Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

O objetivo geral do experimento a seguir é obter um mapa de adesão por cisalhamento da adesão de partículas celulares a partir de um único experimento, utilizando redes microvasculares sintéticas. Isso é alcançado primeiramente revestindo o dispositivo microfluídico com a proteína de interesse, neste caso a avadina. Como segundo passo, partículas biotiniladas são injetadas no dispositivo em taxas fisiológicas de cisalhamento, as quais se ligam ao dispositivo revestido com avadina em padrões diferenciados, dependendo das taxas locais de cisalhamento.

Em seguida, conta-se o número de partículas ligadas para gerar um mapa de adesão ao cisalhamento das partículas, utilizando uma base de dados computacional de valores de taxa de cisalhamento na rede. Os resultados mostram que um mapa de adesão ao cisalhamento pode ser obtido a partir de um único experimento, resultando em economia significativa de tempo e reagentes em comparação com as câmaras de fluxo por placas paralelas convencionais. A principal vantagem desta tecnologia em relação aos métodos existentes, como canais de fluxo linear, é a possibilidade de gerar mapas abrangentes a partir de um único experimento, o que resulta em uma economia significativa de custo e tempo.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de entrega de fármacos, como a capacidade dos veículos de entrega de fármacos de se ligarem aos alvos desejados. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao utilizarmos câmaras de fluxo com placas agitadoras para compreender lesões particulares em células. Em condições de fluxo, no entanto, o objetivo deste ensaio é fornecer informações básicas sobre a adesão de partículas e células.

A plataforma syn vivo pode ser aplicada a uma variedade de outros sistemas, como entrega em câncer e no SNC, infecção e inflamação, trombose e disfunção da microcirculação. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos com o dispositivo microfluídico são difíceis de aprender, a adaptação a pequenos volumes de amostra e as melhores práticas para evitar a formação de bolhas são mais bem comunicadas por meio visual. O procedimento será demonstrado por Ashley Smith, cientista pesquisadora do nosso laboratório.

O dispositivo microfluídico SynVivo SMN é composto por dois conjuntos de portas paralelas, sendo um para o fluxo de revestimento de superfície, grupos funcionais e/ou células para acomodação, e o outro para a realização do ensaio. Para iniciar, submergir completamente o dispositivo em uma placa de Petri contendo água desionizada estéril e colocar a placa em um vácuo. Dessecar, permitindo que a dessecação prossiga até que todo o ar seja removido dos canais do dispositivo.

Isso deve levar aproximadamente 15 minutos antes de remover o dispositivo da água. Use pinça de ponta fina para inserir o tubo de tigon previamente cheio com água em cada porta do dispositivo. O tubo deve ter aproximadamente uma polegada de comprimento.

O dispositivo agora pode ser removido da água utilizando uma pipeta ou seringa. Coloque uma gota de água ao redor da base de um dos tubos da porta de entrada. Remova cuidadosamente o tubo.

A gota de água impedirá que o ar entre no dispositivo. Em seguida, prepare uma seringa de um mililitro carregada com avadon numa concentração de 20 microgramas por mililitro. Conecte a seringa a uma agulha de aço inoxidável de calibre 24 e prenda a porta de entrada não utilizada com um grampo de mordente.

Insira o tubo no orifício de entrada do dispositivo. Injete avadon a uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto durante 10 minutos para permitir a perfusão completa do dispositivo. Ao final do tempo de fluxo.

Prenda todos os tubos com grampos de mandíbula e coloque o dispositivo a quatro graus durante a noite. Deixe o dispositivo atingir a temperatura ambiente. Em seguida, coloque o dispositivo em um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma platina motorizada e uma câmera de alto desempenho.

Prepare uma solução de partículas biotiniladas de dois mícrons numa concentração de 5 milhões de partículas por mililitro em tampão salino fosfato ou PBS. Carregue as partículas numa seringa de um mililitro. Prepare uma segunda seringa de um mililitro contendo PBS.

Carregue apenas cada seringa em uma bomba de infusão e, em seguida, conecte-as à agulha e à tubulação usando uma seringa pipetadora. Coloque uma gota de água ao redor da base da tubulação da porta de entrada e remova cuidadosamente a tubulação usada para revestir o dispositivo. Insira cuidadosamente a tubulação para partículas biotiniladas e para PBS em cada uma das portas de entrada.

