Name: Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Aprenda a visualizar subdomínios do retículo endoplasmático em células cultivadas usando proteínas fluorescentes GFP e microscopia confocal. Este método revela dinâmica de proteínas e alterações estruturais em biologia celular.

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Os autores são gratos a Fondazione Filarete por sua ajuda e apoio na publicação deste artigo. Gostaríamos também de agradecer Centro Europeo di Nanomedicina para o uso do Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão.

1. Plasmídeo, cultura de células, e transfecção com ER fluorescentes Proteínas <ol><li> O plasmídeo utilizado no presente estudo consiste de uma versão melhorada de GFP fundida na sua extremidade C-terminal para a região da cauda da isoforma ER de rato do citocromo b (5) (abreviada aqui como B (5)), através de uma sequência ligante. A região de cauda contém toda a sequência (Pro94-Asp134) que permanece associada membrana após a clivagem de tripsina de nativo B (5), incluindo a DTM 17-resíduo (domínio transmembrana), flanqueado por sequências polares a montante e a jusante (UPS e DPS) . O ligante é constituído por o epitopo myc seguido por [(Gli) 4 Ser] 3, e todo o ADNc é inserido nos sítios Hind3-Xba1 do mamífero pCDNA3 vector de expressão. Os detalhes da construção deste plasmídeo foi descrito numa publicação anterior, em que é referido como a GFP-ER 16. </li><li> Crescer células COS-7 em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de fetal de soro de bovino, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, numa incubadora a 37 ° C e 10% de CO 2. </li><li> Transfecção. Placa de 3 x 10 5 células sobre uma lamela de vidro redondo de uma placa de 6 poços e, no dia seguinte, com o sistema de transfecção JetPEI como descrito pelo fabricante. Note-se que o rácio de JetPEI / ADN optimizada foi testada a fim de estabelecer a máxima eficiência de transfecção de acordo com o plasmídeo e linha celular utilizada: no nosso caso, uma JetPEI: proporção de ADN de 2:01 conduz a 70-80% de eficiência de transfecção. </li></ol> 2. Vivo Fluorescência Scanning microscopia confocal <ol><li> De imagem de células vivas. Coloque a lamela em que as células transfectadas foram semeadas numa câmara de cultura de células de aço de 24 mm lamelas cheios com DMEM w / o vermelho de fenol, suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% de pen / strep, 25 mM de HEPES , 50 ug / ml de cicloheximida e 1:100 OxyFluor para evitar as amostras de fotodegradação. Um microscop SP5 confocale equipado com uma incubadora de CO 2, com temperatura controlada (37 ° C e 5% de CO 2) é utilizado nas experiências de imagem de células vivas, com d GFP-ER ser visualizada usando um laser de 488 nm e um filtro 525/50 de passagem de banda de emissão. </li><li> Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP). Desenhar uma região de interesse (ROI), correspondente a uma estrutura OSER, e descora usando 20 iterações e uma combinação de 488 nm (100% de um laser de Árgon de 30 mW, correspondendo a 5.5-6 μW na amostra) e 405 nm (60% de 30 mW de diodo laser de 405, o que corresponde a 11,6 μW na amostra) lasers que, em nossa experiência, leva a fotodegradação rápida e eficiente. </li><li> Grave a recuperação de fluorescência nas ROIs branqueada, tomando um único quadro a cada 10 segundos por 10 minutos (tempo de pixel = 1,61 ms / px). </li><li> Perda de fluorescência na fotodegradação (FLIP). Desenhar um ROI correspondente a uma estrutura OSER, e lixívia, como descrito acima. O branqueamento é repetido a cada 30 seg,e as imagens pós-clareamento são registrados a cada 10 segundos por 30 minutos (tempo de pixel = 1,61 ms / px). </li><li> FRAP e análise FLIP. Todas as imagens são analisadas utilizando o software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). Nas experiências de FRAP, a recuperação de fluorescência do ROI branqueada é medida ao longo do tempo e normalizados para a fluorescência total de células branqueadas, que é sempre verificado para ser constante ao longo do tempo. </li><li> Para os experimentos FLIP, desenhar um ROI fora do OSER branqueada e abrangendo toda a célula. Medir a intensidade de fluorescência ao longo do tempo e normalizar os níveis de fluorescência de um ROI desenhados em uma célula não branqueada, a fim de corrigir qualquer diminuição na fluorescência provocada pela própria imagem. </li><li> Em todas as experiências, subtraído do sinal de fundo (determinado numa zona fora das células) a partir das intensidades de fluorescência das ROI. Finalmente, plotar os resultados usando GraphPad software Prism. </li></ol> 3. Ultraestrutural Análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão Dada a toxicidade de muitos dos reagentes, todos os procedimentos devem ser efectuados usando um laboratório adequado. casaco e luvas sob uma coifa. <ol><li> Depois de retirar a lamela do prato de Petri, fixar as restantes células cultivadas na parte inferior do prato como uma monocamada utilizando filtrada glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4, durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Raspar as células com um raspador de Teflon e transferi-los para tubos de 1,5 ml de Eppendorf. Agregar as células por meio de centrifugação a 9.000 g durante 10 min. Retirar o sobrenadante, adicionar fixador fresco, e deixar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar os sedimentos com o tampão, então pós-corrigir com uma solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato, durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe com água MilliQ, e em bloco mancha com1% acetato de uranila em água destilada por entre 20-60 min. </li><li> Desidratar as amostras em série crescente de etanol (70%, 80%, 90%, 100% e 100% durante 10 min cada), e lava-se rapidamente duas vezes em óxido de propileno (15 min cada). </li><li> Infiltrar as amostras em uma mistura de óxido de propileno + Epon (1:1) (a partir de 2 horas durante a noite). </li><li> Incorporar na resina epoxi Epon curada a 60 ° C durante pelo menos 24 horas. </li><li> Seção dos blocos de resina aparadas manualmente usando um ultramicrótomo LEICA UC6 equipado com um diamante faca de 45 ° para obtenção de cortes com espessura de 60-70 nm. Colete as seções 300 grades de cobre de malha. </li><li> Corar as secções sobre a grelha com uma solução saturada de acetato de uranilo (20 min) e citrato de chumbo (7 min), lavar as grades por imersão em água bi-destilada, filtrada, e deixar secar à temperatura ambiente. </li><li> As grades manchadas são observados usando um Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão, e as imagens foram captadas com uma bottcâmera CCD om-montado em diferentes ampliações finais (geralmente variando de 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os protocolos e abordagens de imagem descritos neste trabalho foram utilizados para investigar a distribuição e mobilidade das proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes no ER de células vivas. Analisamos também o efeito da expressão sobre-destas proteínas na arquitetura deste compartimento subcelular por meio de análises ultra-estruturais. A combinação de células vivas de imagem confocal e microscopia eletrônica representa é um poderoso meio de investigar as propriedades dinâmicas ...

