Name: Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a preparar montagens totais de retina de camundongo para imuno-histoquímica e imagem de proteínas sinápticas. Este protocolo preserva a integridade tecidual delicada usando transferência por sucção sem manipulação direta.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH grant R01-EY020535 (BTS), International Retinal Research Foundation e Karl Kirchgessner Foundation (BTS).

Em todos os procedimentos experimentais, os animais foram tratados de acordo com os regulamentos da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e em conformidade com os protocolos aprovados pelo Weill Cornell Medical College. Os animais foram eutanasiados por dióxido de carbono e subsequente luxação cervical.
1. Dissecção da retina de montagem total
<ol>
	<li>Depois que o camundongo for sacrificado, enuclee seus olhos e coloque-os em solução de Ringer oxigenada com tamponamento HEPES (Tabela 1).</li>
	<li>Remova a córnea cortando em um caminho circular ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena, segurando o olho no limbo com uma pinça. Puxe a lente com uma pinça.</li>
	<li>Remova o máximo de vítreo possível, usando uma pinça de borda embotada. Esta etapa é importante para injeções em bolus e registros eletrofisiológicos; não é necessário para quando se realiza apenas imuno-histoquímica.</li>
	<li>Separe a retina da ocular posicionando uma pinça entre a retina e a ocular, movendo a pinça lentamente ao redor da circunferência. Estabilize a ocular segurando a esclera firmemente com um segundo conjunto de pinças. Corte o nervo óptico no local entre a retina e a ocular para facilitar a separação da retina da ocular.</li>
	<li>A retina pode ser dissecada em pedaços (por exemplo, quartos) ou usada como um todo. Para cortar em pedaços, use uma tesoura para fazer incisões da periferia da retina até o nervo óptico. Alternativamente, para usar toda a retina, faça incisões da periferia até a metade do nervo óptico. As incisões ajudarão a fazer uma preparação plana.</li>
</ol>
2. Montagem em inserção de membrana de PTFE hidrofilizado
<ol>
	<li>Prepare a membrana conforme descrito abaixo. Quando forem realizados registros fisiológicos ou experimentos de injeção de corante, encurte o suporte usando um torno ou um serrote para que o anel restante tenha uma altura de 1 mm. 
	Nota: Os insertos da placa de cultura podem não ser modificados ou modificados (Figura 1A). A escolha da configuração é ditada pelo objetivo do experimento. Para imunocoloração, uma inserção não modificada é adequada.</li>
	<li>Polir superfícies ásperas com lixa fina (grão 300 ou superior).</li>
	<li>(Opcional) Remova os pés embaixo do anel com uma tesoura.</li>
	<li>Para remover quaisquer detritos, enxágue ou sonice a membrana em água destilada por 2-3 min.</li>
	<li>Monte o tecido na membrana (Figura 1A). Coloque o tecido com alguma solução em cima da membrana com uma pipeta de transferência de plástico. Corte a ponta estreita da pipeta, se necessário, para evitar que a amostra de tecido adira à pipeta durante a transferência.</li>
	<li>Prenda a retina com células ganglionares (GCs) para cima: na membrana, remova gradualmente a solução enquanto espalha a retina e desdobra as dobras com uma pinça.</li>
	<li>No lado oposto da membrana, posicione uma seringa vazia (1 ml) diretamente abaixo do tecido. Aplique a sucção puxando o êmbolo para trás até um volume de 0,2-0,3 ml. Aumente a área de superfície de sucção cortando a ponta de retenção da seringa antes de usar. O tecido não requer tratamento adicional para adesão, pois está fisicamente enredado dentro da membrana.</li>
</ol>
3. Injeção em bolus de isolectina Alexa 488
<ol>
	<li>Prepare pipetas de adesivo e solução de coloração. Puxe pipetas de vidro capilar de borossilicato com um extrator Flaming/Brown, com uma resistência de ~1 MΩ. Quebre suavemente a ponta da pipeta.</li>
