Crônica de Longo Prazo

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer uma infecção crônica de longa duração por pseudomonas aerogen no trato respiratório de camundongos. Isso é realizado primeiramente cultivando a linhagem bacteriana de pseudomonas aerogen selecionada. O segundo passo é incorporar as bactérias em pequenas esferas de ágar, misturando-as com ágar e óleo mineral a 50 graus Celsius, e depois resfriando a mistura a quatro graus Celsius sob agitação lenta e contínua.

Em seguida, o óleo mineral é removido por várias lavagens com PBS e uma alíquota das microesferas de ágar é homogeneizada e cultivada em placas de ágar. Para determinar o conteúdo bacteriano, o passo final consiste em injetar algumas microlitros da suspensão de microesferas de ágar na traqueia de camundongos para estabelecer uma infecção pulmonar crônica por Pseudomonas aeruginosa. Por fim, o líquido de lavagem broncoalveolar e os pulmões podem ser recuperados em diferentes pontos temporais após o desafio e cultivados em placas de ágar para detectar a porcentagem de camundongos infectados cronicamente e a carga bacteriana nas vias aéreas dos animais sobreviventes. A principal vantagem desses métodos de microesferas de ágar em comparação com os métodos existentes é que eles permitem uma infecção crônica estável de longo prazo em uma alta porcentagem de camundongos, levando à persistência de uma carga bacteriana estável por até um mês.

Os métodos AGA bit proporcionam no pulmão do camundongo uma condição microaerófila que permite o crescimento bacteriano na forma de microcolônias. De forma semelhante ao crescimento no muco de pacientes com fibrose cística, esses métodos podem auxiliar pesquisadores no esclarecimento de questões fundamentais sobre a patogênese da fibrose cística e outras doenças respiratórias, bem como no teste de novas terapias contra infecções pulmonares crônicas por Pseudomonas aeruginosa. Os métodos também podem ser utilizados para estabelecer infecção crônica com outros patógenos, incluindo Burkholderia cepacia ou infecções coexistentes com Staphylococcus aureus, ou ainda para experimentos de competição entre diferentes patógenos. Demonstrarão o procedimento Pheno, uma pós-doutoranda, e Camil Riva, um estudante de doutorado no meu laboratório. Três dias antes do desafio com camundongos, inocular um alça cheia de Pseudomonas aeruginosa a partir do cultivo estocado a -80 graus Celsius em uma placa de ágar soja triptona e incubar a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, escolha uma única colônia inoculada em cinco mililitros de caldo nutritivo de soja triptona e incube a 37 graus Celsius durante a noite em um incubador agitado a 200 rpm. Na manhã seguinte, dilua uma pequena alíquota da cultura bacteriana de crescimento noturno em solução salina tamponada com fosfato na proporção de 1:50. Em seguida, meça a densidade óptica a 600 nanômetros.

Em seguida, dilua a cultura bacteriana de crescimento prolongado adicionando duas OD da suspensão bacteriana em um novo tubo contendo 20 mililitros de TSB fresco incubado a 37 graus Celsius por aproximadamente três a quatro horas até a fase logarítmica em um incubador com agitação a 200 RPM até que um total de 10 a 50 OD seja atingido. Uma vez que Pseudomonas aeruginosa atinja a fase logarítmica, colete as células bacterianas por centrifugação a 2.700 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Depois disso.

Resuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de PBS estéril e vortexie completamente para ressuspendê-lo por completo. Em seguida, misture um mililitro da suspensão bacteriana com nove mililitros de TSA líquido previamente equilibrado a 50 graus Celsius. Adicione esta mistura ao óleo mineral pesado previamente aquecido a 50 graus Celsius.

Agite imediatamente por seis minutos à temperatura ambiente. A agitação deve produzir um vórtice visível no óleo. Posteriormente, resfrie a mistura até quatro graus Celsius, sob agitação na velocidade mínima por 35 minutos.

