desejada. Para cada injeção, use uma micropipette para transferir 10 μl de solução de partículas para um tubo de microcentrifuge.</li>
		<li>Aspire o 10 μl inteiro em uma agulha de insulina 31G presa a uma seringa de 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção de partícula:<ol>
<li>Depois de visualizar a LN, aperte a pele ao redor da LN usando polegar, dedo indicador e dedo médio para puxar a provocação da pele e permitir a colocação controlada do volume de injeção.</li>
		<li>Aproxime-se da LN com a agulha em um ângulo de 90° para a pele e penetrá-lo sobre a LN tingida a uma profundidade de 1 mm.</li>
		<li>Injete lentamente todo o volume. Durante a injeção, observe o volume de LN através da pele para confirmar a injeção por alargamento visível da LN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permita que o mouse se recupere sob uma lâmpada de calor e volte a segurar ou realize testes adicionais.</li>
</ol>Para técnicas de análise relevantes (por exemplo, histologia, citometria de fluxo) consulte os artigos JoVE 265, 1743 e 3054 e Protocolos Atuais em Imunologia, capítulos 5 e 2115-22.

<ol><li>Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Approaches+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering Approaches to Immunotherapy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
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<li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-Lymph+Node+Prime-Boost+Vaccination+against+Melan+A+and+Tyrosinase+for+the+Treatment+of+Metastatic+Melanoma%3A+Results+of+a+Phase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Trial.+Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1.</a> Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li>
<li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li>
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<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li>
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<li>Bershteyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-supported+lipid+shells%2C+onions%2C+and+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers.</a> Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).</li>
<li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li>
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<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).</li>
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<li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22in+Current+Protocols+in+Immunology%3A+Analysis+of+Flow+Cytometry+Data%22">in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
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</ol>

Os custos de produção e as taxas de acesso para este artigo foram parcialmente patrocinados pela HORIBA, Ltd.

A técnica descrita neste protocolo permite a entrega controlada de vacinas às LNs e às células de apresentação de antígenos residentes em LN. A carga encapsulada por materiais biomagráficos pode ser localizada dentro da LN, permitindo a manipulação das doses de um ou mais tipos de carga entregues ao microambiente LN. A localização e a liberação controlada de partículas de polímeros tem sido demonstrada para gerar uma potente resposta imune celular e humoral em doses significativamente menores do que as abordagens convencionais. Além disso, através da manipulação do tamanho do transportador de biomateriais, o modo primário de processamento celular pode ser modulado entre a absorção direta de nanopartículas ou a liberação de carga extracelular de micropartículas maiores5. Esses resultados estabelecem a viabilidade da entrega de biomateriais como plataforma de entrega de vacinas terapêuticas.
A síntese de partículas PLGA por evaporação de emulsão/solvente tem sido amplamente empregada em aplicações de entrega de medicamentos23,24. Assim, os desafios potenciais associados a essa técnica referem-se principalmente à identificação e deposição bem-sucedidas de vacinas no local alvo da LN. Embora o uso de corante rastreador facilite a visualização das LNs inguinais direcionadas, o tamanho do alvo e a profundidade sob a pele são pequenos. Assim, os autores recomendam o tempo de alocação e camundongos para a prática da preparação e injeções de camundongos. Durante a preparação animal (ou seja, barbear e aplicação de depilatório), deve-se tomar cuidado para não cortar os camundongos no lado ventral do animal onde o ângulo da perna com o abdômen torna a pele mais propensa a lesões de cortadores. Além disso, todo depilatório deve ser removido com água morna para evitar que os animais ingeram o creme durante o comportamento normal de preparo. Para praticar injeções de LN, uma maior concentração de corante rastreador pode ser administrada e praticar animais podem ser eutanizados e, em seguida, injetados várias vezes. Após a injeção os camundongos podem ser necropsiados e o tamanho de LNs de animais injetados pode ser comparado com um controle não injetado LN. Uma limitação dessa técnica é o limite físico do volume de injeção que pode ser carregado na estrutura LN. Nosso protocolo sugere um volume de injeção de 10 μl em camundongos, embora outros estudos tenham relatado volumes de injeção maiores pelo menos até 20 μl.13 No entanto, a entrega direta de vacinas via injeção i.LN. permite uma dose dramática para que a função dessas vacinas geralmente não deve ser limitada por restrições de volume.
Como observado, mudar a propriedade física das partículas (ou seja, tamanho) é um mecanismo eficaz para alterar a via ou os desfechos induzidos por biomateriais e cargas encapsuladas no tecido LN. O protocolo de evaporação de emulsão/solvente pode ser facilmente modificado para alterar propriedades físicas ou químicas, como carga ou funcionalidade de superfície, e a taxa de biodegradação/liberação de carga23,24. Por exemplo, a cinética de liberação pode ser ajustada através de composições alternativas de polímeros, e a função da superfície pode ser alterada usando composições lipídicas modificadas ou poli (álcool vinil). A carga carregada em partículas pode ser facilmente manipulada para conter diferentes antígenos ou adjuvantes para patógenos alvo. A vantagem dessa abordagem é alcançada através da combinação de entrega de I.LN. com a liberação local e controlada de carga de biomateriais. Essa sinergia estabelece uma plataforma que pode ser explorada para gerar respostas imunes adaptativas de forma eficiente usando doses minuciosas e com efeitos colaterais não específicos/sistêmicos reduzidos.

