Name: Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Aprenda a visualizar subdomínios do retículo endoplasmático em células cultivadas usando proteínas fluorescentes GFP e microscopia confocal. Este método revela dinâmica de proteínas e alterações estruturais em biologia celular.

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Os autores são gratos a Fondazione Filarete por sua ajuda e apoio na publicação deste artigo. Gostaríamos também de agradecer Centro Europeo di Nanomedicina para o uso do Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão.

1. Plasmídeo, cultura de células, e transfecção com ER fluorescentes Proteínas <ol><li> O plasmídeo utilizado no presente estudo consiste de uma versão melhorada de GFP fundida na sua extremidade C-terminal para a região da cauda da isoforma ER de rato do citocromo b (5) (abreviada aqui como B (5)), através de uma sequência ligante. A região de cauda contém toda a sequência (Pro94-Asp134) que permanece associada membrana após a clivagem de tripsina de nativo B (5), incluindo a DTM 17-resíduo (domínio transmembrana), flanqueado por sequências polares a montante e a jusante (UPS e DPS) . O ligante é constituído por o epitopo myc seguido por [(Gli) 4 Ser] 3, e todo o ADNc é inserido nos sítios Hind3-Xba1 do mamífero pCDNA3 vector de expressão. Os detalhes da construção deste plasmídeo foi descrito numa publicação anterior, em que é referido como a GFP-ER 16. </li><li> Crescer células COS-7 em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de fetal de soro de bovino, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, numa incubadora a 37 ° C e 10% de CO 2. </li><li> Transfecção. Placa de 3 x 10 5 células sobre uma lamela de vidro redondo de uma placa de 6 poços e, no dia seguinte, com o sistema de transfecção JetPEI como descrito pelo fabricante. Note-se que o rácio de JetPEI / ADN optimizada foi testada a fim de estabelecer a máxima eficiência de transfecção de acordo com o plasmídeo e linha celular utilizada: no nosso caso, uma JetPEI: proporção de ADN de 2:01 conduz a 70-80% de eficiência de transfecção. </li></ol> 2. Vivo Fluorescência Scanning microscopia confocal <ol><li> De imagem de células vivas. Coloque a lamela em que as células transfectadas foram semeadas numa câmara de cultura de células de aço de 24 mm lamelas cheios com DMEM w / o vermelho de fenol, suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% de pen / strep, 25 mM de HEPES , 50 ug / ml de cicloheximida e 1:100 OxyFluor para evitar as amostras de fotodegradação. Um microscop SP5 confocale equipado com uma incubadora de CO 2, com temperatura controlada (37 ° C e 5% de CO 2) é utilizado nas experiências de imagem de células vivas, com d GFP-ER ser visualizada usando um laser de 488 nm e um filtro 525/50 de passagem de banda de emissão. </li><li> Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP). Desenhar uma região de interesse (ROI), correspondente a uma estrutura OSER, e descora usando 20 iterações e uma combinação de 488 nm (100% de um laser de Árgon de 30 mW, correspondendo a 5.5-6 μW na amostra) e 405 nm (60% de 30 mW de diodo laser de 405, o que corresponde a 11,6 μW na amostra) lasers que, em nossa experiência, leva a fotodegradação rápida e eficiente. </li><li> Grave a recuperação de fluorescência nas ROIs branqueada, tomando um único quadro a cada 10 segundos por 10 minutos (tempo de pixel = 1,61 ms / px). </li><li> Perda de fluorescência na fotodegradação (FLIP). Desenhar um ROI correspondente a uma estrutura OSER, e lixívia, como descrito acima. O branqueamento é repetido a cada 30 seg,e as imagens pós-clareamento são registrados a cada 10 segundos por 