Acompanhamento da evolução das Membrane Polaridade, integridade de membrana e intracelulares Ion concentrações no Streptococcus pneumoniae Usando corantes fluorescentes

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar corantes fluorescentes para monitorar mudanças na dinâmica da membrana e nas concentrações de íons intracelulares em um sistema bacteriano. Isso é conseguido primeiro incubando bactérias durante sua fase de crescimento com o flúor de interesse até que ele se equilibre em suas membranas. Em seguida, as bactérias são tratadas com o agente de escolha e sua fluorescência é monitorada.

Os resultados podem mostrar mudanças na despolarização da membrana, integridade da membrana e concentrações de íons intracelulares com base nas mudanças observadas na fluorescência dos corantes indicadores. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas convencionais de eletrofisiologia, como o patch clamping, usado em sistemas eucarióticos, é que as mudanças na dinâmica da membrana e nas concentrações de íons intracelulares agora podem ser monitoradas em bactérias usando fluorescência. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é preciso algum esforço para otimizar as concentrações de corante.

Condições de carregamento e configurações de detecção Comece com células bacterianas. Apenas peletizado em solução de lavagem, primeiro ressuspenda o pellet em pelo menos um mililitro de PBS para 100 milhões de UFC por mililitro, o que é suficiente para cinco amostras. Transfira um mililitro das células lavadas para um tubo de microcentrífuga e adicione 25 microlitros de um filtro molar.

Solução de estoque esterilizada de glicose e incube as células em um bloco de aquecimento a 37 graus Celsius por 15 minutos. A glicose adicionada pode variar de acordo com o experimento. Após 15 minutos, adicione cinco microlitros da morte micromolar de 50 e 10 microlitros de solução PI.

Misture bem as células, pipetando-as para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, divida esta suspensão celular em cinco poços de amostra de uma placa transparente de 96 poços. Carregue a placa em um leitor de placa pré-aquecido definido para detecção de NP de dieback.

Agora monitore o equilíbrio de morte sobre as membranas celulares fazendo medições uma vez por minuto durante 30 a 40 minutos até que a leitura se estabilize em seu valor de pré-tratamento. Em seguida, ejetar a placa e adicionar o agente experimental de sua escolha. Retorne imediatamente a placa ao leitor e continue monitorando a morte e a fluorescência PI pelo período de tempo desejado.

Ao preparar o buffer de carregamento para este procedimento, certifique-se de vortexá-lo brevemente antes de adicionar PBS e Probenecid. Depois de adicionar essas soluções, vortex novamente e embrulhe-o em papel alumínio até um mililitro de suspensão de duas células. Adicione um mililitro de dois x buffer de carregamento.

Isso é suficiente para 10 amostras. Incube a mistura em banho-maria a 37 graus Celsius por 75 minutos, protegida da luz Ao longo de todos esses ensaios. A concentração do corante e o tempo de incubação podem precisar ser ajustados para otimizar o ensaio e o nível de detecção de fluorescência da linha de base, dependendo da espécie bacteriana específica e de outras variáveis do sistema experimental.

Após a incubação, lave as células três vezes para cada lavagem. Pulverize as células a 2.400 Gs por 10 minutos e ressuspenda-as em dois mililitros de PBS contendo um x prônico. Após as três lavagens, incube as células a 37 graus Celsius por mais 30 minutos.

Isso permite que o estro dentro da bactéria hidrolise os grupos éster do corante, tornando o corante ativo dentro da célula. Em seguida, as células removem o snat e os suspendem em dois mililitros de PBS contendo um x Probenecida. Se necessário, a glicose agora pode ser adicionada de volta para reenergizar as bactérias, carregar 200 microlitros das células em um poço de uma placa de 96 poços para cada amostra e carregar a placa em um leitor de pré-aquecimento em uma amostra.

Bem, primeiro estabeleça uma leitura de linha de base nos comprimentos de onda adequados e na taxa de uma leitura por segundo durante um minuto. Em seguida, retire a placa e adicione cerca de cinco microlitros do tratamento de sua escolha. Para isso.

Bem, pipete rapidamente para cima e para baixo algumas vezes para misturar no tratamento e retorne imediatamente a placa ao leitor. Continue fazendo medições pelo tempo desejado. Para analisar os dados, calcule a proporção dos valores fluorescentes para cada ponto no tempo dividindo o valor, um pelo valor dois, e plote os valores da proporção em um gráfico.

