Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é facilitar a identificação de eventos de enucleação com uma subpopulação de eritroblastos. O primeiro passo é criar uma população enriquecida em eventos de nucleação. Isso é realizado por cultura de eritropoiese in vitro, a longo prazo, a partir de células da medula óssea de baixa densidade isoladas dos fêmures, tíbia e ossos pélvicos de um camundongo não estressado ou cultura de curto prazo.

Começando com ple citos do baço de um camundongo submetido previamente a flebotomia para montar eritropoiese de estresse. As células cultivadas na etapa final da cultura são fixadas, permeadas e coradas com os marcadores fluorescentes de interesse. Essas células são executadas em um citômetro de fluxo de imagem e, em seguida, analisadas para identificar as células submetidas à enucleação na população de células nucleantes, sinalizando e os componentes do citoesqueleto que regulam e medeiam o processo de enucleação podem ser identificados.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia fluorescente, é que o número significativamente maior de células nucleantes pode ser observado e analisado em um curto espaço de tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da eritropoiese, como quais mecanismos moleculares estão envolvidos na nucleação de eritroblastos. Para diferenciar células eritróides de células de medula óssea de baixa densidade, comece adicionando um mililitro de meio de cultura a um tubo de citometria de fluxo estéril.

Em seguida, conecte uma agulha de calibre 25 por cinco oitavos de polegada a uma seringa de tuberculina e lave suavemente o meio de cultura fresco através dos fêmures e tíbia colhidos algumas vezes no tubo de citometria de fluxo. Depois de ajustar o volume de suspensão da célula para cinco mililitros com IMDM, coloque cuidadosamente em cinco mililitros de 1,083 gramas por meio de separação de células de gradiente de densidade mililitro em um tubo de 15 mililitros. Transfira tudo até a marca de dois mililitros para um novo tubo de 15 mililitros e lave a camada buffy coletada com meio de cultura fresco, piolhos e glóbulos vermelhos em três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por cinco minutos em temperatura ambiente após lavar as células em meios de cultura e ressus, suspendendo o pellet na mesma placa, as células em uma placa de cultura de células de seis poços a uma concentração de cinco vezes 10 das quintas células por poço para um volume final de 2,5 mililitros em meio de crescimento e incubar as células a 37 graus Celsius cinco dias após o plaqueamento da cultura.

Conte o número de eritroblastos em cada poço da placa de cultura original e, em seguida, transfira cada poço para tubos cônicos individuais de 15 mililitros correspondentes. Depois de centrifugar as células, aspirar os sobrenadantes e ressuspender os sedimentos em meios de crescimento frescos contendo apenas eritropoietina até uma concentração de duas vezes 10 das quintas células por mililitro. Em seguida, aspire o sobrenadante de uma placa de células MS cinco e adicione as células eritróides aos poços.

Dois dias depois, substitua o sobrenadante por meio de crescimento fresco sem citocinas para eritroblastos de citos PLE de baixa densidade. Use o êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para macerar o baço através de um filtro de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Lave o filtro de células com meio de cultura e ajuste o volume final da suspensão celular para cinco mililitros.

Então, depois de separar as camadas celulares por gradiente de densidade, como acabamos de demonstrar, piolhos os glóbulos vermelhos e lave os citos em sete mililitros de meios de cultura. Em seguida, Resus suspende o pellet em meio de crescimento suplementado com citocinas e incuba as células de uma a cinco vezes 10 para as seis células em um volume final de um mililitro por poço de uma placa de cultura de células de 24 poços durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte.

Transferir células para poços contendo células MS cinco aderidas conforme descrito anteriormente e analisar após seis a oito horas, coletar os eritroblastos dos poços de cultura e fixá-los em 500 microlitros de formaldeído a 3,7% em PBS Resus, suspendendo o pellet com pipetagem suave. Após 15 minutos, girar as células a 2000 GS por 20 segundos em uma microcentrífuga, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 microlitros de PBS. Depois de girar as células na microcentrífuga, aspire novamente o sobrenadante e coloque as células no gelo por pelo menos 15 minutos.