A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes espectrais, eo desenvolvimento paralelo de microscopia de fluorescência, abriram totalmente novos caminhos para a investigação do comportamento de proteínas nas células. Técnicas como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP), que é possível por causa da capacidade intrínseca de fluoróforos para extinguir a fluorescência, sob iluminação intensa, são baseados em imagens ao vivo de células confocal e o uso de transf As proteínas de fusão fluorescentes 1-3. Eles são amplamente utilizados para avaliar não só a localização de proteínas, mas também a sua mobilidade e transporte vesicular, o que pode revelar pistas importantes sobre a sua função 4. A característica única de células eucarióticas é a presença de compartimentos intracelulares que têm composições de lípidos e de proteínas específicas. Embora organelas são fisicamente isolaed, eles precisam de se comunicar uns com os outros e partes componentes moleculares a fim de manter a homeostase celular. A via secretora garante que as proteínas e lípidos sintetizados no ER chegar ao destino final correcta em que exercem a sua função. Organelas intracelulares também pode ser conectado por sites de contacto dinâmicos que permitem que as moléculas (lipídios) a serem trocadas diretamente entre os compartimentos. Além disso, muitas proteínas têm de montados em grandes complexos heteroméricos ou associada com as espécies de lípidos específicos (jangadas lipídicas / microdomínios), a fim de se tornar funcionalmente activa ou pode ser transportado para o seu destino final. Todos estes aspectos biológicos influenciam grandemente as propriedades cinéticas das proteínas, e podem, portanto, ser adequadamente investigada por meio das técnicas descritas a seguir. Nosso grupo tem utilizado FRAP e FLIP combinado com microscopia eletrônica, a fim de estudar a arquitetura do ER e seus diferentes subdomínios. O ER é a primeira estação da via secretora e desempenha um papel chave na proteína e lípido de classificação 5. É uma organela altamente dinâmico cujos subdomínios distintos refletem suas muitas funções diferentes (ou seja, proteínas e biossíntese de lipídios e de tráfico, dobradura de proteínas, Ca 2 + armazenamento e liberação, e do metabolismo de xenobióticos). No entanto, embora sejam morfologicamente, espacialmente e funcionalmente distinto, estes domínios são contínuas umas com as outras, e a sua abundância relativa pode ser modificado em células em condições fisiológicas e patológicas. O mais conhecido e domínios geralmente espacialmente segregadas do ER são o envelope nuclear, eo RE liso e áspero, no entanto, nós e outros demonstraram que há estruturas de ER, com uma arquitetura mais elaborada e organização tridimensional em vários tipos de células e tecidos sob condições fisiológicas que podem ser induzidas por meio de estímulos de stress, tais como a hipoxia, a drogaadministração, ou a sobre-expressão de proteínas de transmembrana ER residente 2,6 (e suas referências). Também se demonstrou recentemente a presença de tais estruturas em modelos celulares de doenças humanas 1,7. Originário da cisternas empilhadas de RE liso, eles receberam o nome coletivo de organizado retículo endoplasmático liso (OSER), em 2003, 6, embora eles também são conhecidos como karmellae, lamelas e cristalóide ER com base em sua arquitetura que, como seu tamanho, pode variar. Depois as células são transfectadas com GFP fundida com a região citosólica de proteínas de ER-residente (TA) (d EGFP-ER) ancorada-cauda, ​​a tendência fracamente dimerização de GFP em trans altera drasticamente a organização e estrutura do ER. FRAP e FLIP experimentos mostraram que d EGFP-ER é livre para difundir dentro OSERs, eo fato de que ela se move a partir da ER reticular ao OSER e vice-versa &lt;/ Em&gt; indica que os agregados são contínuas com o ER reticular circundante. Análise ultraestrutural nos permitiu correlacionar os dados de fluorescência com uma descrição detalhada da arquitetura OSER e organização em escala nanométrica: OSERs são sempre composta de pilhas de cisternas emparelhado de RE liso, mas pode ter diferentes formas de organização espacial, como regularmente organizadas sinusoidal arrays ou espirais, ou hexagonais &quot;cristalóides&quot; matrizes tubulares. Estes rearranjos levar a morfologias cúbicos 8 que, como eles foram encontrados em células em condições fisiológicas e 9 seguintes stress como a hipóxia 10, o tratamento de droga 11, e cancro 9, podem ter um potencial significativo como marcadores de ultra-estruturais. Após esta primeira demonstração utilizando proteínas de fusão de GFP, foram utilizadas experiências de imagiologia para analisar a proliferação de domínios de ER, em resposta aos tratamentos farmacológicos 12, assess a tendência de proteínas fluorescentes para oligomerise nas células 13, e para investigar o papel de um mutante, proteína TA ALS-linked na formação de agregados intracelulares de origem ER que podem ser relevantes para a sua patogenicidade a 1,8. Tem sido sugerido que a formação de agregados intracelulares (que ocorre em muitas doenças neurodegenerativas, 14) pode ser um mecanismo de protecção concebido para evitar que as interacções entre proteínas mutantes tóxicos e os componentes celulares circundantes 15. O que se segue é uma descrição de uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica para investigar construções cujo C-terminal domínios hidrofóbicos são inseridos na membrana do ER, e uma análise de seu comportamento dinâmico e os efeitos de sua sobre-expressão no domínio ER Arquitectura em células em cultura (ver Figura 1 para um fluxograma do protocolo experimental).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (DMEM) sem vermelho de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM solução</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfecção</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído Grau I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de Sódio Trihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio 4% solução</td><td>Microscopia Eletrônica Ciência</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranila Di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de Propileno</td><td>Sigma-Aldrich ligeiramente radioativo</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON kit de meio de incorporação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr> <tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de<td>Citrato de Chumbo </td> Ciência <td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Espectral </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Sistema de Incubação de Gaiola de Microscópio </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Faca de diamante </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico </td><td>de Transmissão FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de célula de cultura de aço para lamínula de 24 mm</td> Ferramentas de <td>Biociência</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Grades de Microscopia Eletrônica</td><td>Ciência de Microscopia Eletrônica</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização do retículo endoplasmático subdomains em células cultivadas