Em seguida, comece a injetar partículas biotiniladas a uma taxa de fluxo de 2,5 microlitros por minuto. Monitore o porto de entrada no microscópio ao primeiro sinal das partículas. Inicie o cronômetro e mantenha o fluxo por três minutos.

Após o término dos três minutos, interrompa o fluxo de partículas biotiniladas enquanto inicia simultaneamente o fluxo de PBS a uma taxa de 2,5 microlitros por minuto. Deixe o PBS fluir no dispositivo por três minutos para remover as partículas não ligadas. Para iniciar a aquisição, utilize a função de varredura de imagem ampla no software de imagem para obter a imagem de todo o dispositivo, depois numere sequencialmente as bifurcações no dispositivo e crie uma área circular de interesse com o dobro do diâmetro dos canais.

Neste caso, defina o diâmetro da área de interesse como 200 mícrons, já que o diâmetro do canal é de 100 mícrons. Utilize a função de contagem automatizada no software de imagem para exportar o número de partículas em cada área de interesse para uma planilha. Da mesma forma, utilize o recurso de contagem automatizada para exportar o número de partículas em todo o dispositivo.

As simulações de CFD são executadas e os resultados são armazenados em um banco de dados para análise posterior. As informações incluídas nos resultados contêm taxas de cisalhamento na parede, fluxo de partículas por velocidade e aderência ao dispositivo. As informações aqui são usadas para determinar o número de partículas que aderem em cada área de interesse, dada uma concentração definida de partículas na entrada.

Para gerar um mapa de adesão ao cisalhamento, calcule a porcentagem de adesão conforme detalhado no protocolo descrito no texto como passo final. Plote o mapa de adesão ao cisalhamento utilizando a taxa de cisalhamento em cada bifurcação das redes e os valores de porcentagem de adesão. Esta imagem mostra um dispositivo SMN syn vivo típico revestido com avidina após a ligação de partículas biotiniladas de dois mícrons.

Observe que as partículas aderem preferencialmente próximo às bifurcações na rede. As bifurcações numeradas na rede SMN syn vivo podem ser vistas aqui. Esta imagem é o mapa de tensão de cisalhamento na parede gerado pelo modelo CFD do dispositivo.

A taxa de cisalhamento varia no dispositivo, indo de 250 segundos inversos a 15 segundos inversos, conforme observado na microvasculatura in vivo. Observe que essas taxas de cisalhamento variáveis não podem ser obtidas simultaneamente em canais microfluídicos lineares, pois eles fornecem uma taxa de cisalhamento constante para cada vazão. O gráfico mostrado aqui com os valores da taxa de cisalhamento em cada uma das bifurcações da rede revela que os padrões de taxa de cisalhamento são complexos e não podem ser descritos por uma relação analítica simples, ao contrário dos canais de fluxo lineares.

Além disso, múltiplas bifurcações estão presentes na rede que se enquadram na mesma classe de taxa de cisalhamento, aumentando a confiança estatística dos dados apresentados. Abaixo seguem resultados exemplares da análise de fluidodinâmica computacional (CFD) para os fluxos de partículas na rede, os quais são utilizados para calcular os fluxos de partículas nas ramificações e bifurcações da rede experimental.

O mapa de adesão ao cisalhamento calculado a partir de um único experimento SMN syn vivo segue a relação inversa observada nos mapas de adesão ao cisalhamento obtidos a partir de experimentos com canais lineares. No entanto, utilizando um ensaio SynVivo, um único experimento permite a geração desse mapa de cisalhamento, enquanto múltiplas execuções experimentais são necessárias nos canais lineares. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar os dispositivos SynVivo SMN para gerar a adesão compartilhada a partir de um único experimento.

Ao realizar este experimento, é importante lembrar-se de não introduzir bolhas no dispositivo microfluídico SynVivo SMN após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de inflamação estudarem a interação entre leucócitos e endotélio em diferentes taxas de cisalhamento em um único experimento. Na próxima geração de dispositivos, os pesquisadores poderão estudar a adesão por rolamento e a migração de leucócitos em um único ensaio, algo que atualmente não é possível.

Após este procedimento, outros métodos que investiguem a adesão de fármacos, veículos de entrega de fármacos e células podem ser realizados para estudar questões como o efeito fisiológico do fluxo sobre a adesão célula-célula, célula-fármaco e fármaco-veículo.