Name: Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda um método rápido para isolar colágeno tipo I de amostras dérmicas em menos de três horas. Esta técnica simplificada reduz drasticamente o tempo de purificação em comparação com métodos tradicionais.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de investigação dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915 para DBC), uma nova Researcher Award do Fundo de Investigação Thrasher (a PAC), um Grant-in-Aid da American Heart Association (12GRNT11910008 para DBC) , uma bolsa de investigação da Fundação das Crianças do Coração (para DBC) e doações para Hospital Cardiológico Fundo das Crianças de Boston Condução, a família de Ryan Endowment, e por David Pullman.

Aqui vamos demonstrar o isolamento de COL1 de pele de cordeiro. Como escrito, este protocolo pode também ser utilizado com êxito para isolar COL1 de coelho e pele humana. 1. Prepare dérmica Amostra <ol><li> Equilibrar todos os reagentes a 4 ° C antes de usar. </li><li> Lavar amostra dérmica (25-50 g) em gelada dH 2 O e remover qualquer lã, pele, cabelo ou com creme depilatório. </li><li> Use uma lâmina de barbear de ponta única para raspar a limpo amostra de tecido conjuntivo e de gordura. </li><li> Lavar a amostra em gelada dH 2 O. </li><li> Corte a amostra de pele em 1 cm x 1 centímetro pedaços com uma lâmina de barbear de ponta única. </li></ol> 2. Remover noncollagenous solubilizado de materiais <ol><li> Pesar 5 g de amostra por tubo de 50 ml e adicionar 30 ml de 0,5 M de acetato de sódio gelada. </li><li> Misturar os tubos durante 1 minuto na configuração 6 m / seg utilizando uma placa de tubo de 50 ml no homogeneizador de bancada. </li><li> Descarte supernatant e repita para um total de 7 ciclos de lavagem de acetato de sódio. </li><li> Lavar a amostra em gelada dH 2 O e misture uma vez para remover o acetato de sódio residual. </li><li> Usar uma espátula para comprimir a amostra de encontro ao lado do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, transferir para um tubo de 50 ml fresco. </li></ol> 3. Colágeno tipo I Extração <ol><li> Tampão citrato de lavar a amostra duas vezes em 2 ml / g de sódio 0,075 M, durante 1 min a 6 m / s na bancada homogeneizador comprimindo a amostra e descartando o sobrenadante depois de cada lavagem. </li><li> Adicionar a 2 ml / g nova porção de tampão de citrato de sódio 0,075 M à amostra. </li><li> Realizar 6 seqüencial 1 min, 6 m / s ciclos de bancada mix homogeneizador de agitação, sem retirar o tampão entre cada ciclo. </li><li> Transfira a espessura, o sobrenadante claro para um tubo de coleta. </li><li> Adicionar um tampão de citrato de sódio 0,075 M adicional de 1 ml / g para a amostra e realizar uma última bancada homogeneizador agitaciclo ção. </li><li> Adicionar este sobrenadante final para um tubo de recolha. </li><li> Centrifuga-se o tubo de colheita de 3.200 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para o topo do compartimento de um peso molecular de 100.000 cortado dispositivo de filtração centrífuga. </li><li> Centrifugar a 3.200 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferir a COL1 purificada a partir do compartimento superior para um tubo cónico limpo e armazenar a 4 ° C. </li></ol>

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<li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.

Um componente importante do presente método é a compressão eficaz repetida da amostra cutânea para remover o excesso de líquido. É essencial para remover tanto quanto possível, de acetato de sódio no passo de 2,5 por compressão da amostra. Usamos uma espátula para compactar a pele contra o lado do tubo, no entanto, gaze também pode ser usado, embora isto exigir a remoção da amostra do tubo e aumentar o tempo necessário para realizar estes passos. Da mesma forma, é importante para comprimir a amostra no passo 3.1, de mod...

