Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração In vitro

O objetivo geral deste procedimento é transfectar o neuroblasto pós-natal primário de roedores, a fim de examinar o efeito das proteínas-alvo em sua migração. Isso é feito primeiro dissecando o neuroblasto do fluxo migratório rostral dos pops de roedores. O segundo passo é dissociá-los e transfectá-los por afecção do núcleo com DNA ou S-H-R-N-A.

Em seguida, os neuroblastos são agregados em gotas suspensas e depois cultivados em suspensão por um tempo apropriado. A etapa final é incorporar os aglomerados de neuroblastos reagregados em uma matriz tridimensional e deixá-los migrar. Em última análise, a imunofluorescência ou microscopia de imagem com lapso de tempo é usada para analisar a migração de neuroblastos.

Este método pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da neurogênese, como o controle da migração de neuroblastos derivados de células-tronco no cérebro pós-natal. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente fácil e rápida em comparação com o uso de vetores virais, o que pode ser desafiador e demorado. Depois de sacrificar uma ninhada de rato P seis a P sete, faça uma incisão posterior na pele ao longo da sutura sagital média do nariz ao cerebelo com uma lâmina de bisturi em cada rato.

Em seguida, retire a pele. Repita a mesma incisão ao longo do crânio. Em seguida, remova suavemente os retalhos cranianos com uma pinça e remova cuidadosamente o cérebro junto com os bulbos olfatórios com uma espátula.

Depois disso, corte o terço mais mimado do cérebro e descarte-o. Posteriormente, corte o tecido cerebral em fatias coronais de 1,4 milímetro de espessura usando um picador de tecido. Transfira as fatias para um prato contendo meio de dissecação a frio.

Em seguida, visualize as fatias sob o microscópio de dissecação. Separe-os cuidadosamente usando uma agulha. O fluxo migratório rostral aparece como uma área translúcida triangular no centro das seções OB e como uma pequena área circular.

Em fatias de cérebro mais mimadas, corte o RMS de cada fatia com uma faca microcirúrgica, tomando cuidado para evitar incluir o tecido circundante. Em seguida, colete os fragmentos de RMS com uma pipeta de pasta de plástico e coloque-os em um pequeno prato contendo meio de dissecação a frio sobre gelo. Em seguida, gire suavemente o prato para reunir os fragmentos RMS no centro do prato.

Recolha os fragmentos com uma pipeta de plástico e transfira-os para um tubo de 15 mililitros. Deixe os fragmentos assentarem no fundo do tubo. Substitua o meio de dissecção por dois mililitros de meio de dissociação T tri.

Classifique os fragmentos RMS pipetando suavemente a suspensão do fragmento para cima e para baixo cerca de 10 vezes usando uma pipeta P 1000 depois. Deixe o tubo com os fragmentos de tecido em banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, pipetar novamente a solução 10 vezes e certificar-se de que os fragmentos se dissociaram.

Em seguida, inative a tripsina adicionando cinco mililitros de DMEM pré-vermifugado mais 10% FCS e centrifugue a suspensão celular a 433 vezes G por cinco minutos. Retire o excesso de meio e resus. Suspenda o pellet celular pipetando-o suavemente em um mililitro de DMEM pré-aquecido mais 10% FCS e, em seguida, adicione mais quatro mililitros do mesmo meio.

Em seguida, execute uma contagem de células. Um mínimo de 2,5 vezes 10 para a sexta célula é necessário para cada afecção do núcleo, enquanto os melhores resultados são alcançados. Usando três a quatro vezes 10 elevado a seis células por acometimento de núcleo.

Centrifugar a suspensão celular a 433 vezes G durante cinco minutos. Depois disso, remova o máximo de meio possível neste procedimento. Imediatamente Resus, suspenda o pellet celular na solução de afecção do núcleo do neurônio de rato previamente incubada.

À temperatura ambiente, transfira 100 microlitros da suspensão celular para cada tubo EOR contendo SI R-N-A-D-N-A. Em seguida, misture delicadamente pipetando duas a três vezes com uma pipeta P 200. Em seguida, adicione a amostra na parte inferior do núcleo, tomando cuidado para evitar a geração de bolhas.

Para afecção do núcleo, use o programa G dash 0 1 3 para células de rato ou O dash 0 0 5 para células de camundongo. Depois disso, adicione rapidamente um mililitro de DMEM pré-guerra mais 10% FCS à amostra afetada pelo núcleo. Transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DMEM pré-guerra mais 10% FCS usando a pipeta de plástico fornecida pelo kit de afeto do núcleo.

Em seguida, centrifugar a amostra a 433 vezes G durante cinco minutos. Remova cuidadosamente todo o excesso de meio e ressuspenda o pellet em 25 a 30 microlitros de DMEM pré-guerra mais 10% FCS usando uma pipeta P 20. Não use mais de 30 microlitros de meio.

Em seguida, pipete a suspensão como uma gota no lado interno de uma tampa de prato P 35. Em seguida, inverta a tampa sobre o prato P 35 contendo dois mililitros de meio completo. Deixe-o na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos cinco horas.

Após cinco horas, transfira as gotas penduradas da tampa para o meio completo no prato. Usando uma pipeta P 1000 com uma ponta cortada. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para infecções nucleares de DNA NU ou 48 horas para afecções do núcleo SI A HRA.

Agora prepare 25 mililitros de meio completo e pré-equilibre a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por algumas horas. Enquanto isso, retire as alíquotas congeladas da matriz da membrana basal do freezer de 80 graus Celsius negativos e descongele-as no gelo na câmara fria. Para cada afecção do núcleo, prepare um prato de seis centímetros contendo até oito lamínulas estéreis de 13 milímetros.

Coloque os pratos em uma geladeira coberta com filme plástico. Para manter a umidade, coloque uma tira de tecido úmido dentro de um prato de 15 centímetros que será usado para segurar até três pratos de seis centímetros contendo oblasts embutidos no joelho. Em seguida, adicione o meio completo à matriz haw em uma proporção de um para três, transfira os aglomerados de células reagregados para um tubo de 15 mililitros e centrifugue-o 433 vezes G por cinco minutos.

Em seguida, retire o excesso de meio e ressuspenda o palete em 10 microlitros de meio completo. Em seguida, coloque dois microlitros de suspensão de agregado celular em cada lamínula estéril. Adicione 18 microlitros de mistura média completa de matriz e use a ponta da pipeta para espalhar a matriz por toda a tampa.

Deslize imediatamente depois coloque o prato de seis centímetros contendo as lamínulas no prato de 15 centímetros. Transfira o prato para a incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 15 a 20 minutos. Depois que a matriz solidificar, adicione suavemente cinco mililitros de meio completo a cada prato de seis centímetros e empurre para baixo quaisquer lamínulas flutuantes com a ponta da pipeta e incubada por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de carbogênio para permitir que o neuroblasto migre para fora dos agregados celulares.

Nesta figura, as células RMS isoladas de ratos mostram-se imunopositivas para os marcadores migratórios de neuroblastos DCX e beta três tubulina. E esta figura mostra que os marcadores migratórios de neuroblastos DCX e PSA NCA são expressos nas células que migram para fora do camundongo. RMS Explan para camundongo Neuroblast Nu afecção nuclear, camundongo dissociado RMS Neuroblast foram núcleos afetados com GFP re agregado embutido em uma matriz tridimensional e permitido migrar por seis horas.

O neuroblasto migrando para fora de um aglomerado de células reagregadas mostra alta eficiência de transfecção. Aqui, o neuroblasto de rato foi afetado com dois plasmídeos diferentes que codificam GFP re agregado embutido na matriz e deixado para migrar por 24 horas. As células foram então fixadas e imunomarcadas para GFP e beta três tubulina para medir a distância de migração.

O cluster de células agregadas é dividido em seis setores iguais e a distância entre a borda do cluster e a célula migrada mais distante é medida para cada setor. Esta figura mostra a quantificação da distância relativa migrada pelas células afetadas pelo NÚCLEO GFP positivo e controla as células não afetadas pelo núcleo GFP negativo para monitorar a migração de neuroblastos. Após o neuroblasto de rato do núcleo S-H-R-N-A ser afetado com um vetor S-H-R-N-A de controle ou o mesmo vetor contendo uma fixação do alvo HRNA e células proteicas de agrupamento de actina foram reagregadas ao longo de 48 horas embutidas na matriz e deixadas para migrar por 24 horas.

Os agregados foram então fixados e imunocorados para GFP e beta três tubulina. A depleção efetiva da fixação pode ser detectada 50 horas após a afecção dos núcleos S-H-R-N-A pela Western Blood Analysis e Acton é mostrado aqui como um controle de carga. Aqui está a análise quantitativa da distância relativa de migração mostrando que a depleção acelerada prejudica significativamente a migração de neuroblastos.

Após este procedimento, outros métodos como a eletroporação pós-natal podem ser realizados para validar in vivo os resultados obtidos com o ensaio de migração NU Nuclear Affection.