Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar como as proteínas fluorescentes transfectadas são distribuídas e se movem no retículo endoplasmático e avaliar o efeito da expressão na arquitetura ultraestrutural. Para fazer isso, as células cultivadas são transfectadas transitoriamente com proteínas residentes no ER ancoradas na cauda marcada com GFP. Após a transfecção, a imagem confocal de células vivas é realizada para avaliar a recuperação de fluorescência após fotobranqueamento ou frap e perda de fluorescência.

No fotobranqueamento ou flip, a análise ultraestrutural é realizada usando microscopia eletrônica de transmissão. Os dados resultantes demonstram que a expressão da construção B cinco marcada com GFP altera drasticamente a organização e a estrutura do retículo endoplasmático, induzindo a formação de agregados. O método que demonstramos aqui pode fornecer informações sobre os processos básicos de biologia celular, como mobilidade e tráfego de proteínas e lipídios.

Também pode ser usado para estudar respostas a tratamentos farmacológicos para avaliar proteínas fluorescentes, oligomodernização, ou para estudar o papel de proteínas mutantes patogênicas na formação de agregados intracelulares de origem que podem ser relevantes para sua patogenicidade, como na esclerose lateral atrófica. O plasmídeo usado neste estudo consiste em uma versão aprimorada de GFP fundida em seu terminal C à região da cauda do er, isoforma do citocromo B cinco de rato por meio de uma sequência de ligantes. A região da cauda de B cinco contém toda a sequência que permanece associada à membrana após a clivagem por tripsina.

Isso inclui o domínio transmembrana de 17 resíduos, flanqueado por sequências polares a montante e a jusante. O ligante consiste no epítopo M seguido por GLY quatro S3. Todo o CDNA é inserido no hindi três XO um locais do vetor de expressão de mamíferos PC DNA três. Em preparação para a transfecção, o crescimento custou sete células em DMEM suplementado a 37 graus Celsius e 5% de CO2 no dia anterior à placa de transfecção três vezes 10 para as quintas células em lamínulas de vidro redondas de 24 milímetros em uma placa de seis poços no dia seguinte.

Transfect as células com o sistema jet PEI conforme descrito pelo fabricante aqui, é usado um jato, proporção PEI para DNA de dois para um. Isso normalmente leva a uma eficiência de transfecção de 70 a 80%Mantenha as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 24 horas antes da imagem. Em seguida, use uma pinça para transferir uma lamínula com células transfectadas para a câmara de imagem.

Retorne a placa de cultura de tecidos para a incubadora para salvar as células restantes. Para análise ultra estrutural por microscopia eletrônica. Para imagens de células vivas, adicione dois mililitros de meio de imagem a uma câmara de cultura de células de aço.

Xi Fluor está incluído no meio de imagem para evitar que as amostras sejam fotobranqueadas. Os experimentos devem ser realizados na presença de smide, um inibidor da tradução, para evitar qualquer aumento no sinal de fluorescência A e, conseqüentemente, na fluorescência total devido à proteína. Biossíntese. Coloque a câmara de imagem no palco de um microscópio confocal, equipado com uma incubadora de CO2 com temperatura controlada e lasers apropriados com configurações apropriadas de fotomultiplicador para realizar a recuperação de fluorescência.

Depois que o fotobranqueamento ou o fracking colocar as células em foco, defina os parâmetros de aquisição para evitar a saturação de pixels. Certifique-se também de que a potência do laser esteja definida o mais baixo possível para evitar o branqueamento da foto devido à aquisição de imagens. Depois que os parâmetros de imagem forem definidos, vá para um novo campo de visão com duas ou mais células.

Uma célula em cada campo de aquisição deve permanecer não branqueada, para que possa ser usada para normalizar o sinal fluorescente da célula ou células branqueadas. Para branqueamento. Desenhe uma região de interesse ou ROI correspondente a um retículo endoplasmático liso organizado ou OSER.