Durante décadas, os investigadores e os fornecedores comerciais isolaram COL1 solubilizado a partir de uma variedade de fontes de tecidos, incluindo a pele e tendões usando uma variação de um protocolo de extracção de ácido simples, seguido de neutralização, o que resulta numa libertação de uma matriz de fibrilas COL1 organizados que podem ser utilizados para uma infinidade de aplicações biomédicas 1-4. Embora existam muitos exemplos de aplicações clínicas para COL1, alguns deles empregam COL1 autologously derivados porque a preparação desta proteína requer longas extrações levando dias ou semanas para realizar 5-7. Como resultado, os investigadores e médicos investigação utilizam geralmente caros, preparações comerciais de COL1 que são preparados usando os tecidos não-humanas, tais como rato, bovino, porcino ou cório ou usando pele retiradas de cadáveres ou depois da circuncisão masculina. Para aplicações regenerativas, muitos destes produtos apresentam variabilidade no que diz respeito à sua capacidade para formar sólidomatrizes ou construções de tecidos capazes de suportar a ligação de células e o crescimento. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de um novo método normalizado concebido para extrair rapidamente COL1 a partir de fontes de tecidos autólogos acessíveis e abundantes. Tal método poderia economizar tempo e dinheiro no ambiente de pesquisa, onde COL1 poderia ser extraído do modelo animal de interesse e utilizado para testes pré-clínicos de tecidos artificiais montados em andaimes à base de colágeno. Ao mesmo tempo, ter a opção de usar um rapidamente isolada, COL1 autologously derivado na clínica seria aumentar a segurança geral dos pacientes que, de outra forma recebem alogénicas ou xenogénicas preparações. Para os pacientes que receberam uma preparação autogeneic, este método simplificado seria reduzir bastante o intervalo entre a coleta de biópsia e aplicação de colágeno. Por estas razões, buscamos aperfeiçoar um método de isolamento e purificação COL1 estabelecido há muito tempo usando ag de alta velocidadeacreditação e de exclusão de tamanho de centrifugação. Este método é simples de executar, usando soluções padrão e equipamentos encontrados em muitos laboratórios. Ao empregar a agitação de alta velocidade, o nosso protocolo reduz o tempo necessário para isolar solúvel, dérmica COL1 de aproximadamente 10 dias para menos de 3 horas 8. Importante, este método pode ser facilmente realizada no cenário clínico, a fim de preparar COL1 autologously-derivado para utilização em doentes durante um único conjunto de procedimentos.

<table><tbody><tr><td>Sistema FastPrep-24</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman</td><td>J6-MI</td><td>Rotor de caçamba oscilante para acomodar tubos cônicos de 50 ml a 3.200 x g.</td></tr></tbody></table>

um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo i da pele

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Tipo 1 Solúvel colagénio (COL1) é amplamente utilizado como um substrato adesivo para culturas de células e como um andaime para aplicações de regeneração celular. Clinicamente, esta proteína é amplamente utilizado para a cirurgia estética, injeções dérmicas, enxerto ósseo e cirurgia reconstrutiva. As fontes de COL1 para estes processos são geralmente não-humanos, o que aumenta o potencial para a inflamação e a rejeição, bem como a transmissão da doença de xenobióticos. Em vista disto, um método eficiente e rápido para purificar COL1 de quantidades limitadas de tecidos autologously derivados iria contornar muitos destes problemas, no entanto, os protocolos de isolamento convencionais são demorados e muitas vezes necessitam de grandes quantidades de tecidos colagenosos. Aqui, demonstramos um método de extracção COL1 eficiente que reduz o tempo necessário para isolar e purificar a proteína a partir de cerca de 10 dias para menos de 3 horas. Escolhemos a derme como a fonte de tecido devido à sua disponibilidade durante muitos procedimentos cirúrgicos. Tseu método usa buffers de extração tradicionais combinados com agitação vigorosa e filtração centrífuga para obter altamente pura, COL1 solúvel de pequenas quantidades de cório. Resumidamente, as biópsias da derme são lavados em gelada dH2O após a remoção de gordura, tecido conectivo, e cabelo. As amostras de pele são retirados de proteínas e polissacarídeos noncollagenous usando 0,5 M de acetato de sódio e uma alta velocidade de bancada homogeneizador. O colagénio de sólidos residuais é subsequentemente extraído com um tampão de citrato de sódio 0,075 M com o homogeneizador. Estes extractos são purificados usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que produzem preparações COL1 de qualidade comparável ou superior aos produtos comerciais ou aquelas obtidas através de procedimentos tradicionais. Prevemos que este método vai proporcionar a utilização dos derivados de autologously COL1 para uma multiplicidade de pesquisa e aplicações clínicas.