30 minutos (tempo de pixel = 1,61 ms / px). </li><li> FRAP e análise FLIP. Todas as imagens são analisadas utilizando o software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). Nas experiências de FRAP, a recuperação de fluorescência do ROI branqueada é medida ao longo do tempo e normalizados para a fluorescência total de células branqueadas, que é sempre verificado para ser constante ao longo do tempo. </li><li> Para os experimentos FLIP, desenhar um ROI fora do OSER branqueada e abrangendo toda a célula. Medir a intensidade de fluorescência ao longo do tempo e normalizar os níveis de fluorescência de um ROI desenhados em uma célula não branqueada, a fim de corrigir qualquer diminuição na fluorescência provocada pela própria imagem. </li><li> Em todas as experiências, subtraído do sinal de fundo (determinado numa zona fora das células) a partir das intensidades de fluorescência das ROI. Finalmente, plotar os resultados usando GraphPad software Prism. </li></ol> 3. Ultraestrutural Análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão Dada a toxicidade de muitos dos reagentes, todos os procedimentos devem ser efectuados usando um laboratório adequado. casaco e luvas sob uma coifa. <ol><li> Depois de retirar a lamela do prato de Petri, fixar as restantes células cultivadas na parte inferior do prato como uma monocamada utilizando filtrada glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4, durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Raspar as células com um raspador de Teflon e transferi-los para tubos de 1,5 ml de Eppendorf. Agregar as células por meio de centrifugação a 9.000 g durante 10 min. Retirar o sobrenadante, adicionar fixador fresco, e deixar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar os sedimentos com o tampão, então pós-corrigir com uma solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato, durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe com água MilliQ, e em bloco mancha com1% acetato de uranila em água destilada por entre 20-60 min. </li><li> Desidratar as amostras em série crescente de etanol (70%, 80%, 90%, 100% e 100% durante 10 min cada), e lava-se rapidamente duas vezes em óxido de propileno (15 min cada). </li><li> Infiltrar as amostras em uma mistura de óxido de propileno + Epon (1:1) (a partir de 2 horas durante a noite). </li><li> Incorporar na resina epoxi Epon curada a 60 ° C durante pelo menos 24 horas. </li><li> Seção dos blocos de resina aparadas manualmente usando um ultramicrótomo LEICA UC6 equipado com um diamante faca de 45 ° para obtenção de cortes com espessura de 60-70 nm. Colete as seções 300 grades de cobre de malha. </li><li> Corar as secções sobre a grelha com uma solução saturada de acetato de uranilo (20 min) e citrato de chumbo (7 min), lavar as grades por imersão em água bi-destilada, filtrada, e deixar secar à temperatura ambiente. </li><li> As grades manchadas são observados usando um Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão, e as imagens foram captadas com uma bottcâmera CCD om-montado em diferentes ampliações finais (geralmente variando de 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os protocolos e abordagens de imagem descritos neste trabalho foram utilizados para investigar a distribuição e mobilidade das proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes no ER de células vivas. Analisamos também o efeito da expressão sobre-destas proteínas na arquitetura deste compartimento subcelular por meio de análises ultra-estruturais. A combinação de células vivas de imagem confocal e microscopia eletrônica representa é um poderoso meio de investigar as propriedades dinâmicas ...

