Name: Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração In vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda a nucleofeção de neuroblastos de roedores para estudar a migração celular in vitro usando DNA/shRNA. Este método eficiente permite analisar o efeito de proteínas-alvo no movimento dos neuroblastos pós-natais.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust um projeto de subsídio concedido à DP e GL (089236/Z/09/Z). SG foi apoiado por uma Biotecnologia e PhD Ciências Biológicas Research Council studentship. Agradecemos Matthieu Stahl para o presente tipo de vetor shRNA e Jennifer Shieh para conselhos valiosos sobre neuroblasto nucleofection.

Este procedimento está de acordo com os Regulamentos do Reino Unido O Home Office (Lei procedimentos científicos animal, 1986). Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelos organismos reguladores animais institucionais e nacionais. 1. Dissecção e dissociação de Rato RMS Neuroblastos <ol><li> Preparar as soluções necessárias para a RMS e dissecção de dissociação: </li></ol> Meio de dissecção (100 ml) Equilibrado solução de Hank Sal (HBSS) - 98,5 ml 5 M de HEPES pH 7,4-0,5 ml Penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / ml e 10.000 ug / ml) - 1 ml De meio de dissociação (2 mL) HBSS - 1.760 ml 10x de tripsina (2,5%) - 200 ul DNAse1 (1 mg / ml) - 40 ul Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) + 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml O meio completo (12 ml) Médias Neurobasal - 11,46 ml B27 Suplemento - 250 mL L-Glutamina (200 mm) - 125 mL Glucose (45%) - 165 ul 2. Filtrar-esterilizar a% de FCS + DMEM a 10 e meio completo e preequilibrate los num 37 ° C / 5% de CO2. <ol><li> Dissecação <ol><li> Sacrifique uma ninhada de ratos P6-P7 (cerca de 12 filhotes) por deslocamento cervical e decapitar com uma tesoura. </li><li> Faça uma incisão ântero-posterior na pele ao longo da sutura médio-sagital do nariz para o cerebelo com uma lâmina de bisturi. Descasque a pele fora e repetir a mesma incisão ao longo do crânio. </li><li> Remova cuidadosamente as abas cranianos com uma pinça e retire cuidadosamente o cérebro com uma espátula, tendo o cuidado de incluir os bulbos olfatórios. </li><li> Corte o terceiro mais caudal do cérebro e descartá-lo. </li><li> Pique ªe tecido cerebral em 1,4 milímetros de espessura, utilizando cortes coronais um helicóptero tecido. </li><li> Coloque as fatias em pratos contendo meio de dissecção fria e cuidadosamente separá-los usando uma agulha. </li><li> O RMS aparece como um triangular, a área translúcida no centro de seções OB e como uma pequena área circular em mais fatias cerebrais caudais. Corte as RMS fora de cada fatia com uma faca de microcirurgia, tomando cuidado para evitar a inclusão de tecido circundante. Em P7 filhotes de rato, geralmente as ~ 8 fatias mais rostral (incluindo OB) contêm os RMS. </li><li> Colete os fragmentos RMS com uma pipeta Pasteur de plástico e coloque-os em um pequeno prato contendo meio de dissecção fria no gelo. </li><li> Quando o esvaziamento está completo, os fragmentos de RMS transferir para um tubo de 15 ml com uma pipeta de plástico. Deixar fragmentos para assentar no fundo do tubo. </li></ol></li><li> Dissociação <ol><li> Substituir o meio de dissecção com 2 ml de meio de dissociação. </li><li> Triturar os fragmentos RMS delicadamente pipetting a suspensão fragmento cima e para baixo cerca de 10x com uma pipeta P1000. </li><li> Deixar o tubo com os fragmentos de tecido em um banho de água a 37 C ° durante 2 min. </li><li> Pipetar a solução novamente 10x e assegurar que os fragmentos têm dissociado (a suspensão deve tornar-se turva). </li><li> Inactivar a tripsina adicionando 5 ml de pré-aquecido DMEM + 10% FCS. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 433 xg por 5 min. </li><li> Na alíquota entretanto a quantidade necessária de siRNA / ADN em tubos de Eppendorf (habitualmente 3-5 ug de ADN / shRNA ou siRNA 5-9 oligo ug por nucleofection, no entanto, a quantidade de ADN / siRNA podem requerer optimização). </li><li> Remover o excesso de meio e ressuspender o sedimento de células por pipetagem suave em 5 mL de pré-aquecido DMEM + 10% FCS. </li><li> Realizar uma contagem de células. Esperar ~ 1 x 10 6 células por rato filhote cérebro. Um mínimo de 2,5 x 10 6 células são necessárias para cada nucleofection, enquantoos melhores resultados são obtidos usando 3-4 x 10 6 células por nucleofection. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 433 xg por 5 min. Certifique-se de remover o máximo médio possível. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Imediatamente ressuspender o pellet celular em ratos (ou o mouse se estiver usando células de camundongo) solução nucleofection neurônio previamente incubada à temperatura ambiente. Use 100 ml por nucleofection Nota:. Normalmente uma ninhada de ratos de 12 filhotes é suficiente para realizar 4 nucleofections e uma ninhada de rato (12 filhotes) é suficiente para realizar 2 nucleofections. </li><li> Transferir 100 ul da suspensão de células a cada tubo de Eppendorf contendo siRNA / ADN e misturar delicadamente 2-3x por pipetagem com pipeta P200. </li><li> Adicionar a amostra (suspensão cell-DNA/siRNA) para a parte inferior do nucleofectioncuvette, tendo cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Nucleofect usando o programa de G-013 (para células de rato) ou O-005 (paracélulas de camundongo). Uma nucleofection leva cerca de 5 segundos. </li><li> Rapidamente adicionar 1 ml de pré-aquecida de DMEM + FCS a 10% para a amostra nucleofected. </li><li> Repita os passos 2.4 e 2.5 para todas as outras amostras. Nota: para melhores resultados, o procedimento nucleofection todo não deve durar mais do que 5 min. </li><li> Transferir cada amostra para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de pré-aquecido DMEM + 10% de FCS utilizando a pipeta de plástico fornecidos pelo estojo nucleofection. Evitar a transferência de quaisquer restos celulares para o tubo. </li><li> Centrifugar