Na preparação, crie uma faixa de cinco ou seis tampões de alto potássio com valores de pH de 6,5 a 8,0. Como no procedimento anterior, use um vórtice para preparar o tampão de carregamento de dois x de uma lavagem de cultura de fase logarítmica intermediária e concentre as células. Em seguida, substitua o SNAT por dois mililitros de BS Para fazer uma suspensão de quatro células.

Combine um mililitro da suspensão de quatro células x com um mililitro do buffer de carga de dois x. Agora incube as células em banho-maria a 30 graus Celsius por 40 minutos. Proteja-o da luz.

Agora lave as células três vezes. Pulverize as células conforme mostrado anteriormente. Adicione de volta quatro mililitros de PBS contendo dois x prop Benin e um milimolar de glicose e repita a centrifugação após as três lavagens.

Incube as células a 37 graus Celsius por mais cinco minutos. Para determinar o filtro de fluorescência de fundo, esterilize cerca de 500 microlitros da suspensão bacteriana energizada para remover as bactérias. Em seguida, transfira 200 microlitros do filtrado para uma placa de 96 poços e meça a absorção desse poço por um minuto.

Para obter uma curva de calibração in vivo, gire para baixo 500 microlitros ALI watts das células carregadas e energizadas e resus. Suspenda-os em uma série de tampões de alto potássio de pH diferente para cada amostra, adicione 20 micromolares de risina. Isso equilibra o pH intracelular das células com o pH do tampão circundante.

Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, transfira as amostras para a placa de 96 poços no leitor de placas. Meça a fluorescência de cada amostra por alguns minutos para estabelecer uma leitura de estudo para cada uma. Poço.

Para analisar esses dados, subtraia os valores de fluorescência de fundo e, em seguida, calcule a proporção dos valores de fluorescência dividindo o valor. Um pelo valor dois, plote os valores de proporção para cada tampão de pH para criar a curva de calibração para medir as mudanças no pH intracelular. Carregue amostras de 200 microlitros das células energizadas em uma placa e meça a fluorescência a cada cinco segundos por cinco minutos.

Simultaneamente, adicione 10 CCCP micromolares a uma amostra enquanto adiciona os agentes de interesse às outras amostras. O CCCP é um controle positivo alinhado ao tempo para diminuir o pH intracelular. Retorne imediatamente a placa ao leitor e continue medindo a fluorescência a cada cinco segundos por 10 minutos.

Como controle adicional, adicione 20 micromolares de guarnição NI a todas as amostras para equilibrar o pH das bactérias com o do tampão por mais cinco minutos. Ao explorar a polaridade da membrana, as bactérias precisam ser incubadas com o die back por cerca de 40 minutos para permitir que o corante se equilibre sobre a membrana. Isso é indicado pela diminuição constante da fluorescência que se estabiliza.

O PI não requer equilíbrio, mas junto com o dieback, é útil para monitorar a ruptura da membrana. Concomitantemente com a polaridade, a despolarização e a ruptura da bactéria são indicadas por um aumento na intensidade fluorescente de ambos os corantes por menos de 2:00 da manhã, a proporção de dois sinais fluorescentes é calculada e um aumento ou diminuição nessa proporção corresponde ao cálcio intracelular. Para PBFI am, o potássio intracelular é medido por razões de fluorescência.

O hidrogênio intracelular é medido usando as razões de fluorescência de B-C-E-C-F am. Após a adição do cálcio iono quatro íons, a micina cálcio flui para a célula, causando um aumento da taxa de fluorescência. A adição de valmy tem o efeito oposto, fazendo com que o potássio flua para fora da célula, o que é indicado por uma diminuição na taxa de fluorescência.

B-C-E-C-F permite a medição do pH intracelular primeiras curvas de calibração são feitas em vários tampões de pH conhecido. Uma diminuição na taxa de fluorescência do corante corresponde a uma diminuição no pH. Isso é visto com a adição de prótons de força CCCP, a linha preta, e após a adição de um dissipador de força motriz de prótons a linha azul.

A segunda seta mostra a adição de nissina, que equilibra as concentrações de hidrogênio intracelular e extracelular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a despolarização da membrana, a integridade da membrana e as concentrações intracelulares de íons nas células bacterianas. Você também deve ser capaz de usar este protocolo como ponto de partida para estudar outras propriedades e células bacterianas.