	<li>Faça a solução de coloração adicionando 0,3 μl de solução estoque de isolectina Alexa 488 a 10 μl da solução de Ringer tamponada com HEPES descrita na etapa 1.2.</li>
	<li>Transfira a amostra para a configuração patch-clamp para injeção (Figura 1C). Colocar a membrana com o tecido ligado na câmara de registo perfundida com solução de Ringer tamponada com HEPES aquecida (37 °C) e oxigenada.</li>
	<li>Coloque a pipeta contendo corante contra a membrana limitante interna (ILM, Figura 2A). Usando o micromanipulador, avance ainda mais a pipeta contra o ILM até que ela penetre nele. Injete a solução de coloração com uma pressão de 10-20 psi por 1 segundo usando um picospritzer. Um ou vários locais podem ser alvo de injeção (Figura 2B). Se não estiver disponível um picospritzer, pode ser utilizada uma seringa de 10 ml para fornecer uma pressão de ar positiva para injeção.</li>
	<li>Incubar o tecido injetado por 10 min. Durante a incubação, o tecido injetado pode ser visualizado sob iluminação de epifluorescência.</li>
	<li>Após a rotulagem, a preparação pode ser levada a um microscópio para geração de imagens. Transfira o inserto para uma placa de cultura com fundo de vidro, colocando o lado da retina voltado para baixo (Figura 1C).</li>
	<li>Adicione uma gota de solução HEPES para manter a amostra úmida.</li>
	<li>Coloque 2-3 pontos de graxa a vácuo ao redor do perímetro do anel de plástico para prender firmemente o inserto no fundo da placa de cultura.</li>
	<li>Transfira o prato para o microscópio stage.</li>
</ol>
4. Fixação de Paraformaldeído e Carbodiimida
<ol>
	<li>Fixe a amostra transferindo o inserto para o fixador por 15 min. Tempos de fixação mais longos ou mais curtos podem ser usados, dependendo da aplicação. Ambos os fixadores podem ser efetivamente usados para fixar GFP, isolectina ou hidrazidas fluorescentes Alexa (por exemplo, usadas para preencher as células em gravações de patch-clamp). 
	Nota: Para fixação, podem ser utilizadas soluções de carbodiimida a 4% ou paraformaldeído a 4%. Para manter a aderência, a fixação deve ser feita após o tecido já ter sido fixado à membrana. O tecido pode ser fixado imediatamente após a montagem ou após registro fisiológico e/ou injeção em bolus.</li>
	<li>Enxágue o tecido em tampão fosfato (PB) por 30 min. Depois disso, o tecido pode ser processado como um todo (etapa 5) ou cortado em seções verticais e depois processado (etapas 6 e 7).</li>
</ol>
5. Imunocoloração de Wholemounts Retinianos
<ol>
	<li>Em uma placa de 24 poços (Figura 1D), bloqueie os pedaços da retina na membrana por 1 hora em uma solução de coloração.</li>
	<li>Dilua os anticorpos primários anti-PSD-95 de camundongo 1:300 na solução de coloração e aplique por 48 horas em temperatura ambiente no escuro. Adicione ~ 100-150 μl de solução de anticorpo em cada poço com o tecido. Para evitar o ressecamento, encha os poços não utilizados com água destilada.</li>
	<li>Enxágue por 20 min em PB, 3x.</li>
	<li>Incubar por 24 horas em anticorpo secundário Alexa 568 anti-camundongo de burro dissolvido 1:500 na solução de coloração.</li>
	<li>Enxágue por 20 min em PB, 3x.</li>
	<li>Coloque o inserto com o tecido corado em uma placa de Petri padrão de 3 cm cheia de solução de PB. Com uma tesoura pequena, corte a parte da membrana que contém a retina do anel.</li>
	<li>Transfira a retina na membrana para uma retina deslizante para cima. Remova o PB, adicione o meio de montagem. Coloque pequenos pedaços de um vidro de lamínula quebrado entre a lâmina e os copos de lamínula para evitar apertos extensos e danos à retina. Coloque a lamínula.</li>
	<li>Sele a lamínula no lugar com esmalte. Mantenha os slides no escuro, na geladeira.</li>
</ol>
6. Seccionamento vertical de tecido montado em membrana
<ol>
	<li>Após a fixação, mergulhe o tecido na membrana nas soluções de gradiente de sacarose de sacarose a 10%, 20% e 30% de sacarose por 30 min, 1 hora e durante a noite, respectivamente. A etapa noturna é realizada a 4 ° C na geladeira, todas as outras etapas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando uma tesoura, remova a membrana com o tecido do anel de inserção de plástico.</li>