A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes espectrais, eo desenvolvimento paralelo de microscopia de fluorescência, abriram totalmente novos caminhos para a investigação do comportamento de proteínas nas células. Técnicas como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP), que é possível por causa da capacidade intrínseca de fluoróforos para extinguir a fluorescência, sob iluminação intensa, são baseados em imagens ao vivo de células confocal e o uso de transf As proteínas de fusão fluorescentes 1-3. Eles são amplamente utilizados para avaliar não só a localização de proteínas, mas também a sua mobilidade e transporte vesicular, o que pode revelar pistas importantes sobre a sua função 4. A característica única de células eucarióticas é a presença de compartimentos intracelulares que têm composições de lípidos e de proteínas específicas. Embora organelas são fisicamente isolaed, eles precisam de se comunicar uns com os outros e partes componentes moleculares a fim de manter a homeostase celular. A via secretora garante que as proteínas e lípidos sintetizados no ER chegar ao destino final correcta em que exercem a sua função. Organelas intracelulares também pode ser conectado por sites de contacto dinâmicos que permitem que as moléculas (lipídios) a serem trocadas diretamente entre os compartimentos. Além disso, muitas proteínas têm de montados em grandes complexos heteroméricos ou associada com as espécies de lípidos específicos (jangadas lipídicas / microdomínios), a fim de se tornar funcionalmente activa ou pode ser transportado para o seu destino final. Todos estes aspectos biológicos influenciam grandemente as propriedades cinéticas das proteínas, e podem, portanto, ser adequadamente investigada por meio das técnicas descritas a seguir. Nosso grupo tem utilizado FRAP e FLIP combinado com microscopia eletrônica, a fim de estudar a arquitetura do ER e seus diferentes subdomínios. O ER é a primeira estação da via secretora e desempenha um papel chave na proteína e lípido de classificação 5. É uma organela altamente dinâmico cujos subdomínios distintos refletem suas muitas funções diferentes (ou seja, proteínas e biossíntese de lipídios e de tráfico, dobradura de proteínas, Ca 2 + armazenamento e liberação, e do metabolismo de xenobióticos). No entanto, embora sejam morfologicamente, espacialmente e funcionalmente distinto, estes domínios são contínuas umas com as outras, e a sua abundância relativa pode ser modificado em células em condições fisiológicas e patológicas. O mais conhecido e domínios geralmente espacialmente segregadas do ER são o envelope nuclear, eo RE liso e áspero, no entanto, nós e outros demonstraram que há estruturas de ER, com uma arquitetura mais elaborada e organização tridimensional em vários tipos de células e tecidos sob condições fisiológicas que podem ser induzidas por meio de estímulos de stress, tais como a hipoxia, a drogaadministração, ou a sobre-expressão de proteínas de transmembrana ER residente 2,6 (e suas referências). Também se demonstrou recentemente a presença de tais estruturas em modelos celulares de doenças humanas 1,7. Originário da cisternas empilhadas de RE liso, eles receberam o nome coletivo de organizado retículo endoplasmático liso (OSER), em 2003, 6, embora eles também são conhecidos como karmellae, lamelas e cristalóide ER com base em sua arquitetura que, como seu tamanho, pode variar. Depois as células são transfectadas com GFP fundida com a região citosólica de proteínas de ER-residente (TA) (d EGFP-ER) ancorada-cauda, ​​a tendência fracamente dimerização de GFP em trans altera drasticamente a organização e estrutura do ER. FRAP e FLIP experimentos mostraram que d EGFP-ER é livre para difundir dentro OSERs, eo fato de que ela se move a partir da ER reticular ao OSER e vice-versa &lt;/ Em&gt; indica que os agregados são contínuas com o ER reticular circundante. Análise ultraestrutural nos permitiu correlacionar os dados de fluorescência com uma descrição detalhada da arquitetura OSER e organização em escala nanométrica: OSERs são sempre composta de pilhas de cisternas emparelhado de RE liso, mas pode ter diferentes formas de organização espacial, como regularmente organizadas sinusoidal arrays ou espirais, ou hexagonais &quot;cristalóides&quot; matrizes tubulares. Estes rearranjos levar a morfologias cúbicos 8 que, como eles foram encontrados em células em condições fisiológicas e 9 seguintes stress como a hipóxia 10, o tratamento de droga 11, e cancro 9, podem ter um potencial significativo como marcadores de ultra-estruturais. Após esta primeira demonstração utilizando proteínas de fusão de GFP, foram utilizadas