Name: Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intralinfática em camundongos para imunoterapia e vacinação. Este método melhora a resposta imune e permite reduzir as doses de vacina necessárias em estudos de imunologia.

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Os autores são gratos pela ajuda experimental no desenvolvimento do método de imunização em camundongos intralinfática de Iris Erdmann, Barbara von Beust, e Julia Maria Martínez-Gómez. Obrigado também a Maggy Arras e Nikola Cesarovic por nos deixar usar seu teatro cirúrgico para esta produção de vídeo.

1. Anestesia dos Ratos <ol><li> Prepare os anestésicos pela mistura de quetamina (anestésico dissociativo) e xilazina (sedativo e analgésico) em salina. As concentrações de cetamina e xilazina na solução final é de 12,5 e 2 mg / ml, respectivamente. </li><li> Injectar os anestésicos para a ratinhos por via intraperitoneal usando uma seringa com uma agulha G 25-30. Use 0,1 ml/10 g de peso corporal. </li><li> Aplique uma pomada oftálmica para os olhos dos ratos, a fim de evitar que resseque das córneas. </li><li> Assegurar que o mouse é suficientemente anestesiados por beliscar o seu pé ou dedo do pé com a pinça. Se o rato não reage com reflexos para o aperto, proceder à cirurgia. Se o rato reage ao beliscão com reflexos ou contrações musculares, espere 1-2 minutos e repita o teste de pressão. Se o mouse ainda reage, substituir o mouse com um novo animal e repita os procedimentos a partir do passo 1.2 em diante. </li></ol> 2. Eu Surgicalncision da região inguinal do Rato <ol><li> Posicione o mouse sobre as suas costas. </li><li> Molhar uma região inguinal com etanol desinfecção (70%). Para proporcionar uma melhor desinfecção, a região inguinal podem ser raspada para remover pele desinfecção prévia com etanol. </li><li> Pegue a perna e dobrar a articulação do quadril para produzir um ângulo de aproximadamente 90 ° da articulação do quadril. </li><li> Usando um fórceps curvos microdissecting, tirar a pele do rato na área inguinal, onde a articulação do quadril é dobrado e puxe a pele molhada ligeiramente. </li><li> Enquanto mantém a pele com a pinça, corte uma pequena incisão (&lt;5 mm) através da pele utilizando uma tesoura cirúrgica. </li><li> Coloque a ponta da tesoura fechados na incisão e abrir ainda mais a incisão, abrindo a tesoura, mantendo-o dentro da incisão. Isto fará com que a pele se rasgar e deve produzir um diâmetro de menos de 10 mm. Nota: A fonte de luz fria, com guias de luz são flexíveis e podem ser utilizados para melhorar a visibilidade. Em mais velhosratinhos, especialmente do sexo masculino, a identificação do nó de linfa pode ser difícil devido à muito tecido adiposo na região inguinal. </li></ol> 3. Injeção intralinfática <ol><li> Prepara-se uma seringa (0,5 ml ou menos) com uma agulha hipodérmica de 28-30 G; bisel curto pode ser preferível a um bisel longo. Aspirar 10 mL da vacina a ser injectado e garantir que a seringa é livre de ar. </li><li> Localizar o nó de linfa inguinal com a ajuda da pinça curvos e a ponta da tesoura fechada. O linfonodo aparecerá acinzentado dentro do tecido adiposo mais esbranquiçada e pode ser ainda identificados através de aferentes e eferentes capilares que entram e saem do linfonodo. </li><li> Imobilizar o linfonodo, segurando-o entre os ramos das pinças curvas. </li><li> Pegue na seringa e insira a agulha no nódulo linfático com o bisel virado para cima, certificando-se de todo o bisel entra no linfonodo. </li><li> Injectar a vacina (10 ul). Se o aceno linfae é o inchaço (explodir), a injecção pode ser assumida de sucesso. Se a agulha não está colocada a uma profundidade suficiente para o linfonodo, alguns ou toda a vacina pode sair e não entrar no linfonodo. Se a agulha é inserida muito profundo, a vacina injetada será lançado via subcutânea abaixo do nó de linfa. Em caso deste último, repetir a injecção ou substituir o rato com uma nova rato não tratado. </li></ol> 4. Fechando a incisão com sutura <ol><li> Abrir um pacote de sutura cirúrgica estéril. </li><li> Segure a agulha de sutura com um suporte de agulha na porção distal do corpo da agulha. Apertar o suporte de agulha, apertando-o até que as primeiras capturas de roquete. </li><li> Segure a pele de um dos lados da incisão com a pinça (dependendo da preferência do cirurgião, dentada ou un-dentes fórceps ou ganchos na pele pode ser usado). Inserir a agulha de ca. 2-3 mm a partir da borda da incisão, que entra a partir do lado de fora da pele. </li><li> Loosen preensão da pele com a pinça e agarrar o lado contrário ao da incisão com a pinça. Inserir a agulha de ca. 2-3 mm a partir da borda da incisão, que entra a partir do interior da pele. </li><li> Soltar o suporte de agulha e agarrar a ponta da agulha com a pinça. Puxe a agulha com o piso através da pele, deixando um comprimento conveniente da banda de rodagem do lado de fora do primeiro ponto de agulha de inserção (se vários ratos estão a ser tratados, deixe uma extremidade mais curta; 5-10 camundongos pode ser operado com uma agulha de sutura / pisar). </li><li> Fazer o nó preferido de acordo com protocolos padrão cirurgião. Um ponto é suficiente se a incisão não é maior do que 10 mm. Para incisões maiores, fazer um segundo ponto. </li></ol> 5. Tratamento Pós-operacional <ol><li> Posicione o mouse na gaiola e cubra com tecidos para manter aquecido. Ao tratar vários mouses, coloque-os próximos uns dos outros para se manter aquecido. Alternativamente, coloque os ratos em uma almofada quente até que tenham acordadopara cima. </li><li> Observe os ratos até que eles acordam. </li><li> Observe os ratos diariamente com relação à cicatrização de feridas, bem como outros sintomas clínicos, tais como infecções de feridas. A ferida é geralmente suficientemente fechado dentro de dois dias e curado dentro de sete dias do procedimento. </li></ol>

