Isolamento de Viável multicelular Glândulas de tecido da planta carnívora, Nepenthes

O objetivo do método apresentado é obter glândulas únicas e puras a partir de tecido vegetal fresco para análise molecular. Isso é realizado primeiramente colhendo uma jarra da planta *Nepenthes*. O tecido é então fixado diretamente em uma plataforma de microamostragem sobre gelo para manter o tecido fresco.

Durante o procedimento de microamostragem, as glândulas são isoladas de maneira precisa e transferidas para o tubo de PCR antes de realizar a análise de PCR quantitativo no material coletado. Em última instância, a tecnologia mecânica de microamostragem é utilizada para obter glândulas únicas e puras de plantas napes, a fim de fornecer rapidamente tecido específico para análises moleculares posteriores. As plantas carnívoras são especialistas entre a flora porque são capazes de digerir proteína animal.

Nosso conhecimento sobre como isso funciona em nível molecular ainda é limitado. Um bom modelo para abordar essa questão é a combinação de imagens do apêndice genial, pois ele possui órgãos distintos, estruturas que produzem glândulas, as quais contribuem para esses processos digestivos. No apêndice.

Essas glândulas estão localizadas dentro das imagens na parte inferior. Para análise molecular, é necessário isolar essas estruturas largas e planas, com diâmetro de aproximadamente 100 a 200 micrômetros, diretamente do tecido fresco. Para tornar o processo mais difícil, as glândulas são cobertas por uma cúpula protetora.

Tendo uma estrutura semelhante a uma garagem, o que exige observações tridimensionais durante a coleta de amostras, bem como uma ferramenta capaz de se mover com delicadeza em três dimensões. Descobrimos que as técnicas atuais de microdissecção não foram desenvolvidas para resolver nossos problemas. Um laser, por exemplo, falhou devido ao alto teor de água no tecido vegetal.

Portanto, decidimos usar e empregar uma nova técnica de microdissecação mecânica chamada aika, especificamente para isolar partes de tecidos ou até mesmo células individuais de estruturas tridimensionais. Ela consiste em um microscópio estereoscópico ou sum nos quais um micromanipulador 3D é integrado de tal forma que pode alcançar facilmente objetos muito planos ou muito altos. Esse micromanipulador move-se junto com o microscópio como um pilar; nas amostras de plantas, frequentemente utilizamos micropipetas capilares.

No entanto, no caso do vidro de apêndice, verificamos que a pinça microferramenta acionada por PTO funciona de maneira mais eficaz para o nosso procedimento. Com o apêndice, a plataforma foi modificada. Um pequeno estágio VXY sustenta um recipiente para relatórios preenchido com gelo, de tamanho suficiente para acomodar tanto a amostra tecidual com seu suporte quanto o local onde a glândula deverá ser depositada.

O gelo garante que os processos de graduação dentro do tecido sejam desacelerados ao ponto de permitir a identificação do estado molecular original do tecido. O seguinte procedimento foi estabelecido a partir da porção inferior de uma imagem. Um fragmento de cerca de um a dois centímetros quadrados é excisado e então achatado.

O tecido é então fixado em um lâmina por meio de fita adesiva dupla face. Esta amostra de tecido é coberta com água livre de RNAses e mantida úmida durante o processo de coleta. A amostra é então posicionada com as glândulas e capuzes protetores voltados para o lado do manipulador.

O ângulo entre a amostra e a ferramenta precisa ser ajustado para que as glândulas fiquem achatadas. Utilizando uma platina universal, a inclinação pode ser ajustada em dois eixos e pode ser corrigida facilmente sob o microscópio. A platina metálica mantém a amostra fria sob o microscópio.

As glândulas são bem distintas. A fluorescência ajuda a reconhecer facilmente o contorno tanto da glândula quanto do capuz protetor. A amostra é observada através de um filtro FSE para o isolamento das glândulas.

Para a extração de RNA, utiliza-se um filtro UV. O posicionamento muito preciso da pinça microcirúrgica é essencial para o isolamento da glândula. Recomenda-se manipular a ferramenta no modo de baixa velocidade.

Com a pinça microcirúrgica, aproxima-se uma glândula e posicionam-se as hastes em suas bordas por meio do joystick; em seguida, fecha-se delicadamente a pinça microcirúrgica. A glândula é então levantada do tecido circundante. Após isolamento preciso, pode-se observar a cavidade intacta, expondo o tecido vascular subjacente.

A glândula isolada é então transferida para o tubo de PCR e depositada no tampão preparado. Para validar este método, determinou-se a expressão gênica da proteína curta da pata de átomo, TAP, que é secretada na película de fluido; o gene pode ser amplificado diretamente a partir das glândulas sem uma extração prévia de DNA genômico. Basta adicionar a mistura de reação de PCR ao tecido isolado.

A série de experimentos envolveu glândulas de imagens de nepenthes submetidas a diferentes tratamentos, bem como amostras de seu tecido epidérmico circundante. Em cada experimento, realizou-se a extração total de RNA. O mRNA obtido foi traduzido em seu cDNA correspondente por meio de transcrição reversa e utilizado na reação subsequente de PCR.

Para amplificar a sequência gênica de interesse, foi utilizada PCR em tempo real para comparar o nível de expressão de TLP nas glândulas e epiderme de nepenthes. Os resultados mostram que o nível de transcrição de TLP é mais alto nas glândulas secretoras em comparação com o tecido epidérmico tanto em Nepenthes allotta quanto em Nepenthes miis, conforme visualizado por uma razão de tecido epidérmico sobre tecido glandular inferior a um, para testar se o contato com a presa poderia induzir a expressão gênica. Os níveis de transcrição de TLP e imagens não tratadas e imagens alimentadas com Drosophila melanogaster foram comparados após a captura da presa.

O tecido epidérmico exibiu uma expressão maior de TLP aqui. O nível de transcrição de TLP nas glândulas e no tecido epidérmico e uma imagem tratada de nepenthes miis foram comparados. A superexpressão da expressão de TLP em ambos os tipos de tecido indica que a produção de proteínas do fluido das jarros pode, de fato, ser induzida pela presa.

Os resultados de PCR sugerem que a alimentação altera efetivamente a expressão de TLP em ambos os tipos de tecido e pode modificar a razão de expressão entre glândula e epiderme. Desenvolvemos um método eficiente para coletar o conteúdo limpo do tecido do apêndice FA e isolamos uma quantidade suficiente de mRNA para realizar experimentos de expressão gênica. Com este novo método desenvolvido, é possível não apenas investigar a transcriptômica nas glândulas do apêndice, mas também abordar a metabolômica e a proteômica.