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Os lípidos e proteínas em células eucarióticas são continuamente trocadas entre compartimentos celulares, embora estas mantêm a sua composição distinta e funções apesar do tráfego intenso interorganelle molecular. As técnicas descritas neste documento são poderosos meios de estudar proteínas e lipídios e mobilidade tráfico in vivo e em seu ambiente fisiológico. Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP) são amplamente usadas técnicas de imagem em células vivas, para estudar o tráfico intracelular através da via endocítica-exo, a continuidade entre a organelos ou subcompartimentos, a formação de complexos de proteína, e proteína de localização em microdomínios lipídicos, todos os quais podem ser observados sob condições fisiológicas e patológicas. As limitações destas abordagens são principalmente devidos à utilização de proteínas de fusão fluorescentes, e as suas desvantagens potenciais incluem artefatual sobre-expressoíon nas células ea possibilidade de diferenças na dobradura e localização de proteínas marcadas e nativas. Finalmente, como o limite de resolução do microscópio óptico (cerca de 200 nm) não permite a investigação da estrutura fina do ER ou os subcompartimentos específicos que podem se originar nas células sob estresse (ie hipóxia, a administração da droga, a expressão excessiva de transmembrana proteínas residentes ER) ou em condições patológicas, combinamos de imagem de células vivas de células transfectadas cultivadas com ultraestrutural análises baseadas em microscopia eletrônica de transmissão.