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TMK é apontado como inventor de patentes relacionadas com a imunoterapia intralinfática no homem. TMK foi consultor científico e recebeu as despesas de viagem de ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, MannKind Corporation, e XBiotech EUA Inc. PJ não tem interesse conflito de divulgar.

Imunização intralinfática e imunoterapia demonstraram ser apropriados para a estimulação de ambas as respostas de anticorpos e respostas de células-T. Como demonstrado neste vídeo-artigo, o procedimento de vacinação é intralinfática um método rápido e fácil para estimular fortes respostas imunitárias em ratinhos. Um cirurgião treinado pode realizar o procedimento durante 3-4 min. A sessão também pode ser compartilhada entre dois cirurgiões onde normalmente é fazer a anestesia ea sutura eo segundo cirurgião está fazendo ...

As vacinas são tipicamente injectados por via subcutânea ou intramuscular para a estimulação de respostas imunitárias. O sucesso deste procedimento requer a drenagem eficiente da vacina para os nódulos linfáticos onde as células apresentadoras de antigénio pode interagir com os linfócitos para a geração de t-e as respostas de células-B. Além disso, a força e o tipo de respostas imunitárias induzidas também depender da densidade ou da frequência de tais interacções, bem como o próprio microambiente, especialmente o teor de citocinas. Como apenas uma pequena fração de uma vacina injetada em um tecido periférico atinge um gânglio linfático, a vacinação de camundongos e humanos por injeção direta de vacina para os gânglios linfáticos, o site foram gerados respostas imunes, foram realizados. No homem, o procedimento é guiada por ultra-sons, um procedimento também utilizados para a administração de agentes de imagem para visualização de diagnóstico e do sistema linfático. Em ratinhos, o procedimento é invasivo. Aqui, uma pequena (5-10 mm) incision é feita na região inguinal de animais anestesiados 1, o nó de linfa é localizada e imobilizada com uma pinça, e um volume de 10-20 mL da vacina é injectada sob controlo visual, 10 ul é usado para as primeiras injecções e em ratos jovens com linfonodos pequenos, enquanto que 20 l pode ser injetado em linfonodos do mais velho ou camundongos já vacinadas, que têm nódulos linfáticos maiores. A incisão pode ser fechada com um único ponto com suturas cirúrgicas. Por este método, os ratos foram vacinados com plasmídeo de DNA de 2,3, o RNA mensageiro 4, 1,3,5,6 péptido, proteína 7-10, as partículas 11, 12 bactérias, bem como adjuvantes de 7,13, e uma forte melhoria da imunitário respostas contra todos os tipos de vacinas têm sido observados. O método intralinfática da vacinação é especialmente adequada em situações onde a vacinação convencional produz imunidade insuficiente, ou quando a quantidade de vacina disponível é limitado ou very dispendioso. Em humanos, o método intralinfática de imunização foi aplicada a pacientes alérgicos 14,15 ou para pacientes com cancro 16-21. Embora a noção corrente de que o método é intralinfática é mais invasiva do que outros métodos de injectáveis, tais