Os linfonodos (LNs) são os centros de comando do sistema imunológico. Neste sítio imunológico, o antígeno que apresenta células é linfócito ingênuo contra antígenos estranhos específicos para ativar respostas imunes celulares e humorais. As LNs tornaram-se, assim, um alvo atraente para a entrega de vacinas e imunoterápicos. Infelizmente, a maioria das estratégias de vacina resultam em entrega ineficiente e transitória de antígeno e adjuvantes ao tecido linfoide1. Abordagens que melhorem a segmentação e retenção de componentes de vacinas em LNs podem, portanto, ter um impacto significativo na potência e eficiência de novas vacinas.
Uma estratégia para contornar o desafio da segmentação da LN que demonstrou grande interesse em novos ensaios clínicos é a injeção direta, intra-LN (i.LN.)2-4. Esses ensaios utilizaram orientações de ultrassom para fornecer vacinas às LNs como um simples procedimento ambulatorial. Em comparação com as rotas tradicionais de injeção periférica, essa abordagem resultou em uma significativa economia de doses e eficácia melhorada em contextos terapêuticos, incluindo alergias e câncer2-4. Estes estudos utilizaram a injeção de vacinas solúveis ( ouseja, livres de biomateriais) que foram rapidamente liberadas por drenagem linfática. Portanto, várias injeções ou ciclos de múltiplas injeções foram administrados para alcançar esses efeitos terapêuticos impressionantes. Uma retenção melhorada na LN poderia melhorar a interação entre antígeno e/ou células imunes e adjuvantes, melhorando ainda mais a potência da escorva de células imunes. Esse potencial é apoiado por estudos recentes que mostram cinética de antígeno e entrega adjuvante desempenham um papel crítico na determinação da resposta imune específica gerada5-7. Além disso, a localização e a minimização das doses de medicamentos e vacinas poderia reduzir ou eliminar efeitos sistêmicos, como inflamação crônica.
Os biomateriais têm sido estudados extensivamente para aumentar a potência e a eficiência das vacinas1,8,9. Encapsulamento ou adsorção em transportadores de biomateriais pode proteger fisicamente a carga da degradação e superar as limitações de solubilidade. Outra característica notável dos transportadores de biomateriais, como micro-partículas poliméricas ou nanopartículas, é a capacidade de cocarregar várias classes de carga e, posteriormente, liberar essas cargas sobre intervalos controlados. No entanto, uma limitação significativa que continua a dificultar vacinas biomateriais e imunoterápicos in vivo é alvo ineficiente de células imunes e tráfico limitado a linfonodos. Por exemplo, a injeção periférica de vacinas biomateriais através de rotas convencionais (por exemplo, intradérmicas, intramusculares) normalmente apresentam má segmentação de LN, com até 99% do material injetado permanecendo no local da injeção4,10. Mais recentemente, o tamanho dos portadores de vacinas biomateriais foi ajustado para melhorar o tráfico preferencial ou a drenagem dessas vacinas para LNs através do fluxo intersticial8,10. Esses avanços levaram a uma maior resposta imune celular e humoral, ressaltando a importância de direcionar e projetar o ambiente LN para novas vacinas.
Este artigo apresenta um protocolo de vacinação que combina partículas de polímeros estabilizadas lipídicas e entrega de I.LN. para gerar depósitos de vacinas de liberação controlada5,11. Baseando-se em estudos recentes que empregam técnicas cirúrgicas para i.LN. em camundongos6,7,12,13, desenvolvemos uma estratégia rápida e não-úrgica para injetar vacinas biomateriais em animais de pequeno porte5. Combinando a entrega da I.LN com os portadores de vacinas biomateriais potencialmente melhorou a resposta das células CD8 T dentro de 7 dias após uma única injeção de depósitos de vacinas de liberação controlada5. Também foi gerada uma forte resposta humoral (ou seja, titulantes de anticorpos; ambos os aprimoramentos foram ligados ao aumento da retenção de componentes vacinais em linfonodos que foram mediados pela liberação controlada dos portadores de biomateriais. Curiosamente, o tamanho das partículas de vacina alterou o destino desses materiais uma vez nas LNs: partículas nanoescala mostraram maior absorção direta por células, enquanto micropartículas maiores permaneceram no ambiente de LN extracelular e liberaram cargas(por exemplo, adjuvante) que foram absorídas pelo antígeno residente em LN que apresentava células5. Esses dados sugerem dois caminhos que poderiam ser explorados para novas vacinas controlando o tamanho de biomateriais injetados i.LN.
Neste artigo, partículas de polímero biodegradáveis estabilizadas por lipídios (micro e nanoescala) são sintetizadas usando uma estratégia de dupla emulsão modificada5,11. As propriedades das partículas são caracterizadas por difração a laser e microscopia. Essas partículas são então injetadas diretamente nas LNs inguinais identificadas nãourgicamente usando um corante rastreador comum e nãotóxico14. A análise pós-injeção de LNs por histologia ou citometria de fluxo pode ser usada para verificar a distribuição de partículas dentro do ambiente LN, bem como para monitorar a absorção celular e a retenção de partículas ao longo do tempo. Para protocolos detalhando processamento histológico e citometria de fluxo, os leitores são encaminhados para artigos recentes do JoVE e relatórios de revistas15-22. Resultados típicos demonstram o direcionamento local da LN desses depósitos que poderiam ser explorados para alcançar respostas imunes potentes e eficientes ou para adaptar a imunidade para patógenos-alvo.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>10 mg/ml de estoque em clorofórmio</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenoglicol)-2000] sal de amônio (DSPE-PEG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880128</td><td>estoque de 10 mg/ml em clorofórmio</td></tr><tr><td>Sal de cloreto de 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890</td><td>10 mg/ml estoque em clorofórmio</td></tr><tr><td>Ácido polilático-co-glicólico (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td>Lactídeo:Glicolídeo (50:50). MW 30.000-60.000</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>VWR</td><td>BDH1113</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vetone 502017</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nair Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evans corante traçador azul</td><td>VWR</td><td>AAA16774-09</td><td></td></tr><tr><td>U-100 BD Seringas de insulina curtas ultrafinas, 31 G Agulha de 5/16 pol.</td><td>VWR</td><td>BD328418</td><td></td></tr><tr><td>agulhas descartáveis, BD Medical, 21 G, 1,5 em agulha</td><td>VWR</td><td>BD305167</td><td></td></tr><tr><td>Seringas com Ponta BD Luer-Lok, BD Medical, 1 ml</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Células Falcon, Estéril, Corning, 40 &micro; m</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Marcação de Células Vybrant DiD</td><td>Invitrogen</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>17149</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>17156</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumina, Purificado</td><td>Worthington Bioquímico</td><td>LS003056</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Sonicator Processador Ultrassônico Q125</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Sonda microtip de 1/8 de diâmetro</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax T 25 homogeneizador digital</td><td>IKA</td><td>YO-04739-22</td><td>Elemento de dispersão de 10 G</td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente</td><td>Olympus</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de Distribuição de Tamanho de Partícula por Difração a Laser</td><td>Horiba</td><td>LA-950</td><td>Incluindo célula de fração de vidro estilo cubeta fornecida</td></tr><tr><td>Profissional 8685 Peanut Classic Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