experiências de imagiologia para analisar a proliferação de domínios de ER, em resposta aos tratamentos farmacológicos 12, assess a tendência de proteínas fluorescentes para oligomerise nas células 13, e para investigar o papel de um mutante, proteína TA ALS-linked na formação de agregados intracelulares de origem ER que podem ser relevantes para a sua patogenicidade a 1,8. Tem sido sugerido que a formação de agregados intracelulares (que ocorre em muitas doenças neurodegenerativas, 14) pode ser um mecanismo de protecção concebido para evitar que as interacções entre proteínas mutantes tóxicos e os componentes celulares circundantes 15. O que se segue é uma descrição de uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica para investigar construções cujo C-terminal domínios hidrofóbicos são inseridos na membrana do ER, e uma análise de seu comportamento dinâmico e os efeitos de sua sobre-expressão no domínio ER Arquitectura em células em cultura (ver Figura 1 para um fluxograma do protocolo experimental).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (DMEM) sem vermelho de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM solução</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfecção</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído Grau I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de Sódio Trihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio 4% solução</td><td>Microscopia Eletrônica Ciência</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranila Di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de Propileno</td><td>Sigma-Aldrich ligeiramente radioativo</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>EPON kit de meio de incorporação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr> <tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de<td>Citrato de Chumbo </td> Ciência <td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal Espectral </td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Sistema de Incubação de Gaiola de Microscópio </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Faca de diamante </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 &deg;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico </td><td>de Transmissão FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de célula de cultura de aço para lamínula de 24 mm</td> Ferramentas de <td>Biociência</td><td>CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Grades de Microscopia Eletrônica</td><td>Ciência de Microscopia Eletrônica</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização do retículo endoplasmático subdomains em células cultivadas

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Os lípidos e proteínas em células eucarióticas são continuamente trocadas entre compartimentos celulares, embora estas mantêm a sua composição distinta e funções apesar do tráfego intenso interorganelle molecular. As técnicas descritas neste documento são poderosos meios de estudar proteínas e lipídios e mobilidade tráfico in vivo e em seu ambiente fisiológico. Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP) são amplamente usadas técnicas de imagem em células vivas, para estudar o tráfico intracelular através da via endocítica-exo, a continuidade entre a organelos ou subcompartimentos, a formação de complexos de proteína, e proteína de localização em microdomínios lipídicos, todos os quais podem ser observados sob condições fisiológicas e patológicas. As limitações destas abordagens são principalmente devidos à utilização de proteínas de fusão fluorescentes, e as suas desvantagens potenciais incluem artefatual sobre-expressoíon nas células ea possibilidade de diferenças na dobradura e localização de proteínas marcadas e nativas. Finalmente, como o limite de resolução do microscópio óptico (cerca de 200 nm) não permite a investigação da estrutura fina do ER ou os subcompartimentos específicos que podem se originar nas células sob estresse (ie hipóxia, a administração da droga, a expressão excessiva de transmembrana proteínas residentes ER) ou em condições patológicas, combinamos de imagem de células vivas de células transfectadas cultivadas com ultraestrutural análises baseadas em microscopia eletrônica de transmissão.

A Figura 2 mostra um estudo FRAP exemplo de mobilidade da proteína. A mobilidade da proteína d EGFP-ER é demonstrado pela recuperação de fluorescência após a fotodegradação rápida em OSERs branqueadas. Para a análise quantitativa, a meia hora e fração móvel foram obtidos a partir de dados medidos experimentalmente ajustando a seguinte equação monoexponencial: F (t) = F pós + (F rec-F post) (1-e-t / τ) <p class="jove_cont...