como injecções intramusculares e subcutâneas, a percepção da dor não é maior do que após a punção venosa de 15. Espera-se que a vacinação intralinfática vai se tornar uma alternativa ou complemento a outros métodos de vacinas profiláticas e terapêuticas, especialmente. Este artigo descreve em pormenor a forma como o processo de vacinação intralinfática é realizada em ratinhos. Todos os procedimentos descritos, foram aprovados pela Agência Veterinária Cantonal de Zurique e realizada de acordo com as diretrizes federais suíços e directivas relativas à protecção dos animais utilizados para fins científicos.

<table><tbody><tr><td>Cetamina (Ketasol-100)</td><td>Graeub AG, Suíça</td><td></td><td>Anestésicos</td></tr><tr><td>Xilazina (Rompun)</td><td>Bayer, Alemanha</td><td></td><td>Anestésicos</td></tr><tr><td>Viscotears Eye-Gel</td><td>Novartis, Suíça</td><td></td><td>Para evitar que os olhos sequem durante a anestesia.</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0,5 ml</td><td>BD Medical, França</td><td></td><td>29 G Seringas de insulina com agulhas permanentemente fixadas</td></tr><tr><td>6-0 Dermalon Monofilament Nylon</td><td>Covidien, MA, USA</td><td></td><td>Para suturas (0,7 métricas, 18 G, 45 cm, Azul)</td></tr><tr><td>Pinça curva, 4,5 in</td><td>Polymed, Suíça</td><td></td><td>Para incisão e fixação de linfonodo</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica reta, 4,5 in</td><td>Polymed, Suíça</td><td></td><td>Para incisão</td></tr><tr><td>Porta-agulhas, 5,5 em</td><td>Polymed, Suíça</td><td></td><td>Para fechar a incisão com sutura</td></tr></tbody></table>

intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vacinas são tipicamente injectado subcutaneamente ou intramuscularmente para estimulação de respostas imunes. O sucesso desta requer drenagem eficiente da vacina para os nódulos linfáticos onde as células apresentadoras de antigénio pode interagir com os linfócitos para a geração das respostas imunitárias desejadas. A força e o tipo de respostas imunitárias induzidas também depender da densidade ou da frequência de interacções bem como o microambiente, especialmente o teor de citocinas. Como apenas uma fração mínima de vacinas perifericamente injetados atinge os gânglios linfáticos, a vacinação de camundongos e humanos foram realizados por injecção directa da vacina em linfonodos inguinais, ou seja, injeção intralinfática. No homem, o procedimento é guiada por ultra-sons. Nos ratos, uma pequena (5-10 mm) incisão é feita na região inguinal de animais anestesiados, o nó de linfa é localizada e imobilizada com uma pinça, e um volume de 10-20 mL da vacina é injectada sob controle visual.A incisão é fechada com um único ponto com suturas cirúrgicas. Os ratinhos foram vacinados com ADN de plasmídeo, ARN, péptidos, proteínas, partículas, e bactérias, bem como adjuvantes, e foi observada forte melhoria da resposta imune contra todos os tipos de vacinas. O método intralinfática da vacinação é especialmente adequada em situações onde a vacinação convencional produz imunidade insuficientes ou quando a quantidade de vacina disponível é limitado.

