Name: Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a gerar mapas de adesão por cisalhamento usando redes microvasculares sintéticas SynVivo em um único experimento. Este método computacional reduz tempo e reagentes comparado às câmaras de fluxo tradicionais.

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Tecnologia SynVivo foi desenvolvido sob concessão # 2R44HL076034 do NHLBI.

1. Priming o dispositivo micro-SynVivo SMN <ol><li> Cada porta (entrada / saída) do dispositivo é constituída por duas portas paralelas - uma para fluir em porções de revestimento de superfície (moléculas de adesão, as matrizes de crescimento, etc) e / ou de células de sementeira e o outro para a execução do ensaio (Figura 1A ). </li><li> Completamente submergir o dispositivo de microfluidos SynVivo-SMN (Figura 1B) em uma placa de Petri contendo estéril desionizada (DI) e colocar o prato num exsicador de vácuo. Permitir que o exsicador para rodar até que todo o ar foi removido dos circuitos do dispositivo. Isso deve levar cerca de 15 min. </li><li> Antes de retirar o dispositivo da água, coloque tubos Tygon (OD de 0,06 &quot;e ID de 0,02&quot;) preparado com água em cada porta do dispositivo com uma pinça de ponta fina. O tubo deve ser de aproximadamente 1 cm em comprimento. O dispositivo pode agora ser removido a partir da água. Figura 1C mostra uma imagem do multenviar um e com o tubo. </li></ol> 2. Revestimento do dispositivo micro com proteína desejada (por exemplo, Avidin) <ol><li> Usando uma pipeta, colocar uma gota de água (cerca de 100 ul) à volta da base do tubo de uma porta de entrada. Remova cuidadosamente o tubo usado para preparar o dispositivo. A gota de água vai impedir que o ar que entra no dispositivo. </li><li> Prepara-se uma seringa de 1 ml carregada com avidina a uma concentração de 20 ug / ml. Conecte a seringa a uma agulha de aço inoxidável 24 G e tubos. Inserir o tubo a uma das portas de entrada do dispositivo. Prenda a porta de entrada não está sendo utilizada com uma braçadeira da mandíbula. </li><li> Injectar avidina a uma taxa de fluxo de 1 mL / min durante 10 min para permitir a perfusão completa do dispositivo. No final do tempo de escoamento, apertar o tubo com o grampo de mandíbula e colocar o dispositivo a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 3. Fluindo o Biotinylated Partículas para experimentos de adesão <ol><li> Permitir que o dispositivovoltar à temperatura ambiente. Colocar o dispositivo sobre um microscópio invertido de fluorescência equipado com um estádio motorizado e uma câmara de alta performance. </li><li> Prepara-se uma solução de 2 mM partículas biotinilados numa concentração de 5 x 10 6 / ml, em partículas de Tampão Fosfato Salino (PBS). Carregar as partículas numa seringa de 1 ml. Prepara-se uma segunda seringa de 1 ml de PBS apenas. Coloque cada seringa em uma bomba de seringa e se conectar a agulha e tubos. </li><li> Usando uma pipeta, colocar uma gota de água (cerca de 100 ul) à volta da base do tubo da porta de entrada. Cuidadosamente remover a tubagem utilizada para o revestimento do dispositivo. A gota de água vai impedir que o ar que entra no dispositivo. </li><li> Insira com cuidado o tubo de partículas para biotinilados e PBS a partir do passo 3.2 em cada uma das portas de entrada. Figura 2A mostra imagem do set-up. </li><li> Começam a injectar partículas biotinilados a um caudal de 2,5 mL / min. Monitorar a porta de entrada no microscópio. Ao primeiro sinaldas partículas, começa a contagem regressiva e continuar o fluxo por 3 min. </li><li> No final dos 3 minutos, parar o fluxo de partículas biotinilados enquanto simultaneamente encarando o fluxo de PBS a uma taxa de fluxo de 2,5 mL / min. Permitir PBS a fluir no dispositivo por 3 min para lavar partículas livres. </li></ol> 4. Aquisição de Imagens e tornando a área de interesse (AOI) Medidas Usando Software Imaging (NIKON Elements) <ol><li> Use a função &quot;imagem grande varredura&quot; no software de imagem para obter a imagem de todo o dispositivo. </li><li> Número sequencialmente as bifurcações do dispositivo e criar uma AOI circular com duas vezes o diâmetro dos canais. Neste caso, definir o diâmetro AOI a 200 um, uma vez o diâmetro do canal é de 100 um. </li><li> Use a função de contagem automática no software de imagem para exportar o número de partículas em cada AOI para uma folha de MS Excel. </li><li> Da mesma forma, usar o recurso de contagem automática para exportar o número de partículas em toda adispositivo. </li></ol> 5. Partículas Análise de Fluxo Utilizando Dinâmica dos Fluidos Computacional (CFD) Modelos <ol><li> Simulações de CFD são executados através de software disponível comercialmente (CFD-ACE +, ESI Inc.) para a topologia dispositivo SynVivo-SMN. Os resultados são armazenados numa base de dados para a análise de observações experimentais. Os resultados da simulação armazenar informações sobre as taxas de cisalhamento de parede, velocidade, fluxo de partículas e de adesão no dispositivo. </li><li> Os resultados de simulação são usados ​​para determinar o número de partículas que entram cada AOI com base em uma dada concentração de partículas de entrada. </li></ol> 6. Geração de cisalhamento Adesão Mapa <ol><li> Calcular% de adesão através da divisão das partículas aderentes na bifurcação das partículas que fluem na bifurcação, como mostrado na equação 6.1. <img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" /> em que o número de partículas aderidas e as partículas fluem são obtidos a partir de protocolo os passos 4.3 e 5.2, respectivamente. </li><li> Traçar o mapa de adesão ao corte com base na taxa de cisalhamento em cada bifurcação das redes obtidas a partir da base de dados na etapa (5.1) e os valores de aderência% obtidos a partir da equação 6.1. </li></ol>