Coloque menos 20 graus Celsius, soluções de acetona armazenadas no gelo. Em seguida, ressuspenda rapidamente e gire as células em uma série de lavagens de acetona, conforme indicado após a lavagem do tampão de fax, incube os pellets de células em 100 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, depois de lavar as células em tampão de fax novamente, suspenda novamente os pellets sustentados em 60 microlitros de tampão de fax contendo drac cinco e execute as amostras em um citômetro de fluxo de imagem coletando pelo menos 10.000 eventos por amostra experimental.

Em seguida, inicie a análise selecionando células com base em sua proporção de campo claro, a proporção do comprimento de seu eixo menor versus seu eixo maior e sua área de campo claro, que é indicativa de seu tamanho. Eventos com um valor de área de campo claro menor que 20 e maior que 200 são principalmente detritos e agregados de células, respectivamente, e são excluídos da análise. Em seguida, analise as células individuais com base em seu valor para o parâmetro RMS de gradiente, que indica a nitidez da imagem, crie uma segunda porta contendo as células com o valor RMS de gradiente maior que o percentil 50 para selecionar as imagens tiradas bem em foco.

Próxima porta, as células com base em seu tamanho, medido por sua área de campo claro e sua positividade para o marcador eritróide TER one 19, conforme medido pelo TER one 19 fluorescente corante, células de parâmetro de pixel médio muito baixo ou muito alto para TER one 19, são agregados celulares não eritróides ou restantes, respectivamente, e são excluídos da análise na próxima etapa. As células são selecionadas com base na intensidade da proporção de cinco DR, na proporção do eixo menor versus o eixo maior de seu núcleo e na intensidade de sua expressão de d dr cinco. DR cinco células negativas principalmente células enucleadas, como reticulócitos e glóbulos vermelhos e células com baixa proporção de arrasto cinco.

A maioria dos dubletos é excluída da marcha de análise. Eles arrastam cinco células positivas para DNA positivo, que são principalmente eritroblastos neste momento. Esses eritroblastos são então analisados com base em sua área TER one 19, que indica o tamanho da célula e sua área média de pixels TER one 19 ou densidade da expressão TER one 19, que indica o brilho de sua coloração TER one 19.

Os eritroblastos ortocromáticos são reconhecidos como pequenas células TER de 19 de altura. Finalmente, uma subpopulação de eritroblastos ortocromáticos é caracterizada por sua baixa razão de aspecto de campo claro e seu alto delta sentu XY TUR um 19. DR cinco conforme definido pela distância entre o centro do reticulócito positivo TUR um 19 incipiente e o centro do núcleo positivo DR cinco junto com o anticorpo contra ela um 19 e a coloração de DNA DRAAK cinco.

As células também são tipicamente coradas para identificar a localização da f actina durante o eritroblasto e a nucleação. É importante notar que a progressão da enucleação pode ser visualizada como células com uma proporção decrescente. Ou seja, as células que se tornam cada vez mais alongadas e com um aumento delta OID xy TUR um 19 arrasto cinco são observados.

A actina F concentra-se no sulco de clivagem durante a nucleação e depois se dissipa quando o núcleo é extrudado. Outras proteínas e estruturas de interesse também podem ser coradas com os anticorpos apropriados ou marcadores fluorescentes para permitir a imagem de seus papéis durante a enucleação. Por exemplo, a formação de microtúbulos polarizados pode ser visualizada em eritroblastos ortocromáticos do tipo selvagem antes de uma nucleação, mas não em eritroblastos tratados com colchicina.

A inibição da polimerização da tubulina pela colchicina diminui a polarização celular, conforme demonstrado pela medição do parâmetro delta OID XYB FDR cinco entre o centro do corpo celular visto no canal Brightfield e o centro da coloração nuclear obtida com DR cinco. Após este procedimento, outros métodos, como a microscopia de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas sobre as interações entre os diferentes tipos de células envolvidas na eritropoiese, como as observadas nas ilhas eritroblásticas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar eventos de enucleação em uma população enriquecida com eritroblastos.