Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Este procedimento utiliza tecido retiniano de camundongo para demonstrar como estabilizar tecido neural delicado, preservando a integridade estrutural. Durante várias etapas da coloração imunohistoquímica, primeiro nucleie o olho, remova a córnea e separe a retina da esclera. Faça incisões na cúpula ocular retiniana para aplainar o tecido.

Em seguida, fixe a retina a uma membrana reforçada com anel utilizando uma transferência por sucção, sem manipulação direta, para preservar a integridade do tecido. Agora, transfira o anel para uma placa de múltiplos poços para coloração. Nossos resultados demonstram que esta técnica pode ser efetivamente utilizada em tecido vivo e fornece um substrato superior para a obtenção de imagens de proteínas sinápticas em comparação com os métodos existentes de manipulação de retina dissecada.

Essas técnicas permitem a transferência de tecidos delicados com manipulação física mínima. Isso reduzirá a chance de distorção e danos. Tivemos essa ideia pela primeira vez quando precisamos realizar gravações de tecido montado em lâmina no camundongo RD1, um modelo de degeneração retiniana, e a retina desse camundongo é extremamente fina e frágil devido à perda extensiva de células causada pela mutação no gene *Chief*.

Um pós-doutorando do nosso laboratório irá me acompanhar na demonstração do procedimento. Primeiro, enucleie os olhos de um camundongo anestesiado e transfira os olhos para uma solução de Ringer tampada e oxigenada. Para remover a córnea, segure o olho na região do limbo com uma pinça e, em seguida, corte um caminho circular ao longo da ora serrata.

Retire a lente com pinças para injeções em bolus e gravações eletrofisiológicas. Utilize pinças de borda mista para remover o maior volume possível de humor vítreo. Agora, estabilize a cúpula ocular segurando firmemente a esclera com pinças.

Posicione um segundo par de pinças entre a retina e a cúpula ocular. Mova as pinças lentamente ao redor da circunferência. Corte o nervo óptico entre a retina e a cúpula ocular e remova a cúpula ocular com tesoura.

Realize incisões a partir da periferia da retina até o nervo óptico. Alternativamente, para utilizar toda a retina, faça incisões a partir da periferia até a metade do caminho em direção ao nervo óptico para encurtar o suporte. Remova a parte excessiva com um torno.

Em seguida, alise as superfícies ásperas com lixa fina. Remova os pés de baixo do anel. Corte a ponta estreita de uma pipeta plástica.

Em seguida, transfira o tecido com alguma solução para a membrana. Remova gradualmente a solução enquanto espalha a retina e desdobra o tecido. Agora, fixe a retina na membrana com as células ganglionares voltadas para cima.

Corte a ponta de retenção de uma seringa de um mililitro e posicione-a diretamente sob o tecido. Puxe o êmbolo até um volume de aproximadamente 0,3 mililitros para fisicamente englobar o tecido dentro da membrana. Puxe alguns capilares de borossilicato utilizando uma resistência de aproximadamente um megaohm.

Em seguida, quebre suavemente a ponta de cada pipeta de patch. A seguir, adicione 0,3 microlitros da solução estoque do corante selectina a 10 microlitros da solução de Ringer tamponada com heaps. Agora, coloque a membrana na câmara de gravação perfundida com solução de Ringer tamponada com heaps aquecida e oxigenada.

Posicione a pipeta contendo o corante contra a membrana limitante interna utilizando um micromanipulador. Avance ainda mais a pipeta para penetrar a membrana limitante interna. Em seguida, injete a solução corante em um ou vários locais-alvo.

Agora, aguarde 10 minutos para que o tecido se recupere da injeção, observando-o sob iluminação de fluorescência em epifluorescência. Se desejar, transfira o inserto para um recipiente de cultura com fundo de vidro, colocando-o com a retina voltada para baixo. Adicione uma gota de solução heap para manter a amostra úmida.

Além disso, coloque três pontos de graxa de vácuo ao redor do perímetro do anel plástico para fixar firmemente o inserto ao recipiente de cultura. Transfira o recipiente à platina do microscópio após a fixação e submerja a membrana nas soluções do gradiente de sacarose. Resseque a membrana do anel de inserto plástico.

Remova a maior quantidade possível de solução com lenços de papel Kim e coloque-a sobre a lâmina com a retina voltada para cima. Transfira a lâmina com o tecido para a câmara do criostato e adicione uma gota de meio OCT. Utilize o dispositivo de congelamento rápido para acelerar o congelamento.

Desprenda a amostra congelada e vire-a. Agora corte o excesso de OCT congelado. Deixe aproximadamente dois milímetros ao redor da amostra em três lados e milímetros do lado que será fixado ao suporte.

Cubra o lado da retina exposta com uma gota de OCT, deixando a área aderida livre. Congele a membrana contendo o tecido retiniano. Coloque uma gota de OCT sobre um anel suporte frio.

Insira imediatamente a amostra congelada na gota. Corte seções de 10 a 20 mícrons a menos 19 graus Celsius e posicione-as sobre lâminas de adesão com politlisina aquecidas. Coloque as lâminas com as seções aderidas em uma plataforma de aquecimento a 41 graus Celsius por dois a três minutos no escuro.

Em seguida, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Este experimento ilustra uma caracterização rápida e simples da vasculatura retiniana como uma rede elaborada de vasos sanguíneos que se estende por múltiplas camadas da retina. Ao combinar uma administração em bolus de iso-selectina com marcação por imersão em sulfo-ramina, o tecido vivo pode ser visualizado e escaneado quase imediatamente na retina, permitindo que os vasos sanguíneos sejam marcados desde a camada superficial até a camada profunda.

Em contraste com o SRH, que é relativamente bem difusível, a selectina não permeia bem através da membrana limitante interna. A fixação com carbimida apresenta várias vantagens em comparação com a fixação convencional com paraformaldeído ao rotular proteínas sinápticas; por exemplo, após um curto período de fixação com carbimida, a coloração imunofluorescente para o marcador sináptico PSD 95 na camada plexiforme interna exibia uma aparência pontilhada brilhante, compatível com a distinção das sinapses individuais.

Em contraste, ao utilizar o fixador convencional de paraformaldeído, a identificação dos componentes sinápticos é menos nítida. Resultados semelhantes foram obtidos em cortes criostáticos da retina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um tecido delicado sobre esta membrana e como aplicar a coloração citocímica ao preparo final.

Levará 15 minutos para fixar a retina ao filtro.