Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

O objetivo geral deste procedimento é criar construções baseadas em fibrina que possam ser usadas para estudar a reorganização celular e do colágeno. Isso é feito isolando primeiro as células safenas venosas humanas do tecido do doador e expandindo-as em cultura. O segundo passo é colar tiras de Velcro em membranas flexíveis.

Na parte inferior de seis placas de poços para criar um espaço quadrado no centro, que conterá a construção. Em seguida, uma mistura de células de trombina de fibrinogênio e grânulos marcados com fluorescência são adicionados ao espaço entre as tiras de Velcro e podem polimerizar para formar um gel. A etapa final é condicionar as células e induzir a formação de matriz orientada aplicando uma deformação cíclica uniaxial à construção ou liberando a deformação estática.

Aparando o gel de fibrina dos postes de Velcro em uma única direção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que descrevem mudanças na reorganização celular e do colágeno, monitorando as construções ao longo do tempo usando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da remodelação do colágeno relacionadas à velocidade de formação e reorientação do colágeno por diferentes tipos de células.

Para começar, adquira tecido de doador humano da saana magna venosa de acordo com as diretrizes para o uso secundário do material. Em seguida, isole as células safenas venosas humanas ou H VSCs do tecido seguindo o protocolo de Schnell et al e armazene-as em nitrogênio líquido. Quando necessário, expanda as células colocando um frasco contendo 250.000 H VSCs de descongelamento rápido em um frasco T 75 com 15 mililitros de crescimento pré-aquecido.

Meio composto por 440 mililitros de DMEM avançado 50 mililitros de soro fetal bovino. Cinco mililitros de 100 X pen strep e cinco mililitros de 200 milimolares L glut max. Troque o meio de crescimento a cada dois ou três dias por aproximadamente duas semanas até que as células estejam confluentes.

Uma vez confluente, colha e divida as células até a passagem. Nove. Utilizar tripsina até que haja um número adequado de células para a experiência planeada. Aproximadamente 1,5 milhão de células são necessárias para cada construção.

Quando um número adequado de células tiver sido cultivado, colha-as a 90% de fluência e suspenda as células em meios de crescimento a 15 milhões de células por mililitro. Coloque-os no gelo até que sejam necessários. Prepare a cola de silicone misturando o elastômero e o agente de cura na proporção de 10 para um.

Use esta cola para prender tiras de sete milímetros por três milímetros presas do lado macio do Velcro à membrana flexível das placas de células flexíveis. Para formar uma forma de cruz com o centro aberto, seque a cola de silicone durante a noite em um forno a 60 graus Celsius para garantir o endurecimento da cola. Em seguida, esterilize a placa adicionando cinco mililitros de etanol a 70% a cada poço e incubando por 30 minutos em temperatura ambiente.

Enxágue os poços três vezes com PBS estéril. Em seguida, remova o PBS dos poços e as tiras de Velcro. Coloque a placa descoberta sob a lâmpada UV de uma capa de cultura de tecidos por 30 minutos para esterilizar as superfícies.

Quando terminar, cubra o prato e mantenha-o estéril até o uso. Em seguida, prepare o meio de engenharia de tecidos adicionando 130 miligramas de ácido állico, dois fosfatos a 500 mililitros de meio de crescimento durante os primeiros sete dias de cultura. Além disso, adicione um miligrama por mililitro de ácido épsilon aminocapróico para evitar que a fibrina se degrade, dissolva o fibrinogênio a uma concentração de 10 miligramas de proteína real por mililitro de meio de engenharia de tecidos suplementado com ácido aminocapróico misturando suavemente.

Então estéril. Filtre a solução de fibrinogênio através de um filtro de seringa de 0,22 mícron e guarde-a no gelo até o uso. Em seguida, preparar a solução de trombina diluindo a trombina de estoque até uma concentração final de 10 unidades internacionais por mililitro em meio de engenharia de tecidos suplementado com ácido aminocapróico e armazená-lo em gelo até o uso.

Em seguida, 100 microlitros da suspensão celular preparada anteriormente em um tubo de microcentrífuga para cada construção de tecido que será feita. Centrifugue as células a 350 vezes G por sete minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 50 microlitros da solução de trombina e adicione quatro microlitros, uma microesfera de poliestireno fluorescente azul para ser usada como marcadores de referência internos. Em seguida, retire 50 microlitros da solução de fibrinogênio em uma ponta de pipeta.