A geração de resposta imune adaptativa depende de drenagem eficiente ou tráfico de antígeno para linfonodos para processamento e apresentação dessas moléculas estranhas aos linfócitos T e B. Os linfonodos tornaram-se, assim, alvos críticos para novas vacinas e imunoterapias. Uma estratégia recente para atingir esses tecidos é a injeção direta de linfonodos de componentes de vacinas solúveis, e os ensaios clínicos envolvendo essa técnica têm sido promissores. Várias estratégias de biomateriais também têm sido investigadas para melhorar o direcionamento do linfonodo, por exemplo, ajustando o tamanho das partículas para a drenagem ideal de partículas de vacinas biomateriais. Neste artigo apresentamos um novo método que combina injeção direta de linfonodo com partículas de polímeros biodegradáveis que podem ser carregadas com antígeno, adjuvante ou outros componentes da vacina. Neste método, micropartículas poliméricas ou nanopartículas são sintetizadas por um protocolo de dupla emulsão modificado que incorpora estabilizadores lipídicos. As propriedades das partículas (por exemplo, tamanho, carga de carga) são confirmadas por difração a laser e microscopia fluorescente, respectivamente. Os linfonodos do rato são então identificados pela injeção periférica de um corante rastreador nãotóxico que permite a visualização do local de injeção alvo e a subsequente deposição de partículas de polímeros em linfonodos. Esta técnica permite o controle direto sobre as doses e combinações de biomateriais e componentes de vacinas entregues a linfonodos e poderia ser aproveitada no desenvolvimento de novas vacinas baseadas em biomateriais.