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<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
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</ol>

Taxa de publicação deste artigo patrocinado pela CFD Research Corporation.

Câmaras de fluxo de placas paralelas, proporcionando insights significativos sobre as interacções célula-célula e célula-partículas, sofrem de várias limitações, tais como o elevado consumo de reagentes e a necessidade de vários ensaios experimentais para gerar um mapa de adesão de cisalhamento. O uso de redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SynVivo-SMNs) permite a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em condições que imitam as condições in vivo. Além disso, uma economia sign...

Os ensaios correntes para estudar a célula-célula e as interacções célula-partículas tipicamente envolvem formato bem prato estático, em que as partículas ou as células são incubadas em matrizes de proteínas ou células aderentes. No final do tempo de incubação específico, o número de partículas aderentes ou células são quantificados usando microscopia 1. Mesmo que estes ensaios fornecem um panorama significativo para os processos bioquímicos por trás dessas interações, uma limitação importante é a falta de fluxo de fluido fisiológico (típico da microcirculação) e seu impacto sobre a adesão de partículas. Para superar esta limitação, na câmara de fluxo in vitro têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Um elemento comum destas câmaras de fluxo é um aparelho transparente perfundidos a baixo número de Reynolds para combinar taxas de cisalhamento de parede observadas nos vasos sanguíneos in vivo 2. A parede do vaso é modelado por qualquer revestimento de biomoléculas ou crescimento de células numa superfície do fluxo cHamber 3. Partículas 4-7 ou células 8-16 são então fluiu na faixa desejada de taxas de fluxo para quantificar o número de aderir partículas sob várias taxas de cisalhamento. No entanto, a utilização de câmaras de fluxo de placa paralelas para estudar e validar os fenómenos bioquímicos é bastante dispendioso e moroso. Isto é principalmente devido ao fato de que as múltiplas experiências devem ser conduzidas para gerar um mapa de cisalhamento de fluidos em relação ao número de partículas / células aderidas. Além disso, as câmaras de fluxo de placa requerem grandes volumes de reagentes, devido ao seu grande tamanho (altura&gt; 250 um e largura de&gt; 1 mm),. Finalmente, estes dispositivos não modelar de forma precisa (por exemplo, características geométricas, bifurcações) e as condições de fluxo (por exemplo, contra os fluxos divergentes convergentes) que estão presentes in vivo. Os recentes avanços na litografia baseada microfabricação 17-19 aceleraram o campo de lab-on-a-chipdispositivos 20-21. Estes dispositivos têm sido fundamentais para o desenvolvimento de uma versão em miniatura da câmara de fluxo de placas paralelas com dimensões no regime micrômetro. A redução da dimensão também produz benefícios significativos em termos de volumes de reagentes, células ou partículas necessária para os experimentos. No entanto, uma limitação chave dos dispositivos actualmente disponíveis é a utilização de canais lineares para modelar microvasos, que não mimetizam a microvasculatura complexo observada in vivo. Recentemente, desenvolveu uma nova metodologia para a recriação de redes microvasculares sobre substratos de plástico descartáveis, resultando em representação sintética das condições in vivo. Estes dispositivos denominado Redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SMN) são desenvolvidos utilizando PDMS processo soft-litografia baseia. Dispositivos SynVivo-SMN pode ser usado para obter mapa de adesão ao cisalhamento de celular / partícula adesão 22, o estudo direcionado a entrega da droga e 23 have foi validado contra dados in vivo 24-25. Neste artigo, apresentamos um protocolo que permite a geração do mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em volumes tão pequenos quanto 1-5 mL, assim, resultando em significativa economia de recursos e tempo.