Aumente o volume da pipeta para 100 microlitros e, em seguida, pipete a solução de 50 microlitros de fibrinogênio no tubo da centrífuga. Com a mistura de trombina e células, misture suavemente a trombina e o fibrinogênio retirando a mistura de 100 microlitros para evitar a formação de bolhas. Uma vez que a solução esteja completamente misturada, pipete a mistura de gel para dentro e entre as tiras de Velcro, estamos rapidamente como o tempo gelian típico para os géis de fibrina, uma vez misturados é da ordem de 20 segundos, incube as construções por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora tamponada de dióxido de carbono a 5% para permitir que gelificem.

Em seguida, adicione seis mililitros de meio de engenharia de tecidos com ácido aminocapróico a cada poço e coloque a placa de volta na incubadora. Substitua a mídia a cada dois ou três dias durante os primeiros sete dias. Após uma semana, remova o suplemento de ácido aminocapróico do meio e continue a cultivar os géis com o meio de engenharia de tecidos.

Ainda trocando-o a cada dois ou três dias durante os primeiros cinco dias em cultura, permite que as construções se compactem e se reorganizem sob tensão estática formando fibras colágenas, biaxialmente devido às restrições da fibra para induzir a reorganização do colágeno em uma única direção sob condições estáticas. Primeiro, cultive as células por mais uma semana no dia 12, corte a construção do tecido solta de duas tiras de Velcro em uma única direção. Isso causará tensão na direção oposta à compactação da fibrina.

Alternativamente, para carregamento cíclico, coloque as placas em cima de um conjunto de postes de carregamento em uma placa de base de célula flexível, equipada com uma junta no sexto dia, os postes de carregamento suportarão a membrana flexível dos poços e permitirão que a base dos postes seja puxada para baixo para criar tensão em uma única direção. Em seguida, configure o protocolo de software para aplicar uma deformação cíclica à construção. O programa mostrado aqui é para deformação intermitente semelhante a uma onda senoidal, forçando a construção de zero a 5% de deformação a um hertz por períodos de três horas, alternando com três horas de descanso.

Com o programa preparado, ligue a bomba de vácuo e inicie o programa. O controlador regulará a força do vácuo no sistema, que puxa para baixo as membranas ao redor dos postes de suporte para aplicar tensão cíclica às construções de acordo com o programa. Execute o programa por uma semana, tendo o cuidado de trocar a mídia a cada dois ou três dias, após uma semana de condicionamento, induzir a reorganização do colágeno girando o poste retangular em 90 graus para mudar a direção da tensão por três dias.

Para visualizar a remodelação ativa do colágeno em tempo real, adicione o rastreador de células laranja. Adicione uma concentração de quatro micromolares para corar o citoplasma e CNA 35 OG 4 88. Adicione uma concentração de um micromolar para visualizar as fibras de colágeno.

Essas sondas não interferem na viabilidade celular ou na formação de colágeno. Em seguida, incube as células por uma hora em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a placa de cultura da incubadora e transporte-a para um microscópio confocal de varredura a laser para visualizar células e colágeno.

Tire imagens dos géis na superfície e até aproximadamente 60 mícrons no andaime para visualizar as mudanças na organização nesses níveis ao longo do tempo. Em seguida, retorne a placa para a configuração de condicionamento mecânico dentro da incubadora. Repita este procedimento a cada poucos dias para acompanhar o progresso da reorganização celular em resposta aos estímulos.

As microesferas fluorescentes adicionadas à mistura de fibrinogênio antes da polimerização ficam presas na rede de fibrina e funcionam bem como marcadores de referência para garantir a visualização da mesma área em diferentes pontos de tempo quando cultivadas em condições estáticas e se ligam a todos os quatro postes. Nenhuma fibra real ou orientação celular pode ser vista três dias após o corte de duas das conexões do poste de fibra. A tensão uniaxial causada pela contração alinhou as fibras colágenas mostradas em verde.

As células safenas venosas humanas que foram ciclicamente esticadas em uma única direção por uma semana são mostradas aqui na superfície da construção e 60 mícrons no gel. Quando a direção da deformação foi girada 90 graus, a resposta celular após três dias foi mais rápida na superfície do que no núcleo do tecido. Uma vez dominada a engenharia, essas construções de tecido baseadas em FI podem ser realizadas em cerca de duas horas.