Os resultados esperados para os protocolos apresentados neste manuscrito podem ser divididos em três categorias: síntese de partículas, preparação animal e injeção de partículas.
A Figura 1 retrata a síntese e caracterização de partículas de polímeros biodegradáveis, estabilizadas por lipídios anfílicos. Os resultados do protocolo de síntese de evaporação de emulsão/solvente(Figura 1A)podem ser avaliados qualitativamente pela inspeção visual das emulsões finais geradas; Os lotes de partículas devem ser emulsões homogêneas e estáveis com aparência opaca. As complicações incluem emulsões que creme ou floculado, muitas vezes devido ao armazenamento inadequado de estabilizadores lipídicos. Para evitar essa instabilidade, os lipídios devem ser armazenados a -80 °C em estado desidratado ou em um frasco selado purgado com nitrogênio. A avaliação quantitativa da síntese de partículas pode ser realizada utilizando difração a laser ou dispersão dinâmica de luz para analisar a distribuição de tamanho(Figura 1B). Os resultados esperados incluem tamanhos de partículas monomodais bem distribuídos, indicando uma população uniforme de partículas. Os parâmetros de síntese descritos neste manuscrito geram distribuições médias de número centradas em aproximadamente 100 nm ou 3 μm para nanopartículas e micropartículas, respectivamente. Uma avaliação qualitativa adicional da síntese de partículas pode ser alcançada através da modificação do protocolo acima para incorporar múltiplas classes de carga fluorescente. Na Figura 1C,imagens de microscopia de micropartículas carregadas com peptídeo fluorescente (FITC, verde), um corante lipofílico (DiD, vermelho) e uma imagem de sobreposição (amarela) confirmam a criação de partículas dentro da faixa de tamanho desejada e encapsulamento de peptídeo dentro do volume da partícula.
Os dois primeiros painéis da Figura 2 resumem os resultados esperados da preparação animal para a estratégia de injeção da LV descrita neste artigo. A metodologia envolve a marcação de LNs inguinais por injeção periférica de um rastreador nãotóxico para identificar o local para posterior injeção de partículas i.LN. (Figura 2A)5. Como observado, a drenagem do corante rastreador após injeção subcutânea na base traseira permitirá a visualização das LNs inguinais(Figura 2B)5. A ingestão de cremes depilatórios aprovados pode representar perigos para os camundongos. Assim, deve-se tomar cuidado para remover completamente todo o creme aplicado, prestando especial atenção às patas e ao lado ventral dos ratos. O depilatório deve ser removido usando um pano molhado, macio ou toalha de papel molhado em um único movimento suave. Evite esfregar para remover o creme, pois isso pode levar a escoriações na pele exposta dos camundongos.
A confirmação do local de entrega ao Inguinal LN pode ser avaliada através de observação ou histologia. O volume de LN pode ser monitorado visualmente durante a injeção como um indicador de injeção bem sucedida. Os resultados esperados incluem distribuição eficiente de carga em toda a estrutura LN, sem vazamento significativo para tecidos ou células adjacentes. Além disso, à medida que o fluido injetado desloca/dilui o rastreador na LN, a concentração/coloração de corantes deve tornar-se menos intensa após a injeção. A observação do tecido deve revelar uma LN intacta, mas aumentada devido à injeção de fluido. Os desafios potenciais incluem injetar muito rapidamente ou perder a LN, ambas as quais podem causar elução do volume em tecido subcutâneo circundante. Esses desfechos indesejáveis podem ser confirmados por necropsia ou histologia, onde a suspensão de partículas será observada se espalhando para células e tecidos distantes de nós destinados à injeção. Em contraste, um resultado esperado seria a identificação de uma LN inguinal ampliada devido à contenção de partículas dentro da estrutura LN. O processamento histológico de LNs excisadas pode confirmar definitivamente a entrega de carga para o tecido linfoide, como mostrado nas Figuras 2C e 2D. Note que as partículas da Figura 2 incorporam carga fluorescente para permitir a visualização da carga durante a injeção, bem como durante o processamento histológico e microscopia fluorescente.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Síntese e Caracterização de Partículas Estabilizadas Lipídicas. A) Diagrama esquemático descrevendo a síntese de partículas estabilizadas lipídicas preparadas pela evaporação de emulsão/solvente. B) Distribuições de tamanho de micropartículas (linha sólida, diâmetro = 2,8 μm) e nanopartículas (linha tracejada, diâmetro = 113 nm). C) Imagens de microscopia fluorescente de partículas carregadas com peptídeo fluorescente e um corante de partículas fluorescentes. Rótulos: peptídeo (verde) e partícula (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. I.LN. Injeção e Distribuição de Partículas Biodegradáveis dentro da LN. A) Metodologia para injeção de LN. B) Visualização de LNs em um camundongo através da pele (imagem superior) e após necropsia (imagem inferior)5. C) Coloração histológica de uma LN confirmando a deposição e distribuição de micropartículas de polímeros fluorescentes (partículas, verde; Células T, vermelho; Células B, azul). D) Nanopartículas fluorescentes (50 nm, imagem esquerda) e micropartículas (6 μm, imagem direita) em LNs 24 horas após a injeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.

