Name: Crônica de Longo Prazo Pseudomonas aeruginosa Infecção das vias aéreas em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Aprenda o método de esferas de ágar para estabelecer infecção crônica por Pseudomonas aeruginosa em camundongos. Esta técnica permite carga bacteriana estável por até um mês, facilitando estudos de infecções pulmonares persistentes.

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Pesquisa no laboratório de Bragonzi foi financiado pela Fundação de Fibrose Cística italiano (CFaCore) e UE-F7-2009-223670. Parte deste trabalho foi realizado em ALEMBIC, um laboratório de microscopia avançada, e mouse histopatologia foi realizada na Unidade de Anatomia Patológica (Instituto Científico San Raffaele).

1. As bactérias que se preparam para a infecção crônica (três e dois dias antes Rato Challenge) <ol><li> Selecione o P. apropriado aeruginosa para ser testado. </li><li> Inocule uma ansa de P. aeruginosa a partir de uma -80 ° C a uma cultura de placa de agar de tripticase de soja (TSA) e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Escolha de uma única colónia e inocular em 5 ml de Caldo de Soja Trypticase (TSB) num encaixe de casquilho tubo de 15 ml e incubar a 37 ° C durante a noite numa incubadora com agitação a 200 rpm. </li></ol> 2. Incorporação bactérias em ágar Beads para a infecção crônica (um dia antes da infecção) <ol><li> Tomar uma pequena alíquota da cultura bacteriana durante a noite, dilui-se a 1:50 em tampão fosfato salino (PBS) e medir a densidade óptica (DO) a 600 nm. </li><li> Dilui-se a cultura durante a noite de bactérias por adição de 2 OD em um novo tubo de pressão com tampa contendo 20 ml de TSB fresco. </li><li> Incubar a 37 ° C durante cerca de 3 -4 h até à fase logarítmica em uma incubadora com agitação a 200 rpm, até um total de 10-15 OD é atingido. </li><li> No entanto, preparar o TSA, feito de TSB com 1,5% de ágar, autoclave e equilibrar-se a 50 ° C em um banho de água. Equilibrar a 150 ml de óleo mineral pesado preautoclaved em um balão de Erlenmeyer a 50 ° C em um banho de água. </li><li> Uma vez que P. aeruginosa alcança a fase log, recolher as células bacterianas por centrifugação a 2.700 xg durante 15 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de bactérias em 1 ml de PBS estéril e vórtice completamente para ressuspender completamente o sedimento. </li><li> Misturar 1 ml de suspensão bacteriana com 9 ml de líquido de TSA pré-equilibradas a 50 ° C. </li><li> Adicionar 10 ml TSA-p aeruginosa mistura de óleo mineral pesado (pré-aquecida a 50 ° C) e agita-se imediatamente, durante 6 minutos à temperatura ambiente. A agitação deve produzir um vórtice visível no óleo. </li><li> Arrefece-se a mistura a 4 ° C, agitou-se à sp mínimoeed durante 35 minutos (Figura 1). </li><li> Repousar a mistura de ágar-esferas de óleo em gelo durante mais 20 min. </li><li> Transferir os grânulos de agar-em 50 ml de tubos Falcon e centrifugar a 2700 x g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Exacta remover o óleo mineral e lavagem com PBS estéril, seis vezes, tal como descrito no passo 2.11. Depois de três lavagens, os grânulos podem ser peletizadas por gravidade em vez de usar a centrífuga. Após a última lavagem, ressuspender as contas em ágar-20-30 ml PBS. </li><li> Tomar uma aliquota de pérolas (cerca de 0,5 ml) e assepticamente homogeneizar. </li><li> Tomar 100 ul dos grânulos homogeneizados e diluídos em 900 ul de PBS estéril. Diluir em série 1:10 até 10 -6. </li><li> Placa de diluição em série em placas de TSA, incluindo a amostra não diluída até 10 -6 e incubar as placas a 37 ° C. </li><li> Meça o diâmetro do talão usando um microscópio de luz invertida em vários campos. O diâmetro do grânulo deve estar entre 100-200 mM ( <strong&gt; Figura 1). </li><li> Armazenar as pérolas durante a noite a 4 ° C. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Visão geral da infecção preparação e mouse contas agar. P. aeruginosa células são ressuspensas em 1 ml de PBS e adicionado a 9 ml de líquido de TSA (50 ° C). Esta mistura é adicionada a 150 ml de óleo mineral pesado a 50 ° C num balão e agitou-se a alta velocidade durante 6 min à temperatura ambiente. Quando o frasco é arrefecido a 4 ° C com uma agitação lenta durante 35 min, o agar solidifica criação de grânulos, e bactérias presentes na mistura são incorporados os grânulos de agar. Detalhe de um grânulo de agar contendo as células bacterianas é mostrado (A). Depois de remover o óleo mineral com várias lavagens utilizando PBS esterilizado, a suspensão de agar-esferas está pronto fou inoculação nos pulmões de camundongos por uma injeção intratraqueal (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . 3. Ratos Challenge com ágar-contas Declaração de Ética: Este protocolo e experimentação siga as orientações do cuidado com os animais e comitê de ética do Instituto Científico San Raffaele. <ol><li> Contar o número de unidades formadoras de colónias (CFU) nas placas de TSA para determinar o número de UFC / ml na suspensão de agar-esferas. Dilui-se os grânulos de agar-com PBS esterilizado a 2-4 x 10 7 UFC / ml para atingir um inoculo óptimo de 1-2 x 10 6 em 50 ul. </li><li> Anestesiar C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 semanas de idade) com cetamina ratos macho (50 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) em 0,9% de NaCl administrada a um volume de 0,002 ml / g de peso corporal pela injecção intraperitoneal. NOTA: A anestesia é considerada adeqliação formal quando o animal permanece ainda em silêncio, não responde a estímulos externos, e tem coração constante e as taxas respiratórias. </li><li> Posicione o mouse na posição supina. Desinfetar o brasão do mouse com etanol 70%. </li><li> Expor a traqueia por um corte vertical da pele e entubar a traqueia com uma agulha estéril, flexível 22 L 0,9 milímetros x 25 mm IV cateter, mantendo a atenção para remover o estilete, enquanto se deslocam para dentro da traqueia. Insira o cateter não muito profundo na traquéia. Pare antes de chegar à carina (bifurcação). </li><li> Tomar imediatamente um volume de 50 mL de suspensão de esferas agar por uma seringa de 1 ml e anexá-lo ao cateter. Empurrar suavemente o êmbolo da seringa, permitindo que os grânulos a serem implantados no pulmão. Feche a incisão usando clipes de sutura. </li><li> Colocar o animal em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente acordado. </li></ol> 4. Ratos Avaliação <ol><li> Observe os ratos diariamente para sinais clínicos, incluindo qualidade da pelagem, postura,deambulação e estado de hidratação. Monitorar o peso corporal por dia. Ratos que perdem ≥ 20% do peso corporal devem ser sacrificados. </li><li> Siga o ponto 5 para coleta de lavado broncoalveolar (LBA) e Pontos de 6 ou 7 para a recolha de pulmões ea análise da CFU total, a análise histológica, a resposta inflamatória em termos de contagem total e diferencial de células no LBA, análise de citocinas e mieloperoxidase (MPO) atividade. </li></ol> 5. Coleção LBA e Análise <ol><li> Eutanásia dos ratos por inalação de CO2. </li><li> Posicione o mouse na posição supina. Desinfetar o brasão do mouse com etanol 70%. </li><li> Expor a traquéia e caixa torácica por um corte vertical da pele. Expor os pulmões, cortando o diafragma. </li><li> Insira um fio de sutura sob a traquéia usando uma pinça e entubar a traqueia com uma estéril, flexível 22 g 0,9 milímetros x 25 mm cateter IV. Puxe as duas pontas do fio de sutura para vincular o cacath para a traquéia e nó a linha ao redor da traquéia. </li><li> Tome um volume de 1 ml de RPMI 1640, utilizando uma seringa de 1 ml e anexá-lo ao cateter. Empurrar o êmbolo da seringa, para lavar os pulmões e imediatamente recuperar o líquido, armazenando-o num tubo de 15 ml. NOTA: Se as citocinas estão a ser analisadas, adicionar inibidores da protease para RPMI 1640. </li><li> Repita este passo três vezes com um total de 3 ml de RPMI. A partir de agora, guarde o LBA no gelo. Vá para a etapa 6 para a coleta e análise dos pulmões. NOTA: Por favor, note que nem todos o líquido será recuperado (2,8 ml no máximo). </li><li> Para a quantificação de bactérias presentes no fluido BAL, a amostra numa pequena alíquota (300 ul), diluído em série 1:10 em PBS estéril, a placa em placas de TSA e incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Contagem total de células utilizando um microscópio óptico de luz invertido diluindo uma alíquota do fluido de BAL de 1:2 com solução Tuerk numa câmara de contagem de células Burker. </li><li> Centrifugar a remaining LBA a 330 xg durante 8 minutos a 4 ° C. Tome-se o sobrenadante para análise de citocinas ELISA, armazenando-se a -80 ° C. Siga os passos de 5,10-5,13 para contagem celular diferencial por cytospin. </li><li> Se o sedimento é vermelho, a lise dos eritrócitos ressuspensão do sedimento em 250-300 mL de tampão de lise de RBC diluído 1:10 em água destilada ultra-puro durante 3 minutos. Neutraliza-se com 2 ml de PBS e centrifugar a 330 xg durante 8 minutos a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em RPMI 10% de soro fetal bovino (FBS). Utilizar um volume que vai proporcionar 1 x 10 6 células / ml, com base no número total de células. </li><li> Colocar as lâminas de microscópio e os filtros em ranhuras apropriadas no cytospin com os filtros de