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar como as proteínas fluorescentes transfectadas são distribuídas e se movem no retículo endoplasmatico e avaliar o efeito da expressão na arquitetura ultraestrutural. Para isso, células em cultura são transfectadas temporariamente com proteínas residentes no retículo endoplasmático ancoradas pela cauda e marcadas com GFP. Após a transfeção, realiza-se imagem confocal em células vivas para avaliar a recuperação da fluorescência após fotobranqueamento ou FRAP e a perda de fluorescência.No fotobranqueamento ou flip, a análise ultraestrutural é realizada utilizando microscopia eletrônica de transmissão. Os dados resultantes demonstram que a expressão do construto B cinco marcado com GFP altera drasticamente a organização e a estrutura do retículo endoplasmatico, induzindo a formação de agregados. O método que demonstramos aqui pode fornecer informações sobre processos básicos de biologia celular, como mobilidade e tráfego de proteínas e lipídios.Também pode ser utilizado para estudar respostas a tratamentos farmacológicos, a fim de avaliar proteínas fluorescentes, modernização de oligos, ou para investigar o papel de proteínas mutantes patogênicas na formação de agregados intracelulares de origem que possam estar relacionados à sua patogenicidade, como na esclerose lateral amiotrófica. O plasmídeo utilizado neste estudo consiste em uma versão aprimorada da GFP fundida em sua extremidade C à região da cauda da isoforma er do citocromo B cinco de rato, por meio de uma sequência ligadora. A região da cauda do B cinco contém toda a sequência que permanece associada à membrana após clivagem pela tripsina.Isso inclui o domínio transmembrana de 17 resíduos, flanqueado por sequências polares a montante e a jusante. O conector é composto pelo epítopo M seguido por GLY quatro S3. Todo o cDNA é inserido nos sítios Hindi três XO um do vetor de expressão mamífera PC DNA três. Em preparação para a transfeção, cultive as células cost sete em DMEM suplementado a 37 graus Celsius e 5%CO2 no dia anterior à transfeção; plaque três vezes 10 à quinta células em lamínulas redondas de 24 milímetros em uma placa de seis poços no dia seguinte.Transfete as células com o sistema jet PEI conforme descrito pelo fabricante aqui, utilizando uma razão de PEI para DNA de dois para um. Isso geralmente resulta em uma eficiência de transfeção de 70 a 80%. Mantenha as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 24 horas antes da aquisição de imagens. Em seguida, use pinças para transferir uma lamínula com células transfectadas para a câmara de imagem.Retorne a placa de cultura de tecidos ao incubador para preservar as células remanescentes. Para análise ultraestrutural por microscopia eletrônica. Para imagem de células vivas, adicione dois mililitros de meio de imagem a uma câmara de cultura celular de aço. O Xi Fluor é incluído no meio de imagem para impedir que as amostras sofram fotoesbranqueamento. Os experimentos devem ser realizados na presença de smida, um inibidor da tradução, para evitar qualquer aumento no sinal de fluorescência A e, consequentemente, na fluorescência total devido à biossíntese proteica. Coloque a câmara de imagem sobre a platina de um microscópio confocal, equipado com incubadora de CO₂ com controle de temperatura e lasers apropriados com configurações adequadas do fotomultiplicador para realizar a recuperação da fluorescência.Após o fotobranqueamento ou frack, coloque as células em foco e ajuste os parâmetros de aquisição para evitar a saturação dos pixels. Certifique-se também de que a potência do laser esteja definida o mais baixa possível para evitar o branqueamento fotônico devido à aquisição da imagem. Uma vez definidos os parâmetros de imagem, mova-se para um novo campo de visão com duas ou mais células.Uma célula em cada campo de aquisição deve permanecer não descorada, para que possa ser usada para normalizar o sinal fluorescente da célula ou células descoradas. Para a dessensibilização, desenhe uma região de interesse ou ROI correspondente ao retículo endoplasmático liso organizado ou OSER.Configure o programa de imagem para realizar o branqueamento, utilizando um número adequado de iterações para um branqueamento