A Figura 2 mostra um estudo FRAP exemplo de mobilidade da proteína. A mobilidade da proteína d EGFP-ER é demonstrado pela recuperação de fluorescência após a fotodegradação rápida em OSERs branqueadas. Para a análise quantitativa, a meia hora e fração móvel foram obtidos a partir de dados medidos experimentalmente ajustando a seguinte equação monoexponencial: F (t) = F pós + (F rec-F post) (1-e-t / τ) <p class="jove_cont...

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar como as proteínas fluorescentes transfectadas são distribuídas e se movem no retículo endoplasmatico e avaliar o efeito da expressão na arquitetura ultraestrutural. Para isso, células em cultura são transfectadas temporariamente com proteínas residentes no retículo endoplasmático ancoradas pela cauda e marcadas com GFP. Após a transfeção, realiza-se imagem confocal em células vivas para avaliar a recuperação da fluorescência após fotobranqueamento ou FRAP e a perda de fluorescência.No fotobranqueamento ou flip, a análise ultraestrutural é realizada utilizando microscopia eletrônica de transmissão. Os dados resultantes demonstram que a expressão do construto B cinco marcado com GFP altera drasticamente a organização e a estrutura do retículo endoplasmatico, induzindo a formação de agregados. O método que demonstramos aqui pode fornecer informações sobre processos básicos de biologia celular, como mobilidade e tráfego de proteínas e lipídios.Também pode ser utilizado para estudar respostas a tratamentos farmacológicos, a fim de avaliar proteínas fluorescentes, modernização de oligos, ou para investigar o papel de proteínas mutante

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido...

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.

Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

O presente protocolo descreve um método de imunomarcação de uma proteína nas seções do tecido cardíaco usando pontos quânticos. Esta técnica fornece uma ferramenta útil para visualizar a localização e expressão subcelular de qualquer proteína no nível ultraestrutural.

Visualizando a Localização Subcelular de uma Proteína no Coração usando Imunomarcação Mediada por Pontos Quânticos seguida de Microscopia Eletrônica de Transmissão

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Determinar o número de células em cultura é importante na normalização das condições de cultivo e na realização de experimentos de quantificação precisa. Neste vídeo, demonstramos como as células são contadas usando um hemocitômetro.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Aprenda a visualizar subdomínios do retículo endoplasmático em células cultivadas usando proteínas fluorescentes GFP e microscopia confocal. Este método revela dinâmica de proteínas e alterações estruturais em biologia celular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

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