Em seguida, mantenha em gelo por mais 20 minutos. Após isso, transfira as pérolas de ágar para tubos cônico de 50 mililitros e centrifugue a 2.700 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

Remova com precisão o óleo mineral e lave o pellet de esferas de ágar com PBS estéril. Repita o procedimento seis vezes após três lavagens. As esferas podem ser pelotizadas por gravidade em vez de usar a centrífuga após a última lavagem.

Resuspenda as microesferas de ágar em 20 a 30 mililitros de PBS, homogeneizando assépticamente 0,5 mililitros das microesferas. Em seguida, dilua 100 microlitros das microesferas homogeneizadas em 900 microlitros de PBS estéril e realize diluições seriadas. Dilua as microesferas seis vezes, até atingir 10 elevado a menos seis, numa proporção de um para dez.

Em seguida, plaque as diluições seriadas nas placas de TSA, incluindo a amostra não diluída. Dilua a amostra até 10 elevado a menos seis e incube as placas a 37 graus Celsius. Meça o diâmetro das microesferas utilizando um microscópio óptico invertido em diversos campos.

O diâmetro das esferas deve estar entre 100 e 200 mícrons antes do desafio em camundongos. Conte o número de unidades formadoras de colônia nas placas de TSA para determinar o número de UFC por mililitro na suspensão de esferas de ágar. Em seguida, ajuste o volume das esferas de ágar para duas a quatro vezes 10⁷ UFC/mL, a fim de obter um inóculo ideal de uma a duas vezes 10⁶ em 50 microlitros.

Posicione um camundongo macho com seis a oito semanas de idade, previamente anestesiado com quetamina e xilazina, em posição supina sobre uma placa aquecida e desinfete seu pelo com etanol a 70%. Exponha a traqueia por meio de um corte vertical da pele. Em seguida, use pinças para separar os músculos que recobrem a traqueia.

Em seguida, aspire até 50 microlitros de suspensão de microesferas de ágar com uma seringa de um mililitro. Depois disso, entube a traqueia com um cateter e acople a seringa de um mililitro contendo a suspensão de microesferas de ágar ao cateter. Empurre suavemente o êmbolo da seringa para permitir que as microesferas sejam implantadas no pulmão.

Em seguida, feche a incisão usando clipes cirúrgicos. Neste passo, posicione o camundongo eutanasiado em posição supina e desinfete seu pelo com etanol 70%.

Em seguida, exponha a traqueia e a caixa torácica por meio de um corte vertical da pele. Depois disso, exponha os pulmões cortando o diafragma. Insira um fio de sutura sob a traqueia utilizando pinças e entube a traqueia com um cateter.

Em seguida, puxe as duas extremidades do fio cirúrgico para fixar o cateter à traqueia, e não o fio ao redor da traqueia. Agora, retire um mililitro do meio de cultura celular utilizando uma seringa de um mililitro e acople-a ao cateter. Empurre o êmbolo da seringa para lavar os pulmões, recolha imediatamente o líquido e armazene-o em um tubo de 15 mililitros.

Repita este passo três vezes com um total de três mililitros de meio e, em seguida, mantenha o fluido de lavagem broncoalveolar em gelo para a coleta e análise dos pulmões. Retire os pulmões do camundongo. Enxágue-os em PBS estéril.

Em seguida, separe os lobos. Coloque-os em um tubo de fundo redondo com dois mililitros de PBS estéril e mantenha em gelo. Homogeneíze assépticamente os pulmões e em série.

Dilua o homogenato em PBS na proporção de um para dez. Em seguida, plaque diluições seriadas, incluindo a amostra não diluída, em placas de TSA e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Retire o líquido de lavado broncoalveolar do gelo e dilua-o com solução de Turk na proporção de um para dois sob um microscópio óptico invertido.

Conte o número total de células em uma câmara de contagem de Burker para centrifugação diferencial do fluido de LBA. Centrifugue o fluido de LBA a 330 vezes a gravidade durante oito minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet numa concentração de 1 milhão de células por mililitro em meio de cultura celular contendo 10% de soro bovino fetal. Coloque as lâminas de microscópio e os filtros nas ranhuras apropriadas no citospin, com os filtros de papelão voltados para o centro dele.

