Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Este procedimento usa tecido retiniano de camundongo para demonstrar como estabilizar o delicado tecido neural para preservar a integridade estrutural. Durante várias etapas da coloração imuno-histoquímica, primeiro nuclee o olho, remova a córnea e separe a retina da esclera. Faça incisões na ocular da retina para achatar o tecido.

Em seguida, prenda a retina a uma membrana reforçada por anel usando uma transferência de sucção sem manipulação direta para preservar a integridade do tecido. Agora transfira o anel para uma placa de vários poços para coloração. Nossos resultados mostram que esta técnica pode ser usada efetivamente em tecido vivo e fornece um substrato superior para a imagem de proteínas sinápticas em comparação com os metais existentes no manuseio da retina dissecada.

Essas técnicas permitem a transferência de tecidos delicados com o mínimo de manipulação física. Isso reduzirá a chance de distorção e danos. Tivemos essa ideia pela primeira vez quando precisávamos gravar a partir de tecido montado em RD um camundongo, um modelo de degeneração da retina, e essa retina de camundongo é extremamente fina e frágil devido à extensa perda de células causada pela mutação Chief.

Um pós-doutorado em nosso laboratório se juntará a mim na demonstração do procedimento. Primeiro, nuclee os olhos de um camundongo anestesiado e transfira os olhos para uma solução de ringer tamponada oxigenada. Para remover a córnea, segure o olho no limbo com uma pinça e, em seguida, corte um caminho circular ao longo da ora serrata.

Retire a lente com uma pinça para injeções em bolus e registros eletrofisiológicos. Use uma pinça de borda misturada para remover o máximo de vítreo possível. Agora estabilize a ocular segurando a esclera firmemente com uma pinça.

Posicione um segundo conjunto de pinças entre a retina e a ocular. Mova a pinça lentamente ao redor da circunferência. Corte o nervo óptico entre a retina e a ocular e remova a ocular com uma tesoura.

Faça incisões da periferia da retina até o nervo óptico. Alternativamente, para usar toda a retina, faça incisões da periferia até a metade do nervo óptico para encurtar o suporte. Remova a parte excessiva com um torno.

Em seguida, polir superfícies ásperas com uma lixa fina. Remova os pés de baixo do anel. Corte a ponta estreita de uma pipeta de plástico.

Em seguida, transfira o tecido com alguma solução para a membrana. Remova gradualmente a solução enquanto espalha a retina e desdobra o tecido. Agora prenda a retina à membrana com as células ganglionares voltadas para cima.

Corte a ponta de retenção de uma seringa de um mililitro e posicione-a diretamente sob o tecido. Puxe o êmbolo para um volume de cerca de 0,3 mililitros para engrenar fisicamente o tecido dentro da membrana. Puxe algumas pipetas capilares de silicato de boro usando uma resistência de aproximadamente um mega.

Em seguida, quebre suavemente a ponta de cada pipeta de remendo. Em seguida, adicione 0,3 microlitros de solução de corante de estoque selectin a 10 microlitros da solução de campainha tamponada com heaps. Agora coloque a membrana na câmara de gravação perfundida com uma solução de campainha tamponada com pilhas oxigenadas quentes.

Posicione a pipeta contendo corante contra a membrana limitante interna usando um manipulador microm. Avance ainda mais a pipeta para penetrar na membrana limitante interna. Em seguida, injete a solução de coloração em um ou vários locais alvo.

Agora aguarde 10 minutos para que o tecido se recupere da injeção enquanto o visualiza sob iluminação de fluorescência epi. Se desejar, transfira a inserção para uma placa de cultura com fundo de vidro, colocando-a com o lado da retina voltado para baixo. Adicione uma gota de solução heap para manter a amostra úmida.

Além disso, coloque três pontos de graxa a vácuo ao redor do perímetro do anel de plástico para prender firmemente a inserção à placa de cultura. Transfira o prato para o microscópio stage após a fixação, mergulhe a membrana nas soluções de gradiente de sacarose. Extirpar a membrana do anel de inserção de plástico.

Remova o máximo de solução possível com lenços umedecidos Kim e coloque-o no parapeito com a retina voltada para cima. Transferir a paraforma com o tecido para a câmara de criostato e adicionar uma gota de OCT Use o dispositivo de freezer rápido para acelerar o congelamento.

Retire a amostra congelada e vire-a. Agora corte o excesso de OCT congelado. Deixe aproximadamente dois milímetros ao redor da amostra em três lados e milímetros do lado, que será preso ao suporte.

Cubra o lado retiniano exposto com uma gota de OCT, deixando a área anexada livre. Congele a membrana que contém o tecido retiniano. Coloque uma gota de OCT em um anel porta-moedas frio.

Insira imediatamente a amostra congelada na gota. Corte seções de 10 a 20 mícrons a 19 graus Celsius negativos e posicione-as em lâminas de adesão de polilisina quentes. Coloque as lâminas com as seções anexadas em uma plataforma de aquecimento de 41 graus Celsius por dois a três minutos no escuro.

Em seguida, armazene as amostras a 20 graus Celsius negativos. Este experimento ilustra uma caracterização rápida e simples da vasculatura retiniana como uma elaborada rede de vasos sanguíneos que se estendem por várias camadas da retina. Ao combinar uma carga em bolus de iso selectina com marcação de imersão em sulfa rumine, o tecido vivo pode ser visualizado e escaneado quase imediatamente na retina, os vasos sanguíneos podem ser rotulados da camada superficial à profunda.

Em contraste com relativamente bem difusível, a SRH é a selectina que não permeia bem através da membrana limitante interna. Existem várias vantagens da fixação com carbimida sobre a fixação convencional com paraformaldeído ao marcar proteínas sinápticas, por exemplo, após um curto período de fixação com coloração imunofluorescente de carbimida para o marcador sináptico. PSD 95 no IPL tinha uma aparência pontilhada brilhante consistente com a distinção das sinapses individuais.

Em contraste, ao usar fixador de aldeído paraforma convencional, a identificação dos componentes sinápticos é menos clara. Resultados semelhantes foram obtidos nas seções do criostato retiniano. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar um tecido delicado nesta membrana e como aplicar coloração citoquímica na preparação de um mestre.

Você levará 15 minutos para conectar a retina ao filtro.