Características dos microgéis de polietilenoglicol formados por precipitação são controlados pelo peso molecular dos reagentes

O objetivo geral deste procedimento é formar microgéis de polietileno glicol utilizando uma reação de precipitação fotopolimerizada para uso como veículos de liberação de fármacos e suportes para engenharia de tecidos. Isso é realizado primeiramente preparando os reagentes, incluindo um fotoiniciador, tampões, trietilamina e solução de PEG DL, e aquecendo-os a 37 graus Celsius. O segundo passo é colocar os reagentes em um tubo de centrífuga microcêntrifugo e vórtex-los mantendo a temperatura de 37 graus Celsius.

Em seguida, o sulfato de sódio é misturado e a solução é exposta à luz UV para realizar a reticulação por 30 segundos. Após a reticulação, formar-se-á uma camada turva na parte superior da solução, que contém os microgéis. O passo final consiste em adicionar PBS à mistura e centrifugar para formar um pellet.

Por fim, a microscopia e a dispersão dinâmica de luz são utilizadas para medir o tamanho dos microgéis, e a densidade é medida usando um gradiente de densidade de dextrina. Além disso, a quantidade de inchamento é calculada pela medição dos pesos úmido e seco dos microgéis. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como emulsão, suspensão e técnicas de dispersão, é que os microgéis formados por reação de precipitação apresentam um baixo índice de polidispersão, sem o uso de solventes orgânicos ou estabilizantes; as condições brandas da reação de precipitação, as propriedades personalizáveis dos microgéis e a baixa viscosidade para injeções os tornam adequados para aplicações em NVivo.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de engenharia de tecidos e medicina regenerativa, como a fabricação de scaffolds com tamanho uniforme e baixo índice de polidispersão. As implicações desta técnica podem estender-se à terapia de liberação de fármacos, pois os fatores de crescimento presentes nos medicamentos podem ser facilmente encapsulados. Para começar, pese 500 miligramas do fotoiniciador e adicione a 100 mililitros de água desionizada para obter uma solução de 0,5%.

Proteja a solução da luz UV e aqueça-a a 40 graus Celsius, agitando constantemente por aproximadamente uma hora, para dissolver completamente o iniciador fotossensível. Após a dissolução completa, filtre esterilmente a solução passando-a por um filtro de 0,22 mícron e armazene-a a quatro graus Celsius, no escuro, até o momento do uso. Em seguida, aqueça previamente a trietilamina a 37 graus Celsius para reduzir sua viscosidade.

Em seguida, adicione 612 microlitros desse volume juntamente com 260 microlitros de ácido clorídrico seis molar a 39,4 mililitros de PBS e ajuste o pH para 7,8 estéril. Filtre a solução final através de um filtro de 0,22 mícron e armazene-a a 37 graus Celsius até o momento do uso. Com base no trabalho de Sony em todos os acro lte, prepare os precursores de PEG segundo os métodos publicados e armazene o produto final a menos 20 graus Celsius sob Argonne. Imediatamente antes do uso, prepare um mililitro de uma solução de diacrilato de Peg a 200 miligramas por mililitro adicionando lentamente 0,8 mililitros do PBS com trietanolamina e ácido clorídrico a 200 miligramas de diacrilato de Peg.

Além disso, logo antes do experimento, pese 213 miligramas de sulfato de sódio e dissolva em um mililitro de água deionizada. Para preparar uma solução 1,5 molar, aqueça a solução a 37 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, vortexe a solução até que esteja completamente dissolvida. Após a dissolução, filtre tanto a solução final de sulfato de sódio quanto a solução de PEG diacrilato a 37 graus Celsius através de filtros de 0,22 mícron.

Combine 127,5 microlitros de PBS com trietilamina e ácido clorídrico, 10 microlitros do iniciador fotossensível a 0,5% e 25 microlitros da solução de 200 miligramas por mililitro de Peg diacrilato em um tubo microcentrífuga de 1,6 mililitro. Em seguida, adicione quaisquer moléculas desejadas para encapsulação.

Aqueça esses tubos junto com a solução de sulfato de sódio 1,5 molar até 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 87,5 µL da solução preaquecida de sulfato de sódio 1,5 molar ao primeiro tubo da solução de PEG e misture o tubo pipetando a solução de três a cinco vezes. Após a mistura, a concentração de sal será uniformemente distribuída e a solução deverá ficar transparente.

Coloque o tubo sob a luz UV e realize a reticulação por 30 segundos após a etapa de reticulação. Deve haver uma camada turva na parte superior da solução contendo os microgéis. Em seguida, adicione 750 microlitros de PBS ao tubo e misture bem a solução por vortexagem.