as amostras a 433 x g durante 5 min. </li><li> Retire com cuidado todas médio excesso e ressuspender o sedimento em 25-30 mL de pré-aquecido DMEM + 10% FCS, utilizando uma pipeta P20. Não use mais de 30 mL de meio. </li><li> Pipetar a suspensão como uma queda para o lado interior de uma tampa de p35 prato. </li><li> Inverter a tampa sobre o prato de p35 contendo 2 ml de meio completo (ver também a Figura 1). </li><li> Deixar na incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante pelomenos 5 horas e até 7 horas. Maior tempo de incubação permite melhor reaggregation de grupos de células. </li><li> Transfira as gotas de suspensão da tampa para o meio completo no prato com uma pipeta P1000 com uma ponta de corte. </li><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 por 24 horas para nucleofections de DNA e 48 horas para nucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. Incorporação <ol><li> Preparar meio completo (25 ml) e preequilibrate que a 37 ° C / 5% de CO 2 durante algumas horas. </li><li> Retire as alíquotas congeladas da matriz da membrana basal de -80 ° C freezer e descongele no gelo no quarto frio. </li><li> Para cada nucleofection preparar um prato 6 centímetros contendo até oito 13 milímetros coverlips estéreis. </li><li> Coloque os pratos em uma caixa de gelo coberto com filme plástico. É importante manter as lamelas fresco para evitar a solidificação da matriz, durante o processo de incorporação. </li><li> Para manter a umidade, coloque uma tira de tecido úmido dentro de uma 15 centímetros prato que wdoente ser usado para armazenar até três pratos seis centímetros contendo os neuroblastos incorporados. </li><li> Adicionar meio completo para a matriz descongelada numa proporção de 1:3. Por exemplo, misturar 40 mL de meio completo com 120 mL de matriz por pipetagem. Esta quantidade de matriz é suficiente para a incorporação de agregados em oito 12 milímetros lamínulas. </li><li> Transferir os cachos de células avaliação reagregada para um tubo de 15 ml e centrifugar a 433 xg durante 5 min. </li><li> Remover o excesso de meio e ressuspender o sedimento em 10 mL de meio completo. </li><li> Coloque 2 mL de suspensão agregado de células em cada lamela estéril e adicionar 18 mL de matriz / mistura meio completo. Use a ponta da pipeta para espalhar a matriz ao longo de toda a lamela. </li><li> Colocar imediatamente o prato 6 centímetros contendo as lamelas em 15 cm de disco e deixar na incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante 15-20 min. Quando a matriz tem solidificado, adicione delicadamente 5 ml de meio completo a cada seis centímetros tomada prato cuidado para empurrarpara baixo qualquer lamela flutuante com uma ponteira. </li><li> Incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO2 para permitir que os neuroblastos migrar para fora dos agregados celulares. </li></ol> 4. 3D Migração Assay <ol><li> Preparar as soluções necessárias para a imunocoloração. <ol><li> Preparar a solução de bloco: Solução bloco Goat (50 ml) Tampão fosfato (PBS) - 5 ml Soro de cabra - 7,5 ml 10% de Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H2O - 36 ml </li><li> Filtrar e armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare a solução de fixação: Solução de fixação (100 ml) Paraformaldeído (PFA) - 4 g ATENÇÃO: sempre lidar com PFA sob um capuz Sacarose - 20 g (opcional) PBS até 100 ml </li><li> Sobre uma placa quente e sob agitação constante, dissolve-se o PFA em 80 ml de PBS mantida a 65 ° C. </li><li> Uma vez que a AFP se dissolveu, adiciona-se 20 g de sacarose. </li><li> Ajustar o pH a7,4 (normalmente através da adição de ~ 60 mL de NaOH a 1 M por 100 mL de solução). </li><li> Levar até um volume total de 100 ml com PBS. </li></ol></li><li> Imunocoloração <ol><li> Coloque lamelas numa placa de 24 poços. </li><li> Lavar lamínulas com PBS 2x. </li><li> Corrigir os agregados neuroblastos RMS com solução fixadora por 45 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar lamínulas com PBS 3x (5 min / lavagem - em uma plataforma de balanço). </li><li> Bloco para 30-60 min com solução bloco cabra. </li><li> Dilui-se os anticorpos primários em solução de bloqueio de cabra e incubar durante a noite a 4 ° C. (Se desejar, faloidina fluorescente (1:400) e corante Hoechst (1:10.000) pode também ser adicionado à solução do anticorpo primário para visualizar actina filamentosa e núcleos). </li><li> Lavar lamínulas com PBS 3x (5 min / lavagem). </li><li> Dilui-se anticorpos secundários, em solução de bloqueio de cabra e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe coverslips com PBS 3x (5 min / lavagem) </li><li> Monte lamelas com meio de montagem fluorescente e deixar secar durante a noite à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Análise migração <ol><li> Capturar imagens de agregados neuroblastos fixos RMS com um microscópio fluorescente usando uma objetiva de 10X. Incluir uma barra de escala de uma imagem de amostra. </li><li> Para configurar a escala para quantificação, medir a barra de escala na imagem selecionando a ferramenta &quot;Reta&quot; na barra de ferramentas ImageJ. </li><li> Escolha a opção &quot;Analisar&quot; e clique em &quot;definir a escala &#39;. </li><li> Na janela de escala definir a &#39;distância conhecida &quot;e marque a caixa&#39; global &#39;para manter as mesmas configurações para todas as medições. </li><li> Use a ferramenta &quot;linha segmentada&quot; na barra de ferramentas ImageJ para medir a distância a partir da borda do agregado para o mais neuroblasto migraram em seis setores diferentes em torno de todo o agregado (Figura 3B). Considere apenas isolado agagregações perenes para análise. </li><li> Calcule uma distância média de migração dos seis valores obtidos para cada agregado. </li><li> Medir 10-20 agregados para cada condição em cada experimento e piscina independentes resultados de um mínimo de três experimentos independentes. Sempre inclua um controle nucleofection (eg. GFP ou um sh controle / siRNA). </li></ol></li></ol>