cartão de frente para o centro do cytospin. Pipetar 150 l de cada amostra para os poços apropriados de citospina e centrifugar numa citocentrífuga a 300 xg durante 5 min. </li><li> Mancha slides Romanowsky coloração utilizando um kit comercial, de acordo com a mainstruções de nufacturer e 12 como descrito anteriormente. Siga os passos de 5,14-5,17 para análise da atividade da MPO. </li><li> Centrifuga-se o volume restante de BAL a 380 xg por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ul de cloreto de hexadeciltrimetilamônio 0,5% em água destilada ultra-pura a lisar as células. A suspensão pode ser congelada a -20 ° C durante vários dias antes da realização do ensaio. </li><li> Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C e usa-se o sobrenadante para realizar ensaio de MPO em placas de 96 poços, adicionando a amostra em duplicado a cada poço e, se necessário, também diluições adequadas da amostra. </li><li> Adicionar a cada amostra nos poços num volume igual de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) como um substrato para a peroxidase. Permitir que a reação ocorra no escuro por pelo menos 5 minutos e até que não haja um maior desenvolvimento na cor. </li><li> Parar a reacção por adição de 2 MH 2 SO 4 umª medir o OD a 450 nm. O valor OD será diretamente proporcional à atividade da peroxidase. </li></ol> 6. Medição da carga bacteriana no pulmão e citocinas Análise <ol><li> Imediatamente após a coleta de LBA, pulmões especiais de consumo a partir do mouse, lavá-los em PBS estéril, lóbulos separados, colocá-los em um tubo de fundo redondo com 2 ml de PBS estéril e armazenar no gelo. NOTA: Se as citocinas estão a ser analisadas, adicionar inibidores da protease a PBS, para os tubos. </li><li> Assepticamente homogeneizar pulmões, levar uma pequena alíquota (300 ul) do homogenato, serialmente diluídas 1:10 em PBS, em placas de TSA placa e incubar a 37 ° C durante a noite. Por favor note que a carga total das vias aéreas bacteriana será a soma dos UFCs encontrados em amostras de LBA e pulmão. </li><li> Centrifuga-se o homogeneizado a 16.000 xg, permanecendo durante 30 min a 4 ° C. Leve o sobrenadante para análise de citocinas ELISA, e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 7. O exame histológico &lt;ol&gt; <li> Realizar análise histológica somente nos pulmões em que LBA não foi coletado, para preservar aspecto de pulmão e propriedades. </li><li> Eutanásia o mouse por inalação de CO 2. </li><li> Expor a cavidade torácica de um corte vertical da pele, expor os pulmões, cortando o diafragma. </li><li> Pulmões Especiais de Consumo, lavá-los em PBS, separe os lobos, colocá-los em um tubo contendo formol 5-10 ml a 10% neutro tamponado (formaldeído 4%) e armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz. </li><li> Pulmões Incorporar em parafina, usando procedimentos padrão. </li><li> Corte 5 mm de espessura utilizando um micrótomo. </li><li> Stain lâminas com hematoxilina e eosina e cobrir as lâminas com uma lamela, de acordo com os procedimentos padrão. </li><li> Examinar as lâminas usando um microscópio de campo claro invertido e adquirir imagens ligando o microscópio para uma câmera. </li></ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li>
<li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li>
<li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li>
<li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li>
<li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li>
<li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukavica-Ibrulj%2C+I+%22Methods+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+Humana+Press%22">Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press</a>. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).</li>
<li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.</li>
<li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.</li>
<li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells%2C+their+cytokines+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence.%5BTitle%5D)+AND+%22AJRCCM%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.</a> AJRCCM. In press, (2009).</li>
<li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As etapas críticas do P. preparação aeruginosa-esferas e desafio do mouse são relatados abaixo. A cepa P. aeruginosa utilizado para ratos desafio é crítica. A mortalidade, infecção crônica ou depuração podem diferir significativamente dependendo da cepa bacteriana utilizada para o desafio. O P. aeruginosa RP73 tensão clínico foi preferido em relação a cepa de laboratório de referência PAO1 uma vez que resultou em uma taxa de mortalidade mais baixa...

