VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

O objetivo geral aqui é demonstrar a metodologia usando silenciamento gênico induzido por vírus para identificar genes envolvidos na resistência de não hospedeiros para atingir VIGs da planta endógena. O gene alvo inocula plantas nicotiana hamama com figos do vírus do chocalho do tabaco que carregam um fragmento do gene alvo, prepara e inocula as culturas de patógenos não hospedeiros que expressam proteína fluorescente verde nas folhas da planta silenciadas pelo gene. Em seguida, avalie as colônias fluorescentes verdes de patógenos não hospedeiros sob luz ultravioleta no escuro.

A fim de identificar plantas silenciadas por genes que comprometem a resistência não hospedeiros, identifique o gene alvo sequenciando a inserção no vetor do vírus. No geral, esta metodologia de triagem genética direta mediada por VIX permite que os pesquisadores identifiquem facilmente genes envolvidos na resistência de plantas não hospedeiras contra patógenos bacterianos. Em um curto período de tempo, percebemos que a importância de combinar o silenciamento de genes induzido por vírus mediava a genética direta com patógenos que expressam GFP UV para identificar os genes responsáveis pela resistência não ST.

Quando fizemos anteriormente uma triagem genética tediosa, pontuando a morte celular induzida por hiperresposta e a morte celular induzida por doença. Assim, as sementes de nicotiana Ben em uma mistura de envasamento sem solo germinam as sementes em uma câmara de crescimento. Após três semanas, transplante as mudas em vasos individuais, cultive-as em uma estufa por pelo menos dois a três dias antes do vírus do chocalho do tabaco.

A inoculação do vetor figo descongela gradualmente os colmos congelados de agrobacterium contendo os clones de cDNA. Intv dois vetores sob condições estéreis inoculam as culturas individuais de agrobacterium em Luria. As placas agrícolas Berti incubam as placas a 28 graus Celsius por até dois dias.

Cultivar quatro colônias de réplicas para cada clone, de modo que o inóculo de agrobacterium adequado esteja disponível para inoculação de duas plantas. Inocular o TRV um em meio líquido Luria berti. Colha as culturas cultivadas durante a noite por centrifugação, ressuspenda as bactérias em inoculação, tampone e incube por três horas em temperatura ambiente em um agitador a 50 RPM.

Após a colheita das células por centrifugação, meça a densidade óptica e suspenda novamente os grânulos bacterianos em tampão MES de cinco milimolares pH 5,5 Em seguida, inocule a cultura bacteriana T RV uma com OD 600 de 0,3 no lado do eixo de três a quatro folhas de nicotiana hamama usando uma seringa sem agulha no local da inoculação de T RV um. Pique as folhas com inóculo das respectivas colônias de T RV duas usando um palito por duas semanas. Mantenha as plantas sob baixa temperatura com nutrição adequada, pois o crescimento vigoroso é importante para o silenciamento gênico eficiente dos suínos.

Como exemplo, pseudomonas senge PV tomate T um é usado neste experimento. Os patógenos devem carregar um plasmídeo que possa expressar G-F-P-U-V fazer com que as cepas de PGE em reis sejam líquidas, meio suplementado com 10 microgramas por mililitro. Rifampicina 50 microgramas por mililitro pode micina a 28 graus Celsius por 12 horas.

Colha as culturas bacterianas por centrifugação e, em seguida, confirme a presença de fluorescência verde usando uma lâmpada UV de comprimento de onda longo no escuro. Após duas lavagens em água estéril, suspender as células na concentração desejada de água estéril e ajustar o OD 600. Em seguida, inocule os respectivos patógenos no lado axial do alvo.

Folhas silenciadas por gene circundam cerca de 1,5 centímetro de diâmetro, se necessário. Simultaneamente, teste vários patógenos não hospedeiros quanto ao seu crescimento no gene alvo, plantas silenciadas também incluem um controle vetorial para visualização. Implante um crescimento bacteriano entre dois e cinco dias.

Exponha as folhas inoculadas a uma luz UV de longo comprimento de onda no escuro. Certifique-se de usar proteção para a pele e os olhos. Monitore as colônias bacterianas como manchas fluorescentes verdes no lado axial da folha no fundo da fluorescência vermelha emitida pela superfície da folha.

Verificar a fluorescência verde emitida pelo patógeno hospedeiro que atua como controle positivo. Observe o crescimento do patógeno diariamente de dois a cinco dias após a inoculação. Faça uma lista dos clones que silenciaram, resultaram no crescimento de um ou mais patógenos não hospedeiros.

Para remover os falsos positivos da primeira tela. Repita os VIGs para clones selecionados e, novamente, teste a resposta de plantas silenciadas por genes a patógenos sem custo. Use PCR de colônia no clone selecionado para amplificar a inserção usando os primers A TTB um e TB dois no vetor T RV dois ou primers anulando o local de clonagem.

Execute o produto de PCR em um gel aros e verifique a amplificação da banda única. Em seguida, sequencie a inserção do gene da planta no vetor T RV dois usando os primers A TTB ou primers flanqueando o local de clonagem. Realize a explosão usando a sequência e identifique os detalhes do gene.

Um protocolo generalizado para silenciar um grande número de genes usando figos à base de vírus do chocalho do tabaco em nicotiana. Hamana é mostrado neste fluxograma. Algumas das plantas silenciadas por genes apresentaram várias alterações fenotípicas, incluindo fenótipos de crescimento atrofiado, amarelecimento e fotobranqueamento.

Esses dados mostram fluorescência verde do patógeno