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<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A migração de neuroblastos ao longo das RMS para o local final no OB é um passo fundamental na neurogênese pós-natal. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam este processo complexo estão longe de ser totalmente compreendido. O procedimento experimental descrito aqui permite o estudo de migração neuroblastos in vitro. Nós adaptamos um protocolo publicado anteriormente para isolar RMS neuroblastos de rato pós-natal precoce ou rato 25. Para obter melhores resultados, é importante dominar o passo de dissecção, uma vez que é crucial para manter o intervalo de tempo entre a dissecção e nucleofection a um mínimo. Após nucleofection, neuroblastos podem ser avaliação reagregada, embebido numa matriz tridimensional e da esquerda para a migrar ao longo de um período de 24 horas. Alternativamente, para outros fins que a migração (por exemplo, imunofluorescência ou western blot) fins, as células podem ser plaqueadas imediatamente após nucleofection em polyornithine/laminin-lamelas revestidas, onde sobrevivem até 4-5 dias. O rato eo rato neuroblastos migram em Matrigel a um nível semelhante, porém células de camundongo parecem ter uma tendência mais forte para migrar em cadeias do que as células de ratos. Dependendo do objetivo do estudo, neuroblastos pode ser nucleofected com diferentes plasmídeos que codificam proteínas fluorescentes ou proteínas do tipo / mutante selvagens de interesse. Para óptimas plasmídeos de expressão de proteínas com um promotor CAG (promotor β-actina com intensificador de CMV e-globina β cauda poli-A) 26, são altamente recomendadas. Além disso, oligos de siRNA ou shRNA podem ser nucleofected a knockdown alvos de interesse. Depleção eficaz de proteína pode ser visualizada por imunofluorescência ou por Western blot (geralmente lise agregados embutidos de 1 cria de rato com 50 ul de tampão de lise padrão). Nucleofection é um método relativamente simples para transf neuroblastos primários, oferece uma alternativa mais fácil e rápido a viral transfecção mediada por vetor, e pode alcançar alta (~ 70-80%) a eficiência de transfecção. É crítico para trabalhar rapidamente durante o processo de nucleofection, desde que deixou neuroblastos na solução nucleofection durante um tempo prolongado reduz drasticamente a viabilidade celular. O rendimento celular médio RMS de dissecção é relativamente baixa para os ratinhos P7 (~ 5 x 10 5 células / cérebro) em comparação com ratos P7 (~ 1 x 10 6 células / cérebro) e são necessários pelo menos 3 x 10 6 culas por nucleofection para atingir a transfecção com ~ 50% de eficiência. Além disso, os neuroblastos de rato parece resistir melhor Nucleofection comparação com os neuroblastos de rato. Portanto, os filhotes pós-natal precoce (P6-P7) de ratos pode representar uma fonte neuroblasto conveniente, considerando também que a organização do RMS de ratos e camundongos são muito similar 27 e que a extensão do rato e rato neuroblasto migração in vitro também é comparável. É aconselhável não manter os cachos avaliação reagregada de neuroblastos nucleofected em suspensão por mais de 48 horas para evitar efeitos anormais na morfologia celular e migração (nossas observações não publicadas). O ensaio 3D descrito aqui pode ser utilizado para quantificar a migração de neuroblastos em um ponto de tempo fixo após a incorporação em matriz (por exemplo, 24. Hr). Agregados de tamanhos diferentes podem ser utilizadas na análise, uma vez que não existe uma correlação significativa entre a dimensão dos agregados e a distância de migração (nossas observações não publicadas). Para visualizar e ainda investigar a dinâmica da migração neuroblastos, imagens de lapso de tempo pode ser usado. Recomenda-se para realizar a análise de migração dentro de um intervalo de 24 horas após a incorporação, uma vez que a velocidade de neuroblastos parece diminuir drasticamente a pontos de tempo mais longos (nossas observações não publicadas). &lt;/ P&gt; Existem algumas limitações para este protocolo. Em primeiro lugar, pode nucleofection até agora ser usado para início neuroblastos roedores pós-natal, enquanto que a infecção com vetores virais continua a ser o método de transfecção mais eficiente para neuroblastos adultos 28. Em segundo lugar, o ensaio de migração in vitro não reproduzem integralmente a complexa arquitetura dos RMS observados in vivo. Com efeito, embora neuroblastos manter a capacidade de migrar de uma forma semelhante aos seus congéneres in vivo, na configuração experimental descrito aqui eles não têm interações com outros componentes do RMS, como astrócitos e vasos sanguíneos, que também contribuem para regular a motilidade 9,29, 30. Esse problema pode ser abordado no futuro através da optimização de sistemas modelo de co-cultura tridimensionais. Em conclusão, combinando nucleofection com um ensaio de migração 3D representa uma ferramenta valiosa para compreender melhor os mecanismos moleculares subjacentesmigração neuroblastos. Este procedimento experimental fornece um método inicial, rápido e relativamente simples para avaliar o papel dos reguladores candidatos da migração neuroblastos, que pode ainda ser validadas por outras abordagens, como in vivo eletroporação pós-natal e lapso de tempo de imagem do cérebro culturas fatia 28,31,32 .