A fibrose cística (FC) é uma doença genética causada por mutações no transmembrana da fibrose cística condutância gene regulador (CFTR). Este gene codifica para um canal de cloreto expressa na membrana da maior parte das células epiteliais. Destruição bronquiectasia, o entupimento do muco e do parênquima causada principalmente por infecções por Pseudomonas aeruginosa, progressivamente, induzir doença pulmonar grave e mortalidade na maioria dos pacientes com FC 1. Entendimento patogênese CF e um maior desenvolvimento de novas terapias confiar em modelo animal com traços característicos da CF. Vários ratinhos geneticamente modificados, para o gene de CFTR, foram gerados, mas limitações na capacidade destas espécies para recapitular doença pulmonar CF-like e várias outras alterações de órgãos observados em pacientes com FC foi amplamente documentado 2. Desenvolvimento de infecção é um dos principais desafios na CF modelo animal. Os cl literaturainiciais sugerem que uma infecção crónica que durou mais do que um mês pode ser conseguido somente se os ratinhos são inoculados com bactérias incorporados num agente imobilizante tais como agar, agarose, ou algas alginato 3-5. Estes agentes imobilizantes proporcionar as condições microaeróbico / anaeróbias, que permitem que as bactérias crescem na forma de microcolónias, de forma semelhante para o crescimento no muco de doentes CF 6. Este modelo de infecção crônica leva à persistência da bactéria nos pulmões, causando inflamação das vias respiratórias e danos 7. No entanto, dependendo do método utilizado, a estirpe bacteriana e da dose inoculada nos pulmões, a percentagem de ratinhos infectados crónicas e a carga bacteriana nos pulmões recuperado em diferentes pontos de tempo pode variar consideravelmente. Em particular, o principal desafio para a infecção crônica a longo prazo continua a ser a baixa carga bacteriana por P. aeruginosa e o baixo percentual de semanas ratos infectados após o desafio, indicando that células bacterianas são progressivamente apuradas pelo anfitrião. Ao selecionar o P. aeruginosa RP73 tensão clínico de uma coleção de CF isola 8 obtivemos êxito baixa mortalidade, as lesões mais graves, e alta porcentagem de infecção crônica com uma carga bacteriana estável até um mês em ratos C57Bl/6NCrl. Este artigo detalha a metodologia para a incorporação de P. aeruginosa nos grânulos de agar; temos de camundongos infectados por instilação intratraqueal, medido a carga bacteriana nos pulmões e citocinas, recolhidos do fluido BAL e realizado o exame histológico. No geral, este protocolo vai ajudar os pesquisadores na abordagem de questões fundamentalmente importantes na patogênese 8,9 e teste de novas terapias contra o P. aeruginosa infecção crônica 10,11.