fotônico eficiente e rápido. Se necessário, pode-se usar uma combinação de lasers de 488 nanômetros e 405 nanômetros. Instrua o software a capturar um único quadro a cada 10 segundos durante 10 minutos ao longo de todo o experimento. Isso inclui os períodos pré-branqueamento, de branqueamento e de recuperação.Uma vez que tudo esteja configurado, inicie o clareamento e a captura. Quando a captura estiver concluída, mude para um novo campo de visão e repita este processo. Capture quatro a cinco campos de visão para cada lamínula.Deslize ao lado para medir a perda fluorescente em fotoesmaecimento ou flip. Instrua o programa a realizar uma sequência de esmaecimento e aquisição de imagens pós-esmaecimento por 10 segundos a cada 30 segundos durante 10 minutos, movendo-se então para um novo campo de visão. Desenhe uma ROI correspondente a uma estrutura OSER e inicie o esmaecimento e a captura como antes, para análise.Importe as imagens de frap e flip para o software Image J. Primeiro, avalie a recuperação da fluorescência da ROI clareada ao longo do tempo para os experimentos de frack, e então determine a fluorescência de fundo selecionando uma área fora das células e medindo sua intensidade média ao longo do tempo. Em seguida, subtraia o sinal de fundo das intensidades fluorescentes das ROI.Normalize os dados à fluorescência total da célula clareada, que deve permanecer constante ao longo do tempo. Em seguida, ajuste a equação monoexponencial mostrada aqui, onde F pós é o sinal fluorescente após o clareamento fotônico, F rec é o valor máximo de recuperação da fluorescência alcançado após o clareamento, T é o tempo final de registro e tau é o tempo médio de registro.Para análise dos experimentos de flip, desenhe uma ROI fora do OSER fotobranqueado, cobrindo toda a célula, e meça sua intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Quanto aos experimentos de frack, subtraia o fundo utilizando uma área fora das células. Normalize os dados em relação aos níveis de fluorescência de uma ROI desenhada em uma célula não fotobranqueada para corrigir qualquer diminuição na fluorescência causada pelo próprio processo de aquisição de imagens.Por fim, plote os resultados utilizando o GraphPad Prism ou software semelhante. Muitos dos reagentes utilizados no preparo das amostras para microscopia eletrônica são tóxicos. Portanto, os seguintes passos devem ser realizados usando jaleco e luvas, enquanto se trabalha sob capela de exaustão.Após remover a lamínula da placa de Petri para microscopia óptica, fixe as células remanescentes cultivadas na parte inferior da placa como uma monocamada por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, utilizando um raspador de teflon, desprenda as células e transfira-as para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Pelize as células por centrifugação a 9.000 × g durante 10 minutos após a rotação. Remova o sobrenadante, adicione fixador fresco e deixe sob refrigeração a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.Lave os pellets aspirando suavemente o fixador com uma pipeta Pasteur e adicionando tampão Cate. Para evitar perturbar o pellet, permita que o tampão escorra pela parede lateral do tubo durante a adição. Aspire a solução de lavagem e realize a pós-fixação adicionando as células em uma solução de 1% de tetróxido de ósmio no tampão Cate por uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, lave com água Milli Q e adicione 1% de acetato de uranila em água destilada diretamente ao tubo de microcentrífuga. Desbloqueie a coloração por 20 minutos a uma hora, desidrate as amostras em uma série crescente de etanol de 70%, 80%, 90%, 100% e novamente 100% por 10 minutos cada. Em seguida, lave os pellets duas vezes em óxido de propileno por 15 minutos cada vez.Infiltra as amostras substituindo o óxido de propileno pela mistura um para um de óxido de propileno e epon, incubando por pelo menos duas horas ou durante a noite. Em seguida, para embutir as amostras, coloque os fragmentos de pellet celular em moldes de inclusão previamente preenchidos com resina epóxi epon e cure a 60 graus Celsius por pelo menos 24 horas. No dia seguinte, monte o bloco de resina em um ultramicrótomo equipado com uma lâmina de diamante de 45 graus.Usando