Defina o programa de imagem para branquear usando um número adequado de iterações para um branqueamento fotográfico eficiente e rápido Se necessário, uma combinação de lasers de 488 nanômetros e 405 nanômetros pode ser usada. Instrua o software a capturar um único quadro a cada 10 segundos por 10 minutos durante todo o curso do experimento. Isso inclui os períodos de preble, alvejante e recuperação.

Depois que tudo estiver definido, inicie o branqueamento e a captura. Quando a captura estiver concluída, vá para um novo campo de visão e repita esse processo. Capture de quatro a cinco campos de visão para cada capa.

Deslize ao lado para medir a perda fluorescente no branqueamento de fotos ou vire. Instrua o programa a realizar uma sequência de imagens de branqueamento e pós-branqueamento por 10 segundos a cada 30 segundos por 10 minutos, mover para um novo campo de visão. Desenhe um ROI correspondente a uma estrutura OSER e inicie o branqueamento e a captura como antes para análise.

Importe as imagens frap e flip para o software Image J. Primeiro, avalie a recuperação de fluorescência da ROI branqueada ao longo do tempo para os experimentos de fracking e, em seguida, determine a fluorescência de fundo selecionando uma área fora das células e meça sua intensidade média ao longo do tempo. Em seguida, subtraia o sinal de fundo das intensidades fluorescentes das ROIs.

Normalize os dados para a fluorescência total da célula branqueada, que deve ser constante ao longo do tempo. Em seguida, ajuste a equação exponencial mono mostrada aqui, onde o pós F é o sinal fluorescente após o branqueamento da foto. F rec é o valor máximo de recuperação de fluorescência atingido após o branqueamento T é o tempo final de registro e tau é o tempo médio de registro.

Para análise dos experimentos de flip, desenhe um ROI fora do OSER branqueado, cobrindo toda a célula e meça sua intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Quanto aos experimentos de fracking, subtraia o fundo usando uma área fora das células. Normalize os dados para os níveis de fluorescência de uma ROI desenhada em uma célula não branqueada para corrigir qualquer diminuição na fluorescência causada pela própria imagem.

Por fim, plote os resultados usando o prisma GraphPad ou software similar. Muitos dos reagentes usados na preparação das amostras para eletromicroscopia são tóxicos. Portanto, as etapas a seguir devem ser realizadas usando jaleco e luvas enquanto trabalha sob uma hotte.

Depois de remover a lamínula da placa de Petri para microscopia óptica, fixe as células restantes cultivadas no fundo da placa como uma monocamada por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, usando um raspador de Teflon, separe as células e transfira-as para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e pulverize as células por centrifugação a 9.000 vezes G por 10 minutos após a centrifugação. Remova o sobrenadante, adicione um novo fixador e deixe durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Lave os pellets aspirando suavemente o fixador com uma pipeta passada e adicionando tampão cate. Para evitar perturbar o pellet, deixe o tampão escorrer pela parede lateral do tubo à medida que é adicionado. Aspire a solução de lavagem e pós-correção adicionando células em uma solução de tetróxido de ósmio a 1% em Cate Buffer por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, enxágue com água Milli Q e adicione acetato de mictório a 1% em água destilada diretamente no tubo da microcentrífuga. Desbloqueie a mancha por 20 minutos a uma hora, desidrate as amostras em uma série crescente de etanol de 70%80%90%100%e 100%novamente por 10 minutos cada. Em seguida, lave os pellets duas vezes em óxido de propileno por 15 minutos de cada vez.

Infiltrar as amostras substituindo o óxido de propileno pela mistura de óxido de propileno e incubar epon durante pelo menos duas horas e durante a noite. Em seguida, para incorporar as amostras, coloque os fragmentos de pellets celulares em moldes de incorporação que são pré-preenchidos com resina epóxi epon cura a 60 graus Celsius por pelo menos 24 horas. No dia seguinte, monte o bloco de resina em um ultra micrótomo equipado com uma faca de diamante de 45 graus.