<table><tbody><tr><td>Caldo de soja Bacto Tryptic</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulado</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral pesado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de S-(+)-cetamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de xilazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml 25 G 5/8 in&nbsp; 0,5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>Cateter 22 G 0,9 mm x 25 mm</td><td>Pinça Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe - Pontas de 0,5 mm Curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura, Íris, 11 cm, reta</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Clipes de sutura</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura rosca</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel completo inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Câmara descartável de leitura rápida 102 Burker</td><td>Solução Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise RBC</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ citofunil</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus lâminas de microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky conjunto de coloração</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de hexadeciltrimetilamônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96-well EIA/RIA placa</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tetrametilbenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxilina não Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin mais solução alcoólica</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Agitando incubadora</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança de precisão</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento de baixo custo</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de homogeneização</td><td>Ystral</td><td>2366925 (pequeno)</td><td></td></tr> <tr><td>Microscópio óptico invertido Câmera</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>(microscópio)</td> <td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

crônica de longo prazo<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; infecção das vias aéreas em ratos

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Um modelo do rato de infecção crônica das vias aéreas é um elemento essencial na fibrose cística (FC) de pesquisa, embora haja uma série de preocupações sobre o próprio modelo. Fases precoces da infecção e inflamação tem sido amplamente estudado utilizando o modelo de rato de agar-grânulos de Pseudomonas aeruginosa, embora apenas alguns relatórios têm-se centrado na infecção crónica a longo prazo in vivo. O principal desafio para a infecção crónica a longo prazo continua a ser a baixa carga bacteriana por P. aeruginosa e o baixo percentual de semanas ratos infectados após o desafio, indicando que as células bacterianas são progressivamente apuradas pelo anfitrião. Este artigo apresenta um método para a obtenção de infecção crônica eficiente a longo prazo em camundongos. Este método baseia-se na incorporação do p estirpes clínicas aeruginosa no agar-beads in vitro, seguida por instilação endotraqueal em ratos C57Bl/6NCrl. Infecção pulmonar bilateral está associada a SEVeral mensuráveis ​​de leitura-outs incluindo perda de peso, mortalidade, infecção crônica, e na resposta inflamatória. O P. aeruginosa RP73 tensão clínico foi preferido em relação a cepa de laboratório de referência PAO1 uma vez que resultou em uma taxa de mortalidade mais baixa comparativamente, as lesões mais graves, e infecção crônica superior. P. colonização aeruginosa pode persistir no pulmão por mais de três meses. Patologia do pulmão murino se assemelha ao de pacientes com FC com doença pulmonar crônica avançada. Este modelo murino imita mais de perto o curso da doença humana e pode ser utilizado tanto para os estudos sobre a patogénese e para a avaliação de novas terapias.

Quando o protocolo é feito corretamente, o P. aeruginosa ágar-contas vai medir entre 100-200 mM e podem ser observados com um microscópio de luz invertida pipetando um pequeno volume da suspensão de ágar-esferas em um slide. Células bacterianas individuais são visíveis nos grânulos de agar, como mostrado em detalhe na Figura 1. A escolha de P. aeruginosa estirpe utilizada na preparação de agar-pérolas é crítica. Figura 2 e Tabela 1<...