uma faca de corte, corte manualmente os blocos de resina para remover as partes do bloco em que a amostra embutida não está presente. Em seguida, utilizando o ultramicrótomo, obtenha seções de 60 a 70 nanômetros. Colete as seções em grades de cobre de 300 malhas para colorir as seções.Coloque as grades em gotas de 30 microlitros de uma solução saturada de uranil, acetato, e incube por 20 minutos. Em seguida, lave três vezes em água Milli-Q e incube novamente as grades em pequenas gotas de citrato de chumbo por sete minutos. Após a incubação, lave cuidadosamente as grades imersindo-as em água Milli-Q e deixe secar à temperatura ambiente.Observe as grades coradas utilizando um microscópio eletrônico de transmissão e capture imagens usando uma câmera CCD montada na base com aumento final variando de 6.000 a 39.000 × para investigar a difusão lateral da D-E-G-F-P ER no retículo endoplasmático liso organizado. Sete células transfectadas temporariamente provenientes de três lamínulas foram analisadas por FRAP conforme descrito neste vídeo; conforme mostrado nesta sequência de lapso de tempo, duas estruturas OSER foram clareadas e a recuperação da fluorescência foi registrada ao longo do tempo. Foi detectada recuperação clara da fluorescência um minuto após o clareamento, com aumento adicional do sinal quatro minutos depois, a fim de determinar o tempo de meia-recuperação e quantificar a fração móvel da D-E-G-F-P-E-R.As imagens capturadas foram analisadas conforme descrito neste vídeo, como pode ser visto aqui. A intensidade fluorescente da área clareada aumentou ao longo do tempo, demonstrando que a proteína fluorescente é altamente móvel dentro dos agregados. Para estudar a continuidade entre diferentes subdomínios do retículo endoplasmático, foram realizados experimentos flip, conforme mostrado nesta sequência de lapso de tempo.O branqueamento contínuo de um OSER indicado aqui pela seta amarela provoca uma diminuição progressiva da fluorescência no restante do retículo endoplasmático e em outras estruturas OSER dentro da mesma célula. A seta vermelha indica uma porção de uma célula não branqueada na qual o sinal fluorescente permanece constante ao longo do tempo. A análise quantitativa desses dados revelou um esvaziamento progressivo e rápido do retículo endoplasmático reticular, demonstrando que os agregados estão fisicamente conectados ao restante do retículo endoplasmático. Para examinar a arquitetura fina desses agregados, células que expressam altos níveis de D-E-G-F-P ER foram observadas utilizando um microscópio eletrônico de transmissão.Esta micrografia mostra uma visão em baixa ampliação do citoplasma celular contendo um agregado de membranas. O agregado é composto por uma pilha de cisternas e membranas sinusoidais onduladas. Como pode ser observado aqui.As mitocôndrias podem ser vistas agrupadas ao redor das estruturas OSER, enquanto ribossomos, indicados pelas setas, revestem apenas as membranas do cisterna mais externo. Observe que o espaço denso ao elétron com 11 nanômetros de espessura entre as membranas é contínuo com o citoplasma. Um RE OS pode ser formado por RE lamelar, que são pilhas de cisternas achatadas de RE que podem aparecer contínuas ou fragmentadas em cortes finos; vesículas brotando da cisterna mais externa da pilha podem ocasionalmente ser observadas, como mostrado aqui.No conjunto, esses dados demonstram que os agregados fluorescentes observados em células cultivadas transfetadas com D-E-G-F-P ER representam manchas de retículo endoplasmático liso e achatado que se organizam espacialmente em geometrias tridimensionais bem definidas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de adquirir todas as imagens sem pixels saturados, o que poderia alterar a recuperação fluorescente e, consequentemente, a análise da mobilidade proteica. Certifique-se sempre de normalizar o sinal fluorescente na região submetida ao clareamento (bleach) em relação à fluorescência total da mesma célula, a fim de considerar variações na intensidade da fluorescência decorrentes do clareamento durante a aquisição de imagens ou pequenas alterações no plano de foco.

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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