	<li>Coloque a membrana cortada no Parafilm com a retina para cima e remova o máximo de solução possível com Kimwipes.</li>
	<li>Colocar o parafilme com o tecido na câmara do criostato e adicionar uma gota de OCT Use o dispositivo de freezer rápido para acelerar o congelamento.</li>
	<li>Retire a amostra congelada e vire-a.</li>
	<li>Cortar o excesso de OCT congelado. Deixar cerca de 2 mm à volta da amostra em três lados e deixar a 5-6 mm do lado que será fixado ao suporte.</li>
	<li>Cubra o lado da retina exposto (lado da membrana) com uma gota de OCT. Deixe a área de fixação livre.</li>
	<li>Congele a membrana com tecido retiniano. Agora a amostra está pronta para ser colocada em um suporte de corte.</li>
	<li>Coloque uma gota de OCT em um anel porta-moedas frio. Insira imediatamente a amostra congelada na gota.</li>
	<li>Corte seções de 10-20 μm de espessura, ajustando a temperatura do criostato em -19 °C. Use lâminas de adesão de polisina quentes (temperatura ambiente). Deixe as lâminas com as seções anexadas em uma plataforma de aquecimento por ~ 2-3 min (41 ° C) no escuro para garantir a adesão firme das seções.</li>
	<li>Coloque as lâminas em uma caixa de armazenamento e mantenha a -20 °C até o uso.</li>
</ol>
7. Imunocoloração de Seções da Retina
<ol>
	<li>Retire as lâminas com as seções do freezer. Deixe-os ficar em temperatura ambiente por 1 min para remover o condensado.</li>
	<li>Circunde as seções com um bloqueador de líquido para criar uma barreira para incubação posterior.</li>
	<li>Coloque as lâminas na caixa de incubação. Cubra o fundo da caixa com água para evitar a evaporação da solução de anticorpos.</li>
	<li>Enxágüe com PB por 5 min.</li>
	<li>Prepare as mesmas soluções de coloração e siga as etapas da etapa 5. A incubação com o anticorpo primário é durante a noite e com o secundário 1 hora. Não use vidro quebrado entre a lamínula e a lâmina.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

A alta biocompatibilidade e transparência da membrana de PTFE hidrofilizada nas soluções é vantajosa ao trabalhar com tecidos vivos. Esta preparação foi usada com sucesso em trabalhos anteriores para gravações de patch-clamp de respostas à luz8-10. Aqui, mostramos como essa abordagem pode ser adotada para análise estrutural da retina de montagem total.
A técnica de carregamento de bolus pode ser usada com eficácia para rotular tecidos vivos. Esta técnica é auxiliada pelo suporte est...

A realização de imuno-histoquímica em tecidos delicados e intactos corre o risco de danos durante o manuseio e a transferência. Isso pode ocorrer em fatias do cérebro ou em outros tecidos finos, como retina degenerada. Além disso, existem certos métodos de fixação tecidual que podem ser vantajosos para a imunomarcação de estruturas neuronais, mas resultam em estabilidade estrutural comprometida, impedindo seu uso. Um exemplo particular disso é a fixação à base de carbodiimida, que é superior para a coloração de receptores e hormônios1-7, mas é comumente evitada devido à instabilidade do tecido fixado.
Aqui, descrevemos um procedimento que utiliza uma membrana de PTFE hidrofilizada para suportar estruturalmente tecidos delicados, fixos ou não fixos, para uma variedade de técnicas de coloração. A membrana de suporte permite a manipulação de tecidos delicados antes e depois da fixação, permitindo várias etapas de processamento, minimizando o risco de danos aos tecidos. No geral, esse método simples para preservar a integridade do tecido oferece a oportunidade de usar técnicas que, de outra forma, poderiam ser evitadas. Como tal, essa abordagem também pode ser usada com sucesso para a preparação de uma ampla variedade de tecidos, como fatias de cérebro, que se tornam frágeis após procedimentos de corte.