Usando uma faca de corte, apare manualmente os blocos de resina para remover as partes do bloco de resina nas quais a amostra incorporada não está presente. Em seguida, usando o ultramicrótomo, obtenha seções de 60 a 70 nanômetros. Colete as seções em grades de cobre de 300 mesh para manchar as seções.

Coloque as grades em gotas de 30 microlitros de uma solução saturada de mictório, acetato e incube por 20 minutos. Em seguida, enxágue três vezes em água mili Q e incube as grades novamente em pequenas gotas de citrato de chumbo por sete minutos. Após a incubação, lave bem as grades mergulhando-as em água mili Q e deixe-as secar em temperatura ambiente.

Observe as grades coradas usando um microscópio eletrônico de transmissão e capture imagens usando uma câmera CCD montada na parte inferior na ampliação final, variando de 6.000 a 39.000 x para investigar a difusão lateral do D-E-G-F-P ER em retículo endoplasmático liso e organizado. Transfectado transitoriamente causou sete células de três lamínulas foram analisadas por frap conforme descrito neste vídeo, conforme mostrado nesta sequência de lapso de tempo, duas estruturas OSER foram branqueadas e a recuperação de fluorescência foi registrada ao longo do tempo. A recuperação de fluorescência clara foi detectada um minuto após o clareamento com um aumento adicional no sinal quatro minutos depois para determinar o intervalo de recuperação e quantificar a fração móvel de D-E-G-F-P-E-R.

As imagens captadas foram analisadas conforme descrito neste vídeo como pode ser visto aqui. A intensidade fluorescente da área branqueada aumentou ao longo do tempo, demonstrando que a proteína fluorescente é altamente móvel dentro dos agregados. Para estudar a continuidade entre os diferentes subdomínios do retículo endoplasmático, foram realizados experimentos de inversão conforme mostrado nesta sequência de lapso de tempo.

O branqueamento contínuo de um OSER indicado aqui pela seta amarela causa uma diminuição progressiva da fluorescência no resto do RE e em outras estruturas OSER dentro da mesma célula. A seta vermelha indica uma parte de uma célula não branqueada na qual o sinal fluorescente é constante ao longo do tempo. A análise quantitativa desses dados revelou um esvaziamento progressivo e rápido do RE reticular, demonstrando que os agregados estão fisicamente conectados com o resto do RE Para examinar a arquitetura fina desses agregados, células que expressam altos níveis de D-E-G-F-P ER foram observadas usando um microscópio eletrônico de transmissão.

Esta micrografia mostra uma visão de baixa ampliação do citoplasma celular contendo um agregado de membranas. O agregado consiste em pilha cyi e membranas senoidais onduladas. Como pode ser visto aqui.

As mitocôndrias podem ser vistas agrupadas em torno das estruturas OSER, enquanto os ribossomos indicados pelas pontas das setas decoram apenas as membranas dos cyi mais externos. Observe que o espaço denso de elétrons de 11 nanômetros de espessura entre as membranas é contínuo com o citoplasma. Um OS ER pode ser formado por er lamelar, que são pilhas de er cyi achatadas que podem ser contínuas ou fragmentadas em sua aparência em seções finas, vesículas, brotamento da cisterna mais externa da pilha podem ocasionalmente ser observadas como mostrado aqui.

Tomados em conjunto, esses dados demonstram que os agregados fluorescentes observados em células cultivadas transfectadas com D-E-G-F-P ER representam manchas de er steri lisas e achatadas que se organizam espacialmente em geometrias 3D bem definidas. Ao obter este procedimento, é importante lembrar de adquirir todas as imagens sem pixels saturados, o que pode alterar a recuperação fluorescente e, consequentemente, a análise da mobilidade proteica. Certifique-se sempre de normalizar o sinal fluorescente no bleach, a região de interesse para a fluorescência total da mesma célula, a fim de considerar as variações de intensidade de fluorescência devido ao branqueamento durante a aquisição da imagem ou pequenas mudanças no plano de foco.