Pipete 150 microlitros de cada amostra nos poços apropriados da citosina e da centrifusão é citocentrifuga a 300 vezes a gravidade por cinco minutos. Em seguida, deve-se observar um esfregaço de células após a coloração, para que a contagem diferencial possa ser realizada ao microscópio. Esta figura mostra o curso temporal da infecção crônica por Pseudomonas aerogenes com a cepa de referência PA O1 e RP 73.

Estirpe clínica para cada ponto temporal. Os histogramas representam a porcentagem de mortalidade induzida pela bacteriemia em vermelho e a sobrevivência em cinza, ou a porcentagem de animais que eliminaram a infecção em branco e aqueles capazes de estabelecer uma infecção crônica em verde. A estirpe clínica Pseudomonas aeruginosa RP73 é mais eficiente em estabelecer uma infecção crônica em comparação com a estirpe laboratorial PAO1.

Os camundongos sobreviventes foram eutanasiados nos momentos indicados e os pulmões foram coletados, homogeneizados e cultivados em placas de TSA para determinar a carga bacteriana. As curvas de crescimento das cepas P oh um e RP 73 nos pulmões de camundongos mostram que a quantidade de bactérias três dias após a infecção é maior para P oh um em comparação com RP 73. A partir do sétimo dia em diante, quando a infecção crônica está estabelecida, a carga bacteriana se estabiliza entre 10 à quarta e 10 à quinta UFC por pulmão para ambas as cepas. Após sete dias de infecção crônica com a cepa clínica RP 73, a recrutamento de células inflamatórias no líquido de lavagem broncoalveolar foi avaliado.

O número de leucócitos totais é consideravelmente maior em camundongos infectados com RP 73 em comparação com camundongos não infectados. As células mais representadas são os neutrófilos, indicando uma resposta considerável do sistema imunológico inato à infecção crônica. Na caixa abaixo, setas indicam neutrófilos e um macrófago conforme observado em uma gota em uma lâmina após citocentrifugação.

Mostram-se aqui colorações com hematoxilina e eosina em cortes histológicos de pulmões de camundongos após sete dias de infecção crônica com microesferas da cepa clínica rp. 73, indicadas por setas, que podem ser observadas no lúmen brônquico e microcolônias de células bacterianas. Nas áreas infectadas, os brônquios e o parênquima pulmonar são caracterizados pelo recrutamento maciço de células inflamatórias.

Embora as vias aéreas de um camundongo não infectado estivessem livres de células inflamatórias, o diâmetro e a concentração final dos BES são detalhes muito importantes. Para obter um bom resultado, é fundamental lembrar que o tamanho é afetado pela taxa de direcionamento durante a fase de resfriamento e que a quantidade inicial de bactérias pode influenciar a diluição final das microesferas. Além disso, a seleção de uma linhagem apropriada de pseudomona, que cause baixa mortalidade em camundongos e alta porcentagem de infecção crônica, minimizará o número de camundongos utilizados.

Após a infecção de camundongos, é realizada a contagem bacteriana. Além disso, pode-se realizar a resposta inflamatória em termos de contagem total e diferencial de células no líquido bronquial, análise de citocinas no fluido, ensaio de mieloperoxidase e análise histológica, a fim de estudar a resposta da úlcera à infecção bacteriana. Não se esqueça de que o trabalho com patógenos oportunistas como a *Pseudomonas* exige precauções e aplicações que devem ser sempre adotadas, como o uso de luvas, manipulação das bactérias em cabine de segurança biológica e utilização de técnicas estéreis.

O desenvolvimento de modelos animais apropriados permitiu a realização de testes pré-clínicos de novas moléculas antibacterianas e anti-inflamatórias. Esta é uma etapa importante para futuras intervenções terapêuticas de infecções pulmonares em pacientes afetados pela fibrose cística ou outras doenças respiratórias.