Descreve-se o método de ágar-esferas de estabelecer infecção das vias aéreas persistente a longo prazo crônica Pseudomonas aeruginosa no modelo de mouse.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer uma infecção crônica de longa duração por pseudomonas aerogen no trato respiratório de camundongos. Isso é realizado primeiramente cultivando a linhagem bacteriana de pseudomonas aerogen selecionada. O segundo passo é incorporar as bactérias em pequenas esferas de ágar, misturando-as com ágar e óleo mineral a 50 graus Celsius, e depois resfriando a mistura a quatro graus Celsius sob agitação lenta e contínua.Em seguida, o óleo mineral é removido por várias lavagens com PBS e uma alíquota das microesferas de ágar é homogeneizada e cultivada em placas de ágar. Para determinar o conteúdo bacteriano, o passo final consiste em injetar algumas microlitros da suspensão de microesferas de ágar na traqueia de camundongos para estabelecer uma infecção pulmonar crônica por Pseudomonas aeruginosa. Por fim, o líquido de lavagem broncoalveolar e os pulmões podem ser recuperados em diferentes pontos temporais após o desafio e cultivados em placas de ágar para detectar a porcentagem de camundongos infectados cronicamente e a carga bacteriana nas vias aéreas dos animais sobreviventes. A principal vantagem desses métodos de microesferas de ágar em comparação com os métodos existentes é que eles permitem uma infecção crônica estável de longo prazo em uma alta porcentagem de camundongos, levando à persistência de uma carga bacteriana estável por até um mês.Os métodos AGA bit proporcionam no pulmão do camundongo uma condição microaerófila que permite o crescimento bacteriano na forma de microcolônias. De forma semelhante ao crescimento no muco de pacientes com fibrose cística, esses métodos podem auxiliar pesquisadores no esclarecimento de questões fundamentais sobre a patogênese da fibrose cística e outras doenças respiratórias, bem como no teste de novas terapias contra infecções pulmonares crônicas por Pseudomonas aeruginosa. Os métodos também podem ser utilizados para estabelecer infecção crônica com outros patógenos, incluindo Burkholderia cepacia ou infecções coexistentes com Staphylococcus aureus, ou ainda para experimentos de competição entre diferentes patógenos. Demonstrarão o procedimento Pheno, uma pós-doutoranda, e Camil Riva, um estudante de doutorado no meu laboratório. Três dias antes do desafio com camundongos, inocular um alça cheia de Pseudomonas aeruginosa a partir do cultivo estocado a -80 graus Celsius em uma placa de ágar soja triptona e incubar a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, escolha uma única colônia inoculada em cinco mililitros de caldo nutritivo de soja triptona e incube a 37 graus Celsius durante a noite em um incubador agitado a 200 rpm. Na manhã seguinte, dilua uma pequena alíquota da cultura bacteriana de crescimento noturno em solução salina tamponada com fosfato na proporção de 1:50. Em seguida, meça a densidade óptica a 600 nanômetros.Em seguida, dilua a cultura bacteriana de crescimento prolongado adicionando duas OD da suspensão bacteriana em um novo tubo contendo 20 mililitros de TSB fresco incubado a 37 graus Celsius por aproximadamente três a quatro horas até a fase logarítmica em um incubador com agitação a 200 RPM até que um total de 10 a 50 OD seja atingido. Uma vez que Pseudomonas aeruginosa atinja a fase logarítmica, colete as células bacterianas por centrifugação a 2.700 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Depois disso.Resuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de PBS estéril e vortexie completamente para ressuspendê-lo por completo. Em seguida, misture um mililitro da suspensão bacteriana com nove mililitros de TSA líquido previamente equilibrado a 50 graus Celsius. Adicione esta mistura ao óleo mineral pesado previamente aquecido a 50 graus Celsius.Agite imediatamente por seis minutos à temperatura ambiente. A agitação deve produzir um vórtice visível no óleo. Posteriormente, resfrie a mistura até quatro graus Celsius, sob agitação na velocidade mínima por 35 minutos.Em seguida, mantenha em gelo por mais 20 minutos. Após isso, transfira as pérolas de ágar para tubos cônico de 50 mililitros e centrifugue a 2.700 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Remova com precisão o óleo mineral e lave o pellet de esferas de ágar com PBS estéril. Repita o procedimento seis vezes após três lavagens. As esferas podem ser pelotizadas por gravidade em vez de usar a centrífuga após a última lavagem.Resuspenda as microesferas de ágar em 20 a 30 mililitros de PBS, homogeneizando assépticamente 0,5 mililitros das microesferas. Em seguida, dilua 100 microlitros das microesferas homogeneizadas em 900 microlitros de PBS estéril e realize diluições seriadas. Dilua as microesferas seis vezes, até atingir 10 elevado a menos seis, numa proporção de um para dez.Em seguida, plaque as diluições seriadas nas placas de TSA, incluindo a amostra não diluída. Dilua a amostra até 10 elevado a menos seis e incube as placas a 37 graus Celsius. Meça o diâmetro das microesferas utilizando um microscópio óptico invertido em diversos campos.O diâmetro das esferas deve estar entre 100 e 200 mícrons antes do desafio em camundongos. Conte o número de unidades formadoras de colônia nas placas de TSA para determinar o número de UFC por mililitro na suspensão de esferas de ágar. Em seguida, ajuste o volume das esferas de ágar para duas a quatro vezes 10⁷ UFC/mL, a fim de obter um inóculo ideal de uma a duas vezes 10⁶ em 50 microlitros.Posicione um camundongo macho com seis a oito semanas de idade, previamente anestesiado com quetamina e xilazina, em posição supina sobre uma placa aquecida e desinfete seu pelo com etanol a 70%. Exponha a traqueia por meio de um corte vertical da pele. Em seguida, use pinças para separar os músculos que recobrem a traqueia.Em seguida, aspire até 50 microlitros de suspensão de microesferas de ágar com uma seringa de um mililitro. Depois disso, entube a traqueia com um cateter e acople a seringa de um mililitro contendo a suspensão de microesferas de ágar ao cateter. Empurre suavemente o êmbolo da seringa para permitir que as microesferas sejam implantadas no pulmão.Em seguida, feche a incisão usando clipes cirúrgicos. Neste passo, posicione