<table><tbody><tr><td>Inserto de Cultura de Células Millicell, 12 mm, PTFE hidrofílico (Biopore), 0.4 &mu; m</td><td>Seringa</td><td>de insulina Millipore PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>, tesoura</td><td>de 309659</td><td></td><td>Beckton Dickinson</td> de 1 ml</tr><tr><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td> fórceps<td></td><td>de dissecação</td></tr><tr><td>, Dumont # 55, inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>dissecção</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>sistema de microscópio confocal</td><td>Nikon</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>instrumentos de vidro capilar</td><td>1B150F-4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 da</td> precisão do mundo Instrumento de <td>Sutter de Flaming</td>/Brown<td></td><td></td></tr> Pratos de cultura com fundo de vidro <tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr> Placa <tr><td>de Petri</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência graduada descartáveis</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços, 351147</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Beckton Dickinson de 24 poçosVidro de cobertura, # 1</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de adesão de polisina</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT médio</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Filme de laboratório Parafilm</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo Dow Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Burro anti-mouse Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Isolectina Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Carbodiimida</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>EDC Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Trabalhar com tecidos delicados pode ser um fator complicador na avaliação imuno-histoquímica. Aqui, apresentamos um método que utiliza uma membrana de PTFE hidrofilizada suportada em anel para fornecer suporte estrutural ao tecido vivo e fixo durante o processamento imuno-histoquímico, o que permite o uso de uma variedade de protocolos que, de outra forma, causariam danos ao tecido. Primeiro, isso é demonstrado com o carregamento em bolus de marcadores fluorescentes no tecido retiniano vivo. Este método permite a visualização rápida de estruturas direcionadas, enquanto o suporte da membrana mantém a integridade do tecido durante a injeção e permite a fácil transferência da preparação para imagens ou processamento posteriores.
Em segundo lugar, é descrito um procedimento para coloração de anticorpos em tecido fixado com carbodiimida. Embora a fixação de paraformaldeído seja mais comum, a fixação de carbodiimida fornece um substrato superior para a visualização de proteínas sinápticas. Uma limitação da carbodiimida é que o tecido fixo resultante é relativamente frágil; no entanto, isso é superado com o uso da membrana de suporte. O tecido da retina é usado para demonstrar essas técnicas, mas elas podem ser aplicadas a qualquer tecido frágil.

São demonstrados aqui dois experimentos representativos que se beneficiam do uso de uma membrana de PTFE hidrofilizada para suportar a retina em preparação de montagem inteira durante procedimentos de coloração. O primeiro experimento ilustra o método para caracterização rápida e simples da vasculatura retiniana, uma rede elaborada de vasos sanguíneos que se estende por múltiplas camadas da retina (Figura 2). Esta abordagem combina a carga em bólus de isotectina com a marcação por imersão com SRH. Este é...

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Este procedimento utiliza tecido retiniano de camundongo para demonstrar como estabilizar tecido neural delicado, preservando a integridade estrutural. Durante várias etapas da coloração imunohistoquímica, primeiro nucleie o olho, remova a córnea e separe a retina da esclera. Faça incisões na cúpula ocular retiniana para aplainar o tecido.Em seguida, fixe a retina a uma membrana reforçada com anel utilizando uma transferência por sucção, sem manipulação direta, para preservar a integridade do tecido. Agora, transfira o anel para uma placa de múltiplos poços para coloração. Nossos resultados demonstram que esta técnica pode ser efetivamente utilizada em tecido vivo e fornece um substrato superior para a obtenção de imagens de proteínas sinápticas em comparação com os métodos existentes de manipulação de retina dissecada.Essas técnicas permitem a transferência de tecidos delicados com manipulação física mínima. Isso reduzirá a chance de distorção e danos. Tivemos essa ideia pela primeira vez quando precisamos realizar gravações de tecido montado em lâmina no camundongo RD1, um modelo de degeneração retiniana, e a retina desse camundongo é extremamente fina e frágil devido à perda extensiva de células causada pela mutação no gene *Chief*.Um pós-doutorando do nosso laboratório irá me acompanhar na demonstração do procedimento. Primeiro, enucleie os olhos de um camundongo anestesiado e transfira os olhos para uma solução de Ringer tampada e oxigenada. Para remover a córnea, segure o olho na região do limbo com uma pinça e, em seguida, corte um caminho circular ao longo da ora serrata.Retire a lente com pin&ccedil;as para