<table><tbody><tr>Pesquisa de <td>CFD</td> <td>SynVivo-SMN</td><td>SMN-001</td><td>Exclusiva na CFDRC</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>Qualquer fonte de avidina funcionará para este ensaio</td></tr><tr><td>Partículas Biotiniladas</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>Qualquer fonte de partículas biotiniladas funcionará para o ensaio</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>O tamanho é típico para uso com SynVivo-SMN</td></tr><tr><td>Elementos NIKON Instrumentos</td><td>NIKON</td><td>N/A</td><td>Qualquer outra imagem software pode ser usado</td></tr></tbody></table>

geração de cisalhamento adesão mapa usando synvivo networks microvasculares sintético

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Ensaios de adesão celular / partículas são fundamentais para a compreensão das interações bioquímicas envolvidas na fisiopatologia da doença e têm aplicações importantes na busca pelo desenvolvimento de novas terapias. Os ensaios com condições estáticas não conseguem captar a dependência da adesão em cisalhamento, limitando a sua correlação com o ambiente in vivo. Câmaras de fluxo de placas paralelas que quantificam a adesão sob fluxo de fluido fisiológico precisar de vários experimentos para a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento. Além disso, elas não representam a escala in vivo e morfologia e requerem grandes volumes (~ ml) de reagentes para os experimentos. Neste estudo, demonstramos a geração de mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento usando uma rede microvascular baseado dispositivo micro, SynVivo-SMN. Este dispositivo recria o complexo na vasculatura vivo incluindo escala geométrica, elementos morfológicos, as características de fluxo e interações celulares em umin vitro formato, proporcionando assim um ambiente biologicamente realista para pesquisa básica e aplicada no comportamento celular, distribuição de medicamentos, e descoberta de drogas. O ensaio foi demonstrada pelo estudo da interacção das partículas de 2 um revestido com biotina com as superfícies revestidas com avidina da microplaca. A gama inteira de corte observada na microvasculatura é obtido com um único ensaio permitindo adesão versus mapa de cisalhamento para as partículas sob condições fisiológicas.

A Figura 1A mostra uma de uma imagem de campo brilhante e esquemática do dispositivo SynVivo-SMN. Figura 1B mostra o dispositivo SynVivo-SMN montado sobre uma lâmina de vidro. Figura 1C mostra o dispositivo com tubo seguinte priming com água num exsicador de vácuo. A Figura 2A mostra uma imagem do experimental-configurado. Figura 2B mostra um típico dispositivo revestido de avidina SynVivo-SMN após a ligação...

As câmaras de fluxo usadas em experimentos de adesão geralmente consistem em caminhos de fluxo lineares e requerem vários experimentos em diferentes taxas de fluxo para gerar um mapa de adesão de cisalhamento. O SynVivo-SMN permite a geração de mapa de adesão de cisalhamento usando um único experimento utilizando volumes de microlitros, resultando em economia significativa de tempo e consumíveis.

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter um mapa de adesão por cisalhamento da adesão de partículas celulares a partir de um único experimento, utilizando redes microvasculares sintéticas. Isso é alcançado primeiramente revestindo o dispositivo microfluídico com a proteína de interesse, neste caso a avadina. Como segundo passo, partículas biotiniladas são injetadas no dispositivo em taxas fisiológicas de cisalhamento, as quais se ligam ao dispositivo revestido com avadina em padrões diferenciados, dependendo das taxas locais de cisalhamento.Em seguida, conta-se o número de partículas ligadas para gerar um mapa de adesão ao cisalhamento das partículas, utilizando uma base de dados computacional de valores de taxa de cisalhamento na rede. Os resultados mostram que um mapa de adesão ao cisalhamento pode ser obtido a partir de um único experimento, resultando em economia significativa de tempo e reagentes em comparação com as câmaras de fluxo por placas paralelas convencionais. A principal vantagem desta tecnologia em relação aos métodos existentes, como canais de fluxo linear, é a possibilidade de gerar mapas abrangentes a partir de um único experimento, o que resulta em uma e

generation-shear-adhesion-map-using-synvivo-synthetic-microvascular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

As células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas até a confluência dentro de um dispositivo de rede microfluídica. A junção celular endotelial e as distribuições de F-actina foram ilustradas e as mudanças na concentração de cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico em resposta ao trifosfato de adenosina (ATP) foram quantificadas em tempo real em níveis celulares individuais.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

O objetivo deste protocolo é descrever a geração e a análise volumosa de equivalentes vascularizados da pele humana utilizando técnicas acessíveis e simples para a cultura de longo prazo. Na medida do possível, a lógica das etapas é descrita para permitir aos pesquisadores a capacidade de personalizar com base em suas necessidades de pesquisa.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

A angiogênese germinativa, fundamental para o desenvolvimento e a doença, envolve processos moleculares e mecânicos complexos. Apresentamos um modelo ex vivo 2.5D versátil que analisa o brotamento celular das artérias carótidas suínas, revelando a angiogênese dependente da rigidez e a mecânica celular líder-seguidora distinta. Este modelo auxilia no avanço de estratégias de engenharia de tecidos e abordagens de terapia do câncer.

Modelo 2.5D para caracterização mecânica ex vivo da angiogênese germinada em tecido vivo

Aprenda a gerar mapas de adesão por cisalhamento usando redes microvasculares sintéticas SynVivo em um único experimento. Este método computacional reduz tempo e reagentes comparado às câmaras de fluxo tradicionais.

Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

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