O procedimento de injeções intralinfática em ratos, apesar da natureza cirúrgica, é direto e relativamente rápido. Uma pessoa treinada pode realizar o procedimento em 3-4 min. A incisão que é fechada com um ponto de cura normalmente dentro de dois dias (Figura 1) Intralinfática vacinação ou imunização foi realizada com o ARNm, ADN plasmídeo, peptídeos, proteínas, vírus e bactérias. Figura 2 ilustra a produção de anticorpos após a imunização com a proteína a ...

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

O objetivo geral deste procedimento é estimular as respostas imunológicas de camundongos por meio da injeção direta da vacina em seus linfonodos. Isso é realizado primeiramente anestesiando o camundongo e fazendo uma pequena incisão na região inguinal. Em seguida, localize e imobilize os linfonodos inguinais.O passo final é injetar a vacina no linfonodo inguinal. Em última análise, a administração intra-linfática da vacina pode ser avaliada mediante a medição de sua resposta imune e comparação com métodos tradicionais de entrega, como injeções subcutâneas. Geralmente, indivíduos novos neste método têm dificuldade em atingir o linfonodo com a vacina.Pode ser necessário algum treinamento para coordenar a imobilização do linfonodo, a inserção da agulha e a injeção da vacina, pois a agulha pode facilmente sair da posição, resultando na injeção da vacina fora do linfonodo. Para iniciar, anestesie o camundongo conforme descrito no protocolo de texto complementar. O mais rapidamente possível, aplique uma pomada oftálmica nos olhos do camundongo para evitar que as córneas sequem.Em seguida, posicione o camundongo em posição supina e pinça o pé do camundongo com uma pinça para verificar se

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós ilustramos não-cirúrgico de entrega de materiais de teste para os pulmões de ratos anestesiados através da traquéia. Este método permite a exposição de pulmão a patógenos virais e bacterianas, citocinas, anticorpos, miçangas, químicos ou corantes. Iremos descrever colheita e processamento dos pulmões e dos gânglios linfáticos de drenagem de pulmão (LDLNs) para citometria de fluxo.

Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo

Este vídeo demonstra um ensaio de vacinação tumoral baseado em células. Um camundongo, injetado por via intradérmica com células de melanoma B16-F10 para formação de tumor, é vacinado com células B16-F10 secretando citocina Flt3L perto do tumor desenvolvido. O Flt3L secretado da vacina promove a maturação e proliferação de células dendríticas que então apresentam antígenos tumorais para células T nos gânglios linfáticos, desencadeando uma resposta imune antitumoral direcionada.

Implantação tumoral e injeção de uma vacina tumoral em um modelo de camundongo

Linfonodos são os tecidos imunológicos que orquestram a resposta imune e são um alvo crítico para as vacinas. Os biomateriais têm sido empregados para melhor direcionar linfonodos e controlar a entrega de antígenos ou adjuvantes. Este artigo descreve uma técnica que combina essas ideias para injetar partículas de polímeros biocompatíveis em linfonodos.

Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

O presente trabalho ilustra a conveniência do uso da imunoterapia sublingual para aumentar a resposta imune inata nos pulmões e conferir proteção contra pneumonia pneumocócica aguda em camundongos.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Detalhamos aqui a metodologia seguida para comparar a eficácia protetora e a resposta imune pulmonar induzida pela imunização intranasal e subcutânea com BCG em modelo de camundongo. Nossos resultados mostram os benefícios da vacinação pulmonar e sugerem um papel da resposta mediada por IL17 na proteção induzida pela vacina.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.

Um modelo imunológico para transplante heterotópico de células cardíacas e cardíacas em ratos

O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

O presente protocolo descreve um procedimento de radiologia intervencionista estabelecido para injeção intratímica em camundongos para evitar o risco de cirurgia aberta e melhorar a precisão das injeções percutâneas cegas.

Uma técnica minimamente invasiva, precisa e eficiente para injeção intratímica em camundongos

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Aprenda a técnica de injeção intralinfática em camundongos para imunoterapia e vacinação. Este método melhora a resposta imune e permite reduzir as doses de vacina necessárias em estudos de imunologia.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

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