o camundongo eutanasiado em posição supina e desinfete seu pelo com etanol 70%.Em seguida, exponha a traqueia e a caixa torácica por meio de um corte vertical da pele. Depois disso, exponha os pulmões cortando o diafragma. Insira um fio de sutura sob a traqueia utilizando pin&ccedil;as e entube a traqueia com um cateter.Em seguida, puxe as duas extremidades do fio cirúrgico para fixar o cateter à traqueia, e não o fio ao redor da traqueia. Agora, retire um mililitro do meio de cultura celular utilizando uma seringa de um mililitro e acople-a ao cateter. Empurre o êmbolo da seringa para lavar os pulmões, recolha imediatamente o líquido e armazene-o em um tubo de 15 mililitros.Repita este passo três vezes com um total de três mililitros de meio e, em seguida, mantenha o fluido de lavagem broncoalveolar em gelo para a coleta e análise dos pulmões. Retire os pulmões do camundongo. Enxágue-os em PBS estéril.Em seguida, separe os lobos. Coloque-os em um tubo de fundo redondo com dois mililitros de PBS estéril e mantenha em gelo. Homogeneíze assépticamente os pulmões e em série.Dilua o homogenato em PBS na proporção de um para dez. Em seguida, plaque diluições seriadas, incluindo a amostra não diluída, em placas de TSA e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Retire o líquido de lavado broncoalveolar do gelo e dilua-o com solução de Turk na proporção de um para dois sob um microscópio óptico invertido.Conte o número total de células em uma câmara de contagem de Burker para centrifugação diferencial do fluido de LBA. Centrifugue o fluido de LBA a 330 vezes a gravidade durante oito minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet numa concentração de 1 milhão de células por mililitro em meio de cultura celular contendo 10% de soro bovino fetal. Coloque as lâminas de microscópio e os filtros nas ranhuras apropriadas no citospin, com os filtros de papelão voltados para o centro dele.Pipete 150 microlitros de cada amostra nos poços apropriados da citosina e da centrifusão é citocentrifuga a 300 vezes a gravidade por cinco minutos. Em seguida, deve-se observar um esfregaço de células após a coloração, para que a contagem diferencial possa ser realizada ao microscópio. Esta figura mostra o curso temporal da infecção crônica por Pseudomonas aerogenes com a cepa de referência PA O1 e RP 73.Estirpe clínica para cada ponto temporal. Os histogramas representam a porcentagem de mortalidade induzida pela bacteriemia em vermelho e a sobrevivência em cinza, ou a porcentagem de animais que eliminaram a infecção em branco e aqueles capazes de estabelecer uma infecção crônica em verde. A estirpe clínica Pseudomonas aeruginosa RP73 é mais eficiente em estabelecer uma infecção crônica em comparação com a estirpe laboratorial PAO1.Os camundongos sobreviventes foram eutanasiados nos momentos indicados e os pulmões foram coletados, homogeneizados e cultivados em placas de TSA para determinar a carga bacteriana. As curvas de crescimento das cepas P oh um e RP 73 nos pulmões de camundongos mostram que a quantidade de bactérias três dias após a infecção é maior para P oh um em comparação com RP 73. A partir do sétimo dia em diante, quando a infecção crônica está estabelecida, a carga bacteriana se estabiliza entre 10 à quarta e 10 à quinta UFC por pulmão para ambas as cepas. Após sete dias de infecção crônica com a cepa clínica RP 73, a recrutamento de células inflamatórias no líquido de lavagem broncoalveolar foi avaliado.O número de leucócitos totais é consideravelmente maior em camundongos infectados com RP 73 em comparação com camundongos não infectados. As células mais representadas são os neutrófilos, indicando uma resposta considerável do sistema imunológico inato à infecção crônica. Na caixa abaixo, setas indicam neutrófilos e um macrófago conforme observado em uma gota em uma lâmina após citocentrifugação.Mostram-se aqui colorações com hematoxilina e eosina em cortes histológicos de pulmões de camundongos após sete dias de infecção crônica com microesferas da cepa clínica rp. 73, indicadas por setas, que podem ser observadas no lúmen brônquico e microcolônias de células bacterianas. Nas áreas infectadas, os brônquios e o parênquima pulmonar são caracterizados pelo recrutamento maciço de células inflamatórias.Embora as vias aéreas de um camundongo não infectado estivessem livres de células inflamatórias, o diâmetro e a concentração final dos BES são detalhes muito importantes. Para obter um bom resultado, é fundamental lembrar que o tamanho é afetado pela taxa de direcionamento durante a fase de resfriamento e que a quantidade inicial de bactérias pode influenciar a diluição final das microesferas. Além disso, a seleção de uma linhagem apropriada de pseudomona, que cause baixa mortalidade em camundongos e alta porcentagem de infecção crônica, minimizará o número de camundongos utilizados.Após a infecção de camundongos, é realizada a contagem bacteriana. Além disso, pode-se realizar a resposta inflamatória em termos de contagem total e diferencial de células no líquido bronquial, análise de citocinas no fluido, ensaio de mieloperoxidase e análise histológica, a fim de estudar a resposta da úlcera à infecção bacteriana. Não se esqueça de que o trabalho com patógenos oportunistas como a *Pseudomonas* exige precauções e aplicações que devem ser sempre adotadas, como o uso de luvas, manipulação das bactérias em cabine de segurança biológica e utilização de técnicas estéreis.O desenvolvimento de modelos animais apropriados permitiu a realização de testes pré-clínicos de novas moléculas antibacterianas e anti-inflamatórias. Esta é uma etapa importante para futuras intervenções terapêuticas de infecções pulmonares em pacientes afetados pela fibrose cística ou outras doenças respiratórias.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: de Vries, C. R., et.al. Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica da ferida por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra a inoculação tardia de Pseudomonas aeruginosa luminescente em um camundongo com duas feridas dorsais de espessura total cobertas por um curativo transparente. Isso facilita a formação de biofilmes e o estabelecimento de infecções crônicas. O monitoramento regular da bioluminescência permite quantificar a carga bacteriana e acompanhar...