No pós-natal dos mamíferos cérebro, geração de novos neurônios (neurogênese) ocorre ao longo da vida e é restrita a dois nichos neurogênicos: a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais ea zona subgranular do giro denteado do hipocampo 1. Vários estudos recentes têm demonstrado o importante papel da neurogênese adulta no sentido de facilitar as tarefas de aprendizagem e memória 2,3. Além disso, a evidência da proliferação e recrutamento de células progenitoras neurais após lesão cerebral 4-7 levanta a possibilidade de ativação farmacológica da neurogênese no reparo neural. Neurogênese pós-natal é estritamente regulada em todas as suas fases, que incluem a proliferação neural progenitor, migração, diferenciação, sobrevivência e integração sináptica final neurônios recém-nascidos 8. Progenitores neurais (neuroblastos) derivadas de células-tronco no ZSV migrar a uma grande distância através da migratório rostralcorrente (RMS) para o bulbo olfatório (OB) onde amadurecem em neurônios funcionais 9. Neuroblastos migratórios são predominantemente unipolar, com um corpo de célula alongada que se estende de um único processo de liderança. Estas células se movem em cadeias de uma forma coletiva, deslizando umas sobre as outras 10. A migração é um passo crucial para a maturação posterior dos progenitores ZSV derivados em neurônios funcionais 11 e é controlado por múltiplos fatores e moléculas de orientação incluindo: molécula de adesão da célula neural polissialilados (PSA-NCAM) 12, Efrinas 13, 14 integrinas, Slits 15, fatores de crescimento de 16 e 17 de neurotransmissores, no entanto os mecanismos moleculares subjacentes a este processo não são completamente compreendidos. A investigação das vias de sinalização intracelular que regulam a migração de neuroblastos não só fornecer uma melhor compreensão da neurogénese adulto, mas também contribuir para o desenvolvimento da nova terapêuticaabordagens para promover a reparação do cérebro. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para estudar o papel de reguladores de candidatos de migração neuroblastos in vitro utilizando nucleofection e um ensaio de migração 3D. Nucleofection é uma técnica de transfecção de células com base em um método melhorado de electroporação. Corrente elétrica de tipo específico de célula e solução nucleofection permitir a transferência de macromoléculas polianiónicos como o DNA e shRNA vetores e oligonucleotídeos siRNA diretamente no núcleo da célula e permitir a transfecção de dividir lentamente ou mitose de células inativas como embrionárias e mamíferos neurônios 18. Este método é rápido, relativamente fácil de realizar e resulta em transfecção altamente reprodutível de uma ampla gama de tipos de células, incluindo os neuroblastos primários e neurónios 19-21. A dissociação de tecido RMS permite o isolamento de neuroblastos migradoras, que podem ser nucleofected com êxito com DNA / SHRVetores de NA ou oligos siRNA alvo genes de interesse. Após nucleofection, neuroblastos estão em avaliação reagregada pendurado gotas e, posteriormente, incorporado em uma matriz de Matrigel tridimensional. Estas condições permitem neuroblastos a migrar para fora dos agregados de células sintetizando o modo de migração observada in vivo, proporcionando assim um sistema modelo excelente para investigar as vias de sinalização envolvidos na migração de neuroblastos e para avaliar a influência dos tratamentos farmacológicos na mobilidade destas células.