inje&ccedil;&otilde;es em bolus e grava&ccedil;&otilde;es eletrofisiol&oacute;gicas. Utilize pin&ccedil;as de borda mista para remover o maior volume poss&iacute;vel de humor v&iacute;treo. Agora, estabilize a c&uacute;pula ocular segurando firmemente a esclera com pin&ccedil;as.Posicione um segundo par de pin&ccedil;as entre a retina e a c&uacute;pula ocular. Mova as pin&ccedil;as lentamente ao redor da circunfer&ecirc;ncia. Corte o nervo &oacute;ptico entre a retina e a c&uacute;pula ocular e remova a c&uacute;pula ocular com tesoura.Realize incisões a partir da periferia da retina até o nervo óptico. Alternativamente, para utilizar toda a retina, faça incisões a partir da periferia até a metade do caminho em direção ao nervo óptico para encurtar o suporte. Remova a parte excessiva com um torno.Em seguida, alise as superfícies ásperas com lixa fina. Remova os pés de baixo do anel. Corte a ponta estreita de uma pipeta plástica.Em seguida, transfira o tecido com alguma solução para a membrana. Remova gradualmente a solução enquanto espalha a retina e desdobra o tecido. Agora, fixe a retina na membrana com as células ganglionares voltadas para cima.Corte a ponta de retenção de uma seringa de um mililitro e posicione-a diretamente sob o tecido. Puxe o êmbolo até um volume de aproximadamente 0,3 mililitros para fisicamente englobar o tecido dentro da membrana. Puxe alguns capilares de borossilicato utilizando uma resistência de aproximadamente um megaohm.Em seguida, quebre suavemente a ponta de cada pipeta de patch. A seguir, adicione 0,3 microlitros da solução estoque do corante selectina a 10 microlitros da solução de Ringer tamponada com heaps. Agora, coloque a membrana na câmara de gravação perfundida com solução de Ringer tamponada com heaps aquecida e oxigenada.Posicione a pipeta contendo o corante contra a membrana limitante interna utilizando um micromanipulador. Avance ainda mais a pipeta para penetrar a membrana limitante interna. Em seguida, injete a solução corante em um ou vários locais-alvo.Agora, aguarde 10 minutos para que o tecido se recupere da injeção, observando-o sob iluminação de fluorescência em epifluorescência. Se desejar, transfira o inserto para um recipiente de cultura com fundo de vidro, colocando-o com a retina voltada para baixo. Adicione uma gota de solução heap para manter a amostra úmida.Além disso, coloque três pontos de graxa de vácuo ao redor do perímetro do anel plástico para fixar firmemente o inserto ao recipiente de cultura. Transfira o recipiente à platina do microscópio após a fixação e submerja a membrana nas soluções do gradiente de sacarose. Resseque a membrana do anel de inserto plástico.Remova a maior quantidade possível de solução com lenços de papel Kim e coloque-a sobre a lâmina com a retina voltada para cima. Transfira a lâmina com o tecido para a câmara do criostato e adicione uma gota de meio OCT. Utilize o dispositivo de congelamento rápido para acelerar o congelamento.Desprenda a amostra congelada e vire-a. Agora corte o excesso de OCT congelado. Deixe aproximadamente dois milímetros ao redor da amostra em três lados e milímetros do lado que será fixado ao suporte.Cubra o lado da retina exposta com uma gota de OCT, deixando a área aderida livre. Congele a membrana contendo o tecido retiniano. Coloque uma gota de OCT sobre um anel suporte frio.Insira imediatamente a amostra congelada na gota. Corte seções de 10 a 20 mícrons a menos 19 graus Celsius e posicione-as sobre lâminas de adesão com politlisina aquecidas. Coloque as lâminas com as seções aderidas em uma plataforma de aquecimento a 41 graus Celsius por dois a três minutos no escuro.Em seguida, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Este experimento ilustra uma caracterização rápida e simples da vasculatura retiniana como uma rede elaborada de vasos sanguíneos que se estende por múltiplas camadas da retina. Ao combinar uma administração em bolus de iso-selectina com marcação por imersão em sulfo-ramina, o tecido vivo pode ser visualizado e escaneado quase imediatamente na retina, permitindo que os vasos sanguíneos sejam marcados desde a camada superficial até a camada profunda.Em contraste com o SRH, que é relativamente bem difusível, a selectina não permeia bem através da membrana limitante interna. A fixação com carbimida apresenta várias vantagens em comparação com a fixação convencional com paraformaldeído ao rotular proteínas sinápticas; por exemplo, após um curto período de fixação com carbimida, a coloração imunofluorescente para o marcador sináptico PSD 95 na camada plexiforme interna exibia uma aparência pontilhada brilhante, compatível com a distinção das sinapses individuais.Em contraste, ao utilizar o fixador convencional de paraformaldeído, a identificação dos componentes sinápticos é menos nítida. Resultados semelhantes foram obtidos em cortes criostáticos da retina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um tecido delicado sobre esta membrana e como aplicar a coloração citocímica ao preparo final.Levará 15 minutos para fixar a retina ao filtro.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protocolo Otimizado para Preparação de Montagem Completa da Retina para Imagem e Imunohistoquímica

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