Desenvolvimento de um modelo de camundongo para infecção crônica de feridas cutâneas por Pseudomonas aeruginosa 

Desenvolvemos um modelo de lesão pulmonar em camundongos por injeção intratraqueal da bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo mimetiza a lesão pulmonar durante a pneumonia e é clinicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

O objetivo deste protocolo é fornecer métodos automatizados para quantificar patologias pulmonares crônicas em um modelo murino de DPOC. O protocolo inclui a exposição de camundongos à fumaça de cigarro (CS), medição da função pulmonar, insuflação dos pulmões e uso de métodos de morfometria para medir o enfisema e a remodelação das pequenas vias aéreas em camundongos.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

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Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

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Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida

Este manuscrito descreve o estabelecimento de um modelo infeccioso de pneumonia em camundongos e a respectiva caracterização da resolução da lesão juntamente com métodos de crescimento de bactérias e instilação intratraqueal. Uma nova abordagem usando citometria de fluxo de alta dimensão para avaliar a paisagem imune também é descrita.

Modelo experimental para avaliar a resolução da pneumonia

Os camundongos são geralmente resistentes a infecções por Mycobacterium abscessus, o que complica a descoberta e o desenvolvimento de antibióticos muito necessários contra infecções pulmonares. Aqui, descrevemos um método de preparação de inóculo e infecção intratraqueal que demonstrou fornecer infecção sustentada em camundongos imunocompetentes.

Preparação de Mycobacterium abscessus embebido em grânulo de ágar para inocular camundongos imunocompetentes por via intratraqueal

Aprenda o método de esferas de ágar para estabelecer infecção crônica por Pseudomonas aeruginosa em camundongos. Esta técnica permite carga bacteriana estável por até um mês, facilitando estudos de infecções pulmonares persistentes.

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