Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

O objetivo geral deste procedimento é depositar partículas de vacina de biomaterial nos gânglios linfáticos usando uma técnica de injeção direta. Primeiro, sintetize as partículas de polímero estabilizadas com lipídios usando um método de emulsão dupla. Em seguida, lave as partículas e meça as propriedades do material, como tamanho, carga, carga ou estabilidade.

Em seguida, administre um corante traçador na base da cauda do camundongo para permitir a visualização após a drenagem do corante para o linfonodo. A etapa final é identificar o linfonodo marcado com D e injetar um pequeno volume de partículas de polímero neste local. Histologia, imunofluorescência e microscopia confocal podem ser usadas para confirmar a presença e distribuição de partículas nos linfonodos inguinais.

A combinação da injeção direta de linfonodos com biomateriais para vacinação permite um controle rígido sobre as combinações e doses de componentes da vacina no microambiente linfonodal e permite a liberação controlada de carga nesses tecidos. Todas as vacinas devem atingir os gânglios linfáticos para serem eficazes. Portanto, definir como os biomateriais e as pistas imunes incorporadas afetam a sinalização local dos linfonodos é importante para vincular esses eventos à resposta imune sistêmica.

Esse conhecimento nos ajudará a entender melhor como funcionam as vacinas de biomateriais administradas ao longo das rotas tradicionais. Embora a entrega intralinfonodo de biomateriais sirva como uma ferramenta para estudar os efeitos dos biomateriais na organização dos linfonodos, esta plataforma também oferece uma oportunidade aplicada para desenvolver novas vacinas terapêuticas e imunoterapias voltadas para o câncer e doenças autoimunes. Para micropartículas sonicate, a fase orgânica que contém o polímero lipídico e outras cargas insolúveis em água em gelo a 12 watts.

Para criar a emulsão de água e óleo, adicione 500 microlitros de H2O ou H2O destilado contendo um miligrama de proteína peptídica ou outra carga solúvel em água. Continue fornicando por 30 segundos. Balançando suavemente o frasco para cima e para baixo de um lado para o outro ao redor da ponta do ator para garantir a emulsificação completa.

Agora prepare a emulsão de água e óleo em água despejando a emulsão de óleo de água em 40 mililitros de H2O homogeneizado por três minutos a 16.000 RPM. Em seguida, adicione uma barra de agitação magnética e mexa a água e o óleo na emulsão de água durante a noite para remover o excesso de solvente após a remoção do solvente durante a noite. Despeje a emulsão através de um filtro de célula de malha de náilon de 40 mícrons em uma centrífuga de tubo cônico de 50 mililitros por cinco minutos, decantar o sobrenadante, ressuspender o pellet de partículas em um mililitro de água e transferir as partículas suspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Coletar as partículas por centrifugação de cinco minutos. Meça o tamanho das partículas por difração de laser ou dispersão de luz. O volume de água adicionado à célula de fração está em um nível suficiente para alinhamento e supressão Pipeta 10 microlitros de suspensão de partículas na célula de fração.

Feche a porta do compartimento do analisador de tamanho de partículas. Em seguida, meça o tamanho das partículas para PLGA. Use um índice de refração de 1,60.

Use a interface do software para calcular o diâmetro da partícula usando uma base numérica um dia antes da injeção. Anestesiar o rato de acordo com um protocolo animal aprovado pelo iacuc. Avalie a profundidade da anestesia com um dedo do pé.

Testes de reflexo de pinça e monitore a respiração para garantir uma frequência respiratória de 100 a 120 respirações por minuto. Raspe o cabelo na base da cauda e no quarto traseiro. Remova o cabelo do lado ventral do animal e lateralmente ao redor do lado dorsal, logo acima da articulação da pata traseira.

Para cada injeção de corante, use uma micropipeta para transferir 10 microlitros de solução de corante para um tubo de fuga microcentral e aspire todos os 10 microlitros através de uma agulha de calibre 31 em uma seringa de insulina de um mililitro. Agora injete 10 microlitros de solução de corante por via subcutânea em cada lado da base da cauda para carregar entre as injeções. Aplique um creme depilatório suave para remover os pelos restantes.

Certifique-se de cobrir a área entre a pata traseira e o abdômen. Após três minutos, use uma mão enluvada molhada com H dois oh quentes e esfregue suavemente o creme depilatório na pele. Repita imediatamente para remover o excesso de depilatório.

Em seguida, molhe um pano macio ou toalha de papel com água morna e, em um único movimento, limpe a parte inferior do mouse. Coloque o mouse sob uma lâmpada de calor para se recuperar e depois volte a segurar por pelo menos 12 horas. Examine o camundongo anestesiado para confirmar a drenagem de traços ou corantes em cada linfonodo inguinal.

O linfonodo deve ser visível como uma mancha escura perto da coxa traseira e do abdômen. Agora ressuspenda novamente as partículas em água destilada na concentração de injeção desejada para cada injeção. Use uma micropipeta para transferir 10 microlitros de solução de partículas para um tubo de microcentrífuga.

Aspire todos os 10 microlitros em uma agulha de insulina de calibre 31 presa a uma seringa de um mililitro. Puxe a pele esticada ao redor do linfonodo tingido com a agulha em um ângulo de 90 graus em relação à pele. Penetre na pele a uma profundidade de um milímetro.

Injete lentamente todo o monitoramento de volume para aumento visível dos linfonodos. Permita que o mouse se recupere sob uma lâmpada de calor e, em seguida, volte a segurar ou realize testes adicionais. Primeiro, confirme a síntese de partículas e a distribuição de tamanho.

O protocolo de síntese de evaporação de solvente de emulsão pode ser avaliado qualitativamente por inspeção visual das emulsões finais. Gerado. As emulsões devem ser uma suspensão homogénea, isenta de agregados visíveis. A distribuição do tamanho das partículas da peça pode ser confirmada por difração a laser ou amostras de partículas de espalhamento dinâmico de luz devem exibir uma distribuição monomodal.

Uma avaliação qualitativa adicional da síntese de partículas pode ser obtida por meio da modificação do protocolo para incorporar uma ou mais cargas fluorescentes, como um peptídeo fluorescente ou corante lipofílico. O corante pode ser usado para localizar e direcionar o linfonodo para injeção de partículas Durante o treinamento, os camundongos podem ser sacrificados e necropsiados após a injeção de corante para se familiarizar com a localização dos linfonodos. A distribuição de partículas dentro das zonas de células T e B do linfonodo infectado é confirmada por microscopia confocal de linfonodos seccionados e corados.

Diferenças nas propriedades das partículas, como tamanho, podem ser observadas nos gânglios linfáticos após injeção e imagem por microscopia de fluorescência Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em dois dias. A síntese de partículas e a preparação dos animais ocorrem no primeiro dia. A caracterização da lavagem de partículas e a injeção intralinfonodo são realizadas no segundo dia.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como um traço ou corante pode ser usado para visualizar e injetar os gânglios linfáticos inguinais de camundongos. Essa técnica permite a entrega não cirúrgica de transportadores de vacinas de biomaterial diretamente ao linfonodo com o nível de controle que não era possível anteriormente. A entrega direta de biomateriais por linfonodos permitirá que cientistas e engenheiros e imunologia e desenvolvimento de vacinas explorem as interações fundamentais de biomateriais, vacinas e sinais imunológicos com o linfonodo, lançando uma nova luz sobre os mecanismos pelos quais esses materiais estimulam e moldam a imunidade.