Este protocolo de isolamento COL1 requer cerca de 2 horas e 15 minutos para ser concluído. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático que representa as principais etapas deste processo. Preparação da amostra e realizando os 7 ciclos de agitações de alta velocidade e lavagens com acetato de sódio leva cerca de 35 minutos (Figuras 1A-C). Realizando uma agitação e enxágüe ciclo com dH2O demora cerca de 5 min (Figuras 1D e 1E). A adição de citrato de sódio e subme...

Procedimentos tradicionais para o isolamento do tipo solúvel 1 colágeno (col1) requerem cerca de 10 dias do início ao fim por causa de incubações tampão longas e trabalhosas resuspensions de fibrilas. Aqui, nós descrevemos um meio para purificar a partir de pequenas biópsias COL1 dérmicos em menos de 3 horas.

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar rapidamente o colágeno do tipo um a partir de uma amostra dérmica. Isso é realizado primeiramente cortando a amostra dérmica em pequenos pedaços. Na segunda etapa, as proteínas e polissacarídeos não colágenos solubilizados são removidos por agitação rápida da amostra dérmica em acetato de sódio.Em seguida, a amostra é lavada com água para remover todos os vestígios de acetato de sódio. Na etapa final, o colágeno tipo um é extraído da amostra dérmica utilizando tampão citrato, seguido de centrifugação para remover quaisquer sólidos remanescentes da amostra e, em seguida, filtrado usando um dispositivo descartável de centrifugação para concentrar o produto final. Em última instância, o colágeno tipo um pode ser posteriormente polimerizado a partir desse concentrado.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela reduz o tempo de isolamento de colágeno tipo I de amostras dérmicas de mais de uma semana para menos de três horas. Comece por lavar uma amostra dérmica de 25 a 50 gramas com água destilada gelada e, em seguida, utilize creme depilatório para remover qualquer lã, pêlo ou cabelo.Em seguida, use uma lâm

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

É descrito um método para a preparação de uma matriz de 3-dimensional constituído por colagénio do tipo I e fibroblastos humanos primários. Este gel organotípica serve como um substrato útil para avaliar a migração celular invasiva porque imita características básicas de estroma de tecido e é susceptível de muitas formas de microscopia.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

A criação de microtecidos funcionais dentro de dispositivos microfluídicos requer a estabilização dos fenótipos celulares, adaptando as técnicas tradicionais de cultura celular às dimensões espaciais limitadas em microdispositivos. A modificação do colágeno permite a deposição camada por camada de conjuntos de colágeno ultrafinos que podem estabilizar células primárias, como hepatócitos, como modelos de tecido microfluídico.

Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Apresenta-se um protocolo para obter matrizes derivadas de células ricas em proteínas da matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Além disso, apresentamos um protocolo que incorpora MMC na geração de co-cultura de pele organotï¿½ica 3D, o que reduz o tempo de cultura, mantendo a maturidade da construção.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de duas formas diferentes de substratos de cultura utilizando colágeno tipo I. Dependendo de como o colágeno é manipulado, moléculas de colágeno ou mantêm a forma bidimensional, não-fibrosa ou remontá em formas tridimensionais, como fibrila. Proliferação celular na tipo I colágeno é drasticamente afectado pela formação de fibrila.

Avaliação da proliferação queratinócito em duas e três dimensões tipo I colágeno substratos

O objetivo deste protocolo é descrever a geração e a análise volumosa de equivalentes vascularizados da pele humana utilizando técnicas acessíveis e simples para a cultura de longo prazo. Na medida do possível, a lógica das etapas é descrita para permitir aos pesquisadores a capacidade de personalizar com base em suas necessidades de pesquisa.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Aqui, apresentamos procedimentos baratos e simples para introduzir vários modelos de pele 3D para pesquisa de rotina em um laboratório de cultura de células. Os pesquisadores podem criar modelos adaptados às suas necessidades sem depender de modelos disponíveis comercialmente.

Construindo modelos de pele para inúmeras aplicações - da monocultura bidimensional (2D) à multicultura tridimensional (3D)

O protocolo a seguir apresenta um método de extrusão baseado em cisalhamento para a fabricação de hidrogéis de colágeno com fibrilas padronizadas em nanoescala, que pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações de engenharia de tecidos.

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

Um grande obstáculo em terapias com células-tronco atuais é determinar o método mais eficaz para entregar essas células para tecidos do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método de entrega de quitosana-base que é eficiente e simples na abordagem, ao mesmo tempo permitindo que as células-tronco adiposas para manter a sua multipotency.

Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

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