Linfonodos são os tecidos imunológicos que orquestram a resposta imune e são um alvo crítico para as vacinas. Os biomateriais têm sido empregados para melhor direcionar linfonodos e controlar a entrega de antígenos ou adjuvantes. Este artigo descreve uma técnica que combina essas ideias para injetar partículas de polímeros biocompatíveis em linfonodos.

Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

O objetivo geral deste procedimento é depositar partículas de vacinas de biomateriais nos linfonodos utilizando uma técnica de injeção direta. Primeiro, sintetize as partículas poliméricas estabilizadas com lipídios usando um método de dupla emulsão. Em seguida, lave as partículas e meça as propriedades do material, como tamanho, carga, eficiência de carregamento ou estabilidade.Em seguida, administre um corante traçador na base da cauda do camundongo para permitir a visualização após a drenagem do corante para o linfonodo. O passo final é identificar o linfonodo marcado com D e injetar um pequeno volume de partículas poliméricas nesse local. A histologia, a imunofluorescência e a microscopia confocal podem ser utilizadas para confirmar a presença e distribuição das partículas nos linfonodos inguinais.A combinação da injeção direta em nódulos linfáticos com biomateriais para vacinação permite um controle rigoroso sobre as combinações e doses dos componentes da vacina no microambiente dos nódulos linfáticos, além de possibilitar a liberação controlada de cargas nesses tecidos. Todas as vacinas precisam alcançar os nódulos linfáticos para serem eficazes. Assim, definir como os biomateriais e as sinais imunológicos incorporados afetam a sinalização local nos nódulos linfáticos é importante para relacionar esses eventos à resposta imune sistêmica.Esse conhecimento nos ajudará a compreender melhor como as vacinas baseadas em biomateriais funcionam quando administradas por vias tradicionais. Embora a entrega intra-nódulo linfático de biomateriais sirva como uma ferramenta para estudar os efeitos desses materiais na organização dos nódulos linfáticos, essa plataforma também oferece uma oportunidade aplicada para desenvolver novas vacinas terapêuticas e imunoterapias direcionadas ao câncer e a distúrbios autoimunes. Para sonificar micropartículas, utilize a fase orgânica contendo o polímero, o lipídio e outras cargas insolúveis em água, em gelo, a 12 watts.Para criar a emulsão de água e óleo, adicione 500 microlitros de H2O destilada ou H2O contendo um miligrama de proteína peptídica ou outra carga solúvel em água. Continue agitando por 30 segundos. Agite suavemente o frasco de cima para baixo e de um lado para o outro ao redor da ponta do agitador para garantir a emulsificação completa.Agora, prepare a emulsão de água e óleo em água vertendo a emulsão de água e óleo em 40 mililitros de H2O e homogeneizando por três minutos a 16.000 RPM. Em seguida, adicione uma barra de agitação magnética e agite a emulsão de água e óleo em água durante a noite para remover o solvente em excesso após a remoção do solvente durante a noite. Verte a emulsão através de uma peneira de malha de náilon de 40 micrômetros para um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue por cinco minutos, decante o sobrenadante, ressuspenda o pellet de partículas em um mililitro de água e transfira as partículas suspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Colete as partículas por meio de uma centrifugação de cinco minutos. Meça o tamanho das partículas por difração a laser ou dispersão de luz. Verifique se o volume de água adicionado à cela de fração está em um nível suficiente para alinhamento e zeragem. Pipete 10 microlitros da suspensão de partículas na cela de fração.Feche a porta do compartimento do analisador de tamanho de partículas. Em seguida, meça o tamanho das partículas para PLGA. Utilize um índice de refração de 1,60.Utilize a interface do software para calcular o diâmetro das partículas com base numérica um dia antes da injeção. Anestesie o camundongo de acordo com um protocolo animal aprovado pelo IACUC. Avalie a profundidade da anestesia com um teste no dedo do pé.Realize testes do reflexo de preensão e monitore a respiração para garantir uma frequência respiratória de 100 a 