Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

O objetivo geral deste procedimento é determinar o efeito de um agente farmacológico ou de um estado patológico sobre o tônus vascular induzido pela pressão em artérias mesentéricas de pequena resistência. Isso é realizado primeiramente isolando o arco mesentérico de um modelo murino. O segundo passo consiste na dissecação das artérias de pequena resistência da quarta ordem.

Os próximos passos são a cânulagem, pressurização e incubação do preparado arterial. Em PSS, o passo final é avaliar a integridade fisiológica do preparado arterial, o que se demonstra pelo desenvolvimento espontâneo de tônus vascular e resposta reversível adequada a um vasoconstritor e a um vasodilatador. Por fim, pode-se medir a constrição induzida por pressão.

A implicação desta técnica estende-se à terapia ou ao diagnóstico de hipertensão, hipotensão ou disfunção vascular. Porque esta técnica identifica mecanismos fundamentais subjacentes às alterações induzidas pela pressão no tônus vascular, que é um determinante chave da resistência vascular, da perfusão e da pressão sanguínea. Este procedimento será demonstrado pelo Dr. Jja, que é pesquisador pós-doutorando em nosso laboratório.

Inicie este procedimento carregando uma cânula de vidro em um suporte para micropipeta e fixando o suporte ao câmara de perfusão para preparar a câmara de perfusão. Enxágue com água Milli Q, seguido por solução de dissecação por cinco minutos cada. Em seguida, carregue a câmara com dois mililitros de solução de dissecação.

Em seguida, encha cuidadosamente toda a cânula e a tubulação conectada sem gerar bolhas. Prepare dois pontos cirúrgicos, cada um com um nó simples, utilizando pinças rombas sob o microscópio de dissecação. Use pinças de dissecação para carregar ambas as cânulas com nós de sutura parcialmente fechados, ligeiramente afastados da ponta.

Em seguida, realize uma laparotomia mediana em um rato anestesiado, do púbis ao esterno, fazendo primeiro uma incisão na pele e, posteriormente, uma incisão na camada muscular subjacente. É necessário ter cuidado para não lesionar os órgãos intra-abdominais. Amarre ambas as extremidades separadamente para evitar vazamento de quimo e fezes, a fim de prevenir a contaminação da solução banho extracelular.

Em seguida, corte a extremidade proximal do intestino próximo ao poro e a extremidade distal, próxima à junção íleo-cecal. Então, faça uma incisão na mesentérica na sua base, próxima à vascularização alimentar. Em seguida, transfira todo o leito mesentérico do intestino delgado para um béquer de 50 mililitros contendo solução de dissecação gelada e incube por cinco minutos.

Em seguida, lave-o com solução de dissecação fresca para remover o sangue. Agora, fixe a extremidade proximal do intestino no lado direito de uma placa revestida com esmalte, estendendo o restante do intestino em um trajeto no sentido anti-horário. Fixe o segmento para estender o mesentério e expor os vasos sanguíneos sob um microscópio estereoscópico com zoom.

Disseque as artérias mesentéricas pequenas de terceira e quarta ordem paralelas ao intestino delgado, removendo primeiro toda a gordura envolvente próxima ao ramo de segunda ordem. Em seguida, disseque a veia e isole a artéria com um ponto de bifurcação em forma de V. Tenha cuidado para não perfurar o segmento selecionado.

Em seguida, isole um segmento de quatro a cinco milímetros da artéria que seja paralelo ao intestino delgado. Corte todos os ramos de quinta ordem que se inserem no intestino delgado ligeiramente afastados da origem dos ramos e preserve uma porção. Essas porções servirão como pontos de fixação para transferir os segmentos arteriais para uma câmara de perfusão e posteriormente guiar sua cânulação.

Em seguida, corte os segmentos arteriais fazendo duas incisões distais aos ramos de quinta ordem em cada lado da artéria e transfira-os para a câmara de perfusão. Canule uma extremidade dos vasos em uma micropipeta de vidro segurando a ponta do segmento arterial com pinças de dissecação. Deslize a sutura previamente carregada e parcialmente fechada até a extremidade canulada e fixe-a.

Posteriormente, acople uma seringa de 10 mililitros carregada com solução de dissecação à torneira de fechamento conectada a essa cânula. Levante suavemente a seringa. A força da gravidade sobre a solução removerá o sangue intravascular pela extremidade aberta do vaso.

Após remover o sangue intra-arterial, feche a torneira de passagem. Agora, amarre a extremidade distal dos vasos em uma segunda cânula de vidro aproximando cuidadosamente a outra cânula o máximo possível da extremidade não amarrada do segmento arterial. Deslize a sutura previamente carregada e parcialmente fechada até a extremidade canulada e fixe-a.

Deve-se ter cuidado para não puxar ou tracionar os segmentos arteriais e certificar-se de que as torneiras de fechamento acopladas a ambas as cânulas estejam fechadas. Transfira a câmara de perfusão para a platina do microscópio invertido equipado com gravação de vídeo em tempo real. Em seguida, conecte a torneira de fechamento da cânula ligada à extremidade proximal do segmento arterial a um dispositivo servocontrolado de regulação de pressão.

Certifique-se de que a torneira de fechamento conectada à outra cânula permaneça fechada para manter a pressão intraluminal estável. Em seguida, conecte o tubo de vácuo ao tubo de perfusão e o orifício de sucção à porta de perfusão da câmara. Inicie a perfusão do vaso com PSS aquecido por meio do aquecedor de solução em linha único a dois mililitros por minuto.

Usando uma bomba peristáltica, ligue o vácuo e mantenha a temperatura do PSS na câmara próxima a 37 graus Celsius. Aumente lentamente a pressão intraluminal de 20 a 100 milímetros de mercúrio. Verifique o vaso quanto a vazamentos utilizando o ajuste automático de pressão do regulador de pressão.

Após isso, avalie o segmento arterial quanto a curvaturas, mantendo a pressão em 100 milímetros de mercúrio. Usando a alavanca de rosca, mova a cânula para endireitar o segmento arterial e não estique excessivamente os segmentos arteriais. Em seguida, reduza a pressão para 70 milímetros de mercúrio para simular a pressão in vivo no arco mesentérico e permita que o segmento arterial se estabilize e desenvolva tônus miogênico.

Neste procedimento, visualize a artéria com uma objetiva de 10 x em um microscópio equipado com uma câmera de vídeo monocromática. Acople o dispositivo da câmera. Meça o diâmetro luminal utilizando um capturador de quadros de vídeo e um sistema em tempo real de detecção de bordas.

Em seguida, registre o diâmetro do vaso e monitore o desenvolvimento do tônus miogênico. Depois disso, reduza a pressão para 20 milímetros de mercúrio e permita que o diâmetro se estabilize. Então, aumente a pressão intraluminal em etapas incrementais, como 20, 40, 60, 80 e 100, e permita que a artéria atinja um diâmetro estável em cada pressão.

No próximo passo, repita a resposta ao estímulo de pressão em PSS livre de cálcio contendo 0,39 milimolar de EGTA e 0,1 milimolar de nitroprussiato de sódio, conforme indicado pelo traçado. O diâmetro das artérias mesentéricas pequenas de ratos diminui espontaneamente quando pressurizadas a 70 milímetros de mercúrio. A adição de um micromolar de acetilcolina aumentou o diâmetro a um valor próximo ao diâmetro inicial. A adição de um micromolar de fenilefrina ao banho do tecido reduziu o diâmetro arterial, e esta figura mostra que a incubação das artérias mesentéricas pequenas em PSS livre de cálcio aumenta o diâmetro arterial. O diâmetro de um único segmento arterial pressurizado em várias pressões de perfusão é mostrado nesta tabela.

Aqui, o diâmetro arterial é registrado continuamente enquanto a pressão intraluminal é aumentada progressivamente na presença de PSS e PSS sem cálcio. Aqui estão as curvas do diâmetro arterial obtidas em cada etapa de pressão, e o gráfico de barras do tônus miogênico alcançado em cada etapa de pressão é mostrado aqui desligado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar o comportamento miogênico de pequenas artérias de resistência.

Após esta técnica, você pode realizar procedimentos adicionais, como a disruptura endotelial e a permeação arterial. Ambos os procedimentos podem responder a questões adicionais sobre o papel do endotélio e do cálcio na regulação do tônus vascular de pequenas artérias de resistência.