<table><tbody><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada (HBSS)</td> <td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsina-EDTA (10x)</td> <td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>loja 200 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DNAse I Frasco (D2)</td> <td>Worthington</td><td>LK003170</td><td>&ge; 1.000 unidades por frasco; loja 50 &micro; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3007902</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solução de D-(+)-Glicose (45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Matrigel Porás, Fator de Crescimento Reduzido (TFG), Sem Vermelho de Fenol, 10 ml, Livre de LDDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>preparar 120 &micro; l alíquotas em 4 &deg; C, em seguida, armazene a -80 &graus; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441242</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>BDH</td><td>102745C</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPE9701-100</td><td></td></tr><tr><td>Dako meio de montagem de fluorescência</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucleofecção de neurônio de rato</td><td>Lonza</td><td>VPG-1003</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucleofecção de neurônio de camundongo</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Faca microcirúrgica</td><td>Angiotech</td><td>7516</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain picador de tecidos</td><td>The Mickle Laboratory Engineering Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleofection de roedores neuroblastos para estudar neuroblasto migração<em&gt; in vitro</em

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

A zona subventricular (SVZ), localizada na parede lateral dos ventrículos laterais desempenha um papel fundamental na neurogénese adulto. Nesta área restrita do cérebro, as células estaminais neurais proliferar e gerar constantemente neuroblastos que migram tangencialmente em correntes ao longo do fluxo migratório rostral (RMS) para atingir o bolbo olfactivo (OB). Uma vez no OB, neuroblastos mudar para migração radial e depois se diferenciar em neurônios maduros, capazes de incorporar a rede neuronal preexistente. Migração adequada neuroblasto é um passo fundamental para a neurogênese, garantindo a correta maturação funcional dos neurônios recém-nascidos. Dada a possibilidade de neuroblastos ZSV derivados para atingir áreas lesionadas do cérebro, investigando os mecanismos intracelulares subjacentes à sua mobilidade não só irá melhorar a compreensão da neurogênese, mas também pode promover o desenvolvimento de estratégias neuroregenerative. Este manuscrito descreve um detalhadoProtocolo para a transfecção de roedor primárias RMS neuroblastos pós-natal e a análise da sua motilidade usando um ensaio de migração 3D vitro recapitula o seu modo de migração observada in vivo. Ambos os neuroblastos de rato e de ratinho podem ser rapidamente e eficientemente transfectadas através nucleofection quer com ADN de plasmídeo, pequeno gancho (sh) ou ARN de interferência curto (si) oligos RNA alvo os genes de interesse. Para analisar a migração, as células são nucleofected avaliação reagregada em &quot;gotas de suspensão&quot; e, posteriormente, incorporado em uma matriz tridimensional. Nucleofection per se não prejudicar significativamente a migração de neuroblastos. O tratamento farmacológico de neuroblastos nucleofected e avaliação reagregada também pode ser realizada para estudar o papel das vias de sinalização envolvidos na migração de neuroblastos.