120 movimentos por minuto. Depile o pelo na base da cauda e na região traseira. Remova o pelo do lado ventral do animal e lateralmente até o lado dorsal, logo acima da articulação da pata traseira.Para cada injeção de corante, utilize uma micropipeta para transferir 10 microlitros de solução de corante para um tubo microcêntrifugo e aspire os 10 microlitros completos através de uma agulha de calibre 31 para dentro de uma seringa de insulina de um mililitro. Agora, injete 10 microlitros de solução de corante subcutaneamente em cada lado da base da cauda para carregar entre as injeções. Aplique um creme depilatório suave para remover os pelos restantes.Certifique-se de cobrir a área entre a pata traseira e o abdômen. Após três minutos, use uma luva úmida com H₂O morna e esfregue suavemente o creme depilatório na pele. Repita imediatamente para remover o excesso de depilatório.Em seguida, umedeça um pano macio ou toalha de papel com água morna e, com um único movimento, limpe a porção inferior do camundongo. Coloque o camundongo sob uma lâmpada de calor para se recuperar e, depois, devolva-o ao alojamento por pelo menos 12 horas. Examine o camundongo anestesiado para confirmar a drenagem do traçador ou corante para cada linfonodo inguinal.O linfonodo deve ser visível como uma mancha escura próxima à coxa traseira e ao abdômen. Agora, re-suspenda os partículas em água destilada na concentração desejada para cada injeção. Utilize uma micropipeta para transferir 10 microlitros da solução de partículas para um tubo de microcentrífuga.Aspire os 10 microlitros inteiros para dentro de uma agulha de insulina de calibre 31 acoplada a uma seringa de um mililitro. Estique a pele ao redor do linfonodo corado com a agulha em um ângulo de 90 graus em relação à pele. Penetre a pele até uma profundidade de um milímetro.Injete lentamente todo o volume, monitorando o aumento visível dos linfonodos. Deixe o camundongo se recuperar sob uma lâmpada de calor e, em seguida, devolva-o ao alojamento ou realize testes adicionais. Primeiro, confirme a síntese das partículas e a distribuição de tamanho.O protocolo de síntese por evaporação do solvente em emulsão pode ser avaliado qualitativamente mediante inspeção visual das emulsões finais geradas. As emulsões devem apresentar uma suspensão homogênea, livre de agregados visíveis. A distribuição do tamanho das partículas pode ser confirmada por difração a laser ou espalhamento dinâmico de luz; as amostras de partículas devem exibir uma distribuição monomodal.A avaliação qualitativa adicional da síntese de partículas pode ser realizada mediante modificação do protocolo para incorporar uma ou mais cargas fluorescentes, como um peptídeo fluorescente ou corante lipofílico. O corante pode ser usado para localizar e direcionar o linfonodo para a injeção das partículas. Durante o treinamento, os camundongos podem ser eutanasiados e submetidos à necropsia após a injeção do corante, a fim de familiarizar-se com as localizações dos linfonodos. A distribuição das partículas nas zonas de células T e B do linfonodo infectado é confirmada por microscopia confocal de linfonodos seccionados e corados.Diferenças nas propriedades das partículas, como o tamanho, podem ser observadas em linfonodos após injeção e imagem por microscopia de fluorescência. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída ao longo de dois dias. A síntese das partículas e o preparo dos animais ocorrem no primeiro dia. A lavagem das partículas, sua caracterização e a injeção intra-linfonodal são realizadas no segundo dia.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como um traçador ou corante pode ser usado para visualizar e injetar os linfonodos inguinais de camundongos. Esta técnica permite a entrega não cirúrgica de vetores vacinais de biomateriais diretamente ao linfonodo, com um nível de controle que antes não era possível. A administração direta de biomateriais aos linfonodos permitirá que cientistas, engenheiros, imunologistas e pesquisadores de desenvolvimento de vacinas explorem as interações fundamentais entre vacinas de biomateriais e sinais imunológicos com o linfonodo, lançando nova luz sobre os mecanismos pelos quais esses materiais estimulam e moldam a imunidade.

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune 1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Descrevemos a produção e caracterização de nanopartículas e micropartículas compostas por poli(ácido lático-co-glicólico) utilizando a vitamina E-TPGS como emulsificante. Variando os parâmetros de formulação, como a concentração do emulsificante, é possível produzir nanopartículas com diâmetros médios que variam de 220 nm a 1,98 μm.

Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Entrega de drogas local para as glândulas submandibulares é de interesse em biologia de glândula salivar de entendimento e para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Apresentamos um protocolo de injeção retroductal atualizadas e detalhadas, destinado a melhorar a precisão de entrega e reprodutibilidade experimental. O aplicativo aqui apresentado é a entrega de nanopartículas poliméricas.

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

Este protocolo descreve a síntese e formulação de biomateriais hidrogéis de polímero supramolecular injetável (PNP). As aplicações desses materiais para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular são demonstradas.

Hidrogéis de polímero supramolecular injetável para aplicações de entrega de células e medicamentos

Um protocolo padrão é descrito para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade associada da IL-1α em um modelo singênico de camundongo de HNSCC.

Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

Aprenda a injetar partículas de polímeros biodegradáveis em linfonodos para desenvolvimento de vacinas terapêuticas. Este método permite controle preciso da liberação de componentes imunológicos no microambiente linfático.

Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

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