Em seguida, centrifugue a mistura a 4.000 vezes a gravidade durante dois minutos para formar um pellet. Após a formação do pellet, remova o SUP natin tomando cuidado para não perturbar o pellet e suspenda os microgéis em PBS fresco. Lave os microgéis um total de cinco vezes com PBS fresco, realizando a centrifugação entre cada lavagem.

Após a lavagem final, remova o sobrenadante e pipete 30 microlitros de microgeis do pellet em um mililitro de água desionizada. Em seguida, sonique a solução de microgel em um banho de ultrassom por uma hora a 50-60 hertz e uma potência de 1,4 ampères. Depois, pipete 15 microlitros da solução de microgel sobre uma lâmina de vidro limpa e gravada com ácido e coloque um lamínula número 1,5 gravada com ácido por cima.

Coloque a lâmina de cabeça para baixo sobre um papel toalha de laboratório e pressione suavemente para remover a solução em excesso e garantir que os microgéis estejam em uma única camada. Em seguida, utilizando um microscópio óptico, capture várias imagens dos microgéis usando uma objetiva de imersão em óleo DIC 100 x. Meça os microgéis para obter um diâmetro representativo.

Calcule o índice de polidispersão utilizando a equação baseada em volume mostrada aqui, na qual N é o número total de microgéis e VI é o volume do microgel. Para medir a densidade média do microgel, prepare primeiro soluções de dextrina a 7, 6, 5, 4, 3 e 1% em água desionizada; as densidades das soluções de dextrina são mostradas aqui. Em seguida, adicione dois mililitros da solução de dextrina a 7% a um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, pipete lentamente dois mililitros da solução de dextrina 6% para formar uma camada distinta sobre a dextrina 7%. Após cinco minutos, adicione dois mililitros da próxima camada, composta por dextrina 5%, e continue dessa maneira até que cada concentração de dextrina tenha sido sobreposta em ordem decrescente de concentração de dextrina. Em seguida, sobreponha cuidadosamente os microgéis acima da solução de dextrina 1%, e centrifugue o gradiente a cinco graus Celsius em 4.000 vezes a gravidade por 10 minutos.

Em seguida, visualize a localização dos microgéis e calcule a densidade dos microgéis de acordo com sua posição entre as camadas. Para medir a massa inchada dos microgéis, primeiro pese previamente um tubo de microcentrífuga e então adicione um mililitro dos microgéis. Lave os microgéis cinco vezes com água desionizada, realizando uma lavagem entre cada etapa.

Centrifugue a amostra por 10 minutos a 4.000 ×g para formar o pellet dos microgéis após a última lavagem. Re-suspenda-os em água desionizada e deixe-os inchar por um mínimo de 48 horas. Após 48 horas, centrifugue os microgéis inchados por 10 minutos a 4.000 ×g e, em seguida, remova todo o sobrenadante.

Em seguida, pese a amostra e registre a massa úmida. Após obter um peso úmido preciso, congele os microgéis a menos 80 graus Celsius e, então, liofilize-os para remover a água e obter a massa seca. Uma vez que toda a água tenha sido sublimada, calcule o teor de água e de polímero nos microgéis utilizando as equações mostradas aqui, onde MS é o peso úmido dos microgéis e MD é o peso seco.

O diâmetro médio dos microgéis de PEG formados utilizando vários pesos moleculares de PEG a 20% é mostrado aqui. O aumento do tempo de exposição à UV também teve um efeito sobre o diâmetro dos microgéis. À medida que o tempo de exposição à UV aumentava, os diâmetros das três formulações mostradas aqui também aumentavam.

A densidade medida por gradientes de dextrina diminuiu com o aumento do peso molecular das moléculas precursoras de peg. Isso também é confirmado no gráfico de teor percentual de água, no qual observou-se que o peg de maior peso molecular possui maior quantidade de água por grama de polímero. Por fim, para demonstrar que os microgéis poderiam ser carregados com proteína conjugada fluorescentemente, uma albumina foi adicionada à mistura antes da polimerização e ficou aprisionada no interior das esferas.

Concentrações crescentes da proteína marcada com fluoróforo aumentaram o índice de polidispersão das esferas, mas o tamanho médio permaneceu constante. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de aquecer todas as soluções a 37 graus Celsius e de realizar vortex e microgéis cuidadosamente para romper quaisquer agregados durante a lavagem e o preparo das lâminas para aquisição de imagens. Após este procedimento, métodos adicionais podem ser realizados para encapsulação de fármacos, a fim de responder perguntas adicionais sobre o efeito da liberação de fármacos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar microgéis de peg DA em condições brandas por meio de reações de precipitação.