Os neuroblastos podem ser isolados com sucesso a partir de tecido dissecado de RMS (Figura 1A) e incorporado numa matriz tridimensional. As células isoladas de um ou outro rato ou RMS pós-natal do rato são imunopositivas para marcadores neuroblastos migratórios, como doublecortin (DCX), βIII tubulina ou PSA-NCAM (Figuras 1B-C). Neuroblastos dissociadas podem ser eficientemente nucleofected com o ADN (p. ex. De um plasmídeo que codifica a GFP, Figura 2) ou shRNA (Figura 4) para atingir o esgotamento da proteína, que pode ser avaliada por meio de análise Western blot (Figura 4B) ou imunofluorescência (não mostrado) . Células nucleofected com plasmídeos que codificam para GFP migrar radialmente para fora agregados neuroblastos avaliação reagregada (Figura 3A). Quantificação de relativa distância migrada 24 horas pós incorporação (Figura 3B) não mostra nenhuma diferença na migração entre GFP-posit<html> ive e células, células nonnucleofected GFP-negativas (Figura 3C), indicando que nucleofection por si só não perturbar a migração. Também não há diferença significativa na extensão da migração entre neuroblastos nucleofected e neuroblastos migram directamente para fora de explantes de RMS (dados não mostrados). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissecção da neuroblastos RMS. (A) Representação esquemática da RMS neuroblasto dissecação. Para uma descrição detalhada, consulte o texto. (B) células RMS isolado de rato são imunopositivas para os fabricantes de neuroblastos migratórios DCX e tubulina βlll. Bar, 20 mM. (C) As células que migram de rato RMS explantes expressar a neuroblasto migratório marcadores DCX e PSA-NCAM. Bar, de 20 um.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Rato neuroblasto nucleofection. Dissociated rato RMS neuroblastos foram nucleofected com Pmax-GFP, avaliação reagregada, embebido numa matriz tridimensional e deixadas migrar durante 6 h. Neuroblastos migram de um grupo de células avaliação reagregada (superior, as imagens de contraste de fase) mostram alta eficiência de transfecção (de fundo, canal GFP fotos). Os painéis coluna da direita mostrar imagens de ampliação superiores correspondentes às inserções destacadas nos painéis coluna da esquerda. Bares, 20 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:c<html> -width = ONTEÚDO src &quot;6in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 3. Ensaio de migração 3D. (A) Rat neuroblastos foram nucleofected com Pmax-GFP (GFP) ou pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), avaliação reagregada, encaixado na matriz e deixou para migrar para 24 horas. As células foram então fixadas e imunocoradas para a GFP (verde) e βIII tubulina (vermelho). Bar, a 50 mM. (B) de medição de distância de migração usando ImageJ. O aglomerado de células avaliação reagregada é dividida em 6 setores iguais. A distância entre a borda do cluster (linha a tracejado) e a mais distante das células migraram é medido para cada sector. (C) Quantificação da distância migrada em relação por células, as células nucleofected nonnucleofected (GFP-positiva) e de controlo (GFP-negativo) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6 pol&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 4. Monitoramento de migração neuroblastos após shRNA nucleofection. (A) Rat neuroblastos foram nucleofected com um vector de controlo shRNA (pCA-b-EGFPm5 silenciador 3, que também expressa a EGFP 23) ou o mesmo vector contendo um shRNA alvo fascina, uma proteína de agregação da actina 24. As células foram avaliação reagregada mais de 48 horas, embutido na matriz e deixou para migrar para 24 horas. Agregados foram então fixadas e histoquímica para GFP (verde) e βIII tubulina (vermelho). Bar, a 50 mM. (B) fascina eficaz depleção pode ser detectada 50 horas após shRNA nucleofection por análise de Western blot. A actina é mostrado aqui como um controlo de carga (C) A análise quantitativa da distância de migração relativa mostrando que a depleção fascina prejudica significativamente a migração dos neuroblastos. (Média ± SEM; ** p &lt;0,01, n = 3 experiências independentes). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

Migração neuroblastos é um passo crucial na neurogênese pós-natal. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para investigar o papel dos reguladores de candidatos de migração neuroblastos empregando DNA / RNA pequeno hairpin (shRNA) nucleofection e um ensaio de migração 3D com neuroblastos isolados do roedor pós-natal fluxo migratório rostral.

Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

O objetivo geral deste procedimento é transfectar neuroblastos primários pós-natais de roedores para examinar o efeito de proteínas-alvo sobre sua migração. Isso é realizado primeiramente dissecando neuroblastos do fluxo migratório rostral dos roedores. O segundo passo consiste em dissociá-los e transfectá-los por nucleofecção com DNA ou S-H-R-N-A.Em seguida, os neuroblastos são reagregados em gotas suspensas e então cultivados em suspensão por um período apropriado. O passo final consiste em incorporar os aglomerados de neuroblastos reagregados em uma matriz tridimensional e deixá-los migrar. Por fim, utiliza-se microscopia de imagem por imunofluorescência ou microscopia de tempo real para analisar a migração dos neuroblastos.Este método pode ajudar a responder uma questão fundamental na área de neurogênese, como o controle da migração de neuroblastos derivados de células-tronco no cérebro pós-natal. A principal vantagem desta técnica é que ela é relativamente fácil e rápida em comparação com o uso de vetores virais, que podem ser desafiadores e demorados. Após sacrificar uma ninhada de ratos P6 a P7, faça uma incisão ântero-posterior na pele ao longo da sutura sagital mediana, do nariz até o cerebelo, com uma lâmina de bisturi em cada rato.Em seguida, retire a pele. Repita a mesma incisão ao longo do crânio. Em seguida, remova cuidadosamente as abas cranianas com pinça e retire delicadamente o cérebro junto com os bulbos olfativos usando uma espátula.Em seguida, corte o terço mais caudal do cérebro e descarte-o. Posteriormente, pique o tecido cerebral em fatias coronais com espessura de 1,4 milímetro utilizando um cortador de tecidos. Transfira as fatias para uma placa contendo meio de dissecação frio.Em seguida, examine as fatias ao microscópio estereoscópico. Separe-as cuidadosamente usando uma agulha. O trajeto migratório rostral aparece como uma área triangular translúcida no centro das secções do bulbo olfativo e como uma pequena área circular.Em fatias cerebrais mais macias, corte a RMS de cada fatia com uma faca microcirúrgica, tomando cuidado para evitar incluir tecido circundante. Em seguida, colete os fragmentos da RMS com uma pipeta Pasteur de plástico e coloque-os em um pequeno recipiente contendo meio de dissecção frio sobre gelo. Em seguida, gire suavemente o recipiente para reunir os fragmentos da RMS no centro do recipiente.Colete os fragmentos com uma pipeta de plástico e transfira-os para um tubo de 15 mililitros. Deixe os fragmentos sedimentarem no fundo do tubo. Substitua o meio de dissecação por dois mililitros de meio de dissociação T tri.Avalie os fragmentos de RMS pipetando suavemente a suspensão de fragmentos para cima e para baixo cerca de 10 vezes usando uma pipeta P1000. Deixe o tubo com os fragmentos de tecido em um banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, pipete novamente a solução 10 vezes e certifique-se de que os fragmentos tenham se dissociado.Em seguida, inative a tripsina adicionando cinco mililitros de DMEM pré-aquecido com 10% de FCS e centrifugue a suspensão celular a 433 ×g durante cinco minutos. Remova o meio em excesso e ressuspenda. Suspenda o pellet celular pipetando suavemente em um mililitro de DMEM pré-aquecido com 10% de FCS e, em seguida, adicione mais quatro mililitros do mesmo meio.Em seguida, realize uma contagem celular. Um mínimo de 2,5 vezes 10 à sexta células é necessário para cada nucleoafecção, enquanto resultados ideais são obtidos utilizando-se de três a quatro vezes 10 à sexta células por nucleoafecção.Centrifugue a suspensão celular a 433 ×g durante cinco minutos. Em seguida, remova o máximo de meio possível neste procedimento. Imediatamente, ressuspenda o pellet celular na solução de afecção nucleotídica para neurônios de rato previamente incubada.À temperatura ambiente, transfira 100 microlitros da suspensão celular para cada tubo EOR contendo SI R-N-A-D-N-A. Em seguida, misture suavemente pipetando duas a três vezes com uma pipeta P 200. A seguir, adicione a amostra na parte inferior do vete de nucleoafinidade, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas.Para a nucleofecção, utilize o programa G-013 para células de rato ou O-005 para células de camundongo. Em seguida, adicione rapidamente um mililitro de DMEM pré-aquecido contendo 10% de FCS à amostra nucleofetada. Transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DMEM pré-aquecido com 10% de FCS, utilizando a pipeta plástica fornecida no kit de nucleofecção.Em seguida, centrifugue a amostra a 433 ×g por cinco minutos. Remova cuidadosamente todo o meio em excesso e ressuspenda o pellet em 25 a 30 microlitros de DMEM pré-aquecido mais 10% de FCS, utilizando uma pipeta P20. Não utilize mais de 30 microlitros de meio.Em seguida, pipete a suspensão em forma de gota na face interna da tampa de uma placa P 35. Em seguida, inverta a tampa sobre a placa P 35 contendo dois mililitros de meio completo. Deixe no incubador a 37 °C com 5% de dióxido de carbono por pelo menos cinco horas.Após cinco horas, transfira as gotas suspensas da tampa para o meio completo no recipiente, utilizando uma pipeta P 1000 com ponteira cortada. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para infecções nucleares de DNA NU, ou 48 horas para afecções nucleares de SI A HRA.Agora, prepare 25 mililitros de meio completo e pré-equipele a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por algumas horas. Enquanto isso, retire as alíquotas congeladas da matriz da membrana basal do congelador a menos 80 graus Celsius e descongele-as sobre gelo na câmara fria. Para cada nucleoafecção, prepare uma placa de seis centímetros contendo até oito lamínulas estéreis de 13 milímetros.Coloque as placas sobre uma caixa de gelo coberta com filme aderente. Para manter a umidade, coloque uma tira de papel-toalha úmido dentro de uma placa de 15 centímetros que será usada para acomodar até três placas de seis centímetros contendo blastocistos com joelho embutido. Em seguida, adicione o meio completo à matriz haw numa proporção de um para três, transfira os agregados celulares reagregados para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 433 ×g por cinco minutos.Em seguida, remova o meio em excesso e ressuspenda o pellet em 10 microlitros de meio completo. Depois, coloque dois microlitros de suspensão de agregados celulares sobre cada lamínula estéril. Adicione 18 microlitros da mistura de meio completo com matriz e use a ponteira da pipeta para espalhar a matriz por toda a lamínula.Deslize imediatamente após colocar o prato de seis centímetros contendo as lamínulas no prato de 15 centímetros. Transfira o prato para o incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 15 a 20 minutos. Após a solidificação da matriz, adicione cuidadosamente cinco mililitros de meio completo a cada prato de seis centímetros e pressione para baixo quaisquer lamínulas flutuantes com a ponta da pipeta, em seguida, incube por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de carbogênio para permitir que o neuroblasto migre para fora dos agregados celulares.Nesta figura, mostra-se que as células isoladas da ZMS de rato são imunopositivas para os marcadores de neuroblastos migratórios DCX e beta três tubulina. E esta figura mostra que os marcadores de neuroblastos migratórios DCX e PSA-NCA são expressos nas células que migram para fora da ZMS de camundongo. Para examinar a migração nuclear de neuroblastos de camundongo, neuroblastos dissociados da ZMS de camundongo foram nucleofetados com GFP, reagregados, incorporados em uma matriz tridimensional e mantidos em migração por seis horas.O neuroblasto que migra para fora de um aglomerado celular reagregado apresenta alta eficiência de transfeção. Aqui, neuroblastos de rato foram nucleofectados com dois plasmídeos diferentes que codificam GFP, reagregados e incorporados em matriz, e deixados migrar por 24 horas. As células foram então fixadas e imunomarcadas para GFP e tubulina beta tr&ecirc;s para medir a dist&acirc;ncia de migra&ccedil;&atilde;o.O aglomerado celular agregado é dividido em seis setores iguais, e a distância entre a borda do aglomerado e a célula mais distante migrada é medida em cada setor. Esta figura mostra a quantificação da distância relativa migrada pelas células afetadas pelo NUCLE positivas para GFP e pelas células controle negativas para GFP não afetadas pelo NUCLE para monitorar a migração de neuroblastos. Após a afetação por S-H-R-N-A, neuroblastos de rato foram afetados pelo NUCLE com um vetor controle S-H-R-N-A ou com o mesmo vetor contendo um alvo de HRNA que fixa e agrupa actina; as células foram então reagregadas por 48 horas, embutidas em matriz e deixadas migrar por 24 horas.Os agregados foram então fixados e submetidos à imunomarcação para GFP e tubulina beta III. A depleção eficaz de fastened pode ser detectada 50 horas após a transfeção dos núcleos com S-H-R-N-A, analisada por Western blot, e a actina é mostrada aqui como controle de carregamento. Abaixo está a análise quantitativa da distância relativa de migração, demonstrando que a depleção de fastened prejudica significativamente a migração de neuroblastos.Após este procedimento, outros métodos como a eletroporação pós-natal podem ser realizados para validar in vivo os resultados obtidos com o ensaio de migração NU Nuclear Affection.

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve um método não-viral de entrega de construções genéticas para uma determinada área do cérebro de roedores vivos. O método consiste na preparação de plasmídios, fabricação micropipeta, a cirurgia de rato neonatal filhote, microinjeção da construção,...

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Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Neste protocolo, descrevemos como injetar a cavidade amniótica do camundongo no E7.5 com lentivírus, levando à transdução uniforme de toda a placa neural, com efeitos mínimos prejudiciais sobre a sobrevivência ou desenvolvimento embrionário.

Placa neural de Murine Alvo por In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) no Dia Embrionário 7.5

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Aprenda a nucleofeção de neuroblastos de roedores para estudar a migração celular in vitro usando DNA/shRNA. Este método eficiente permite analisar o efeito de proteínas-alvo no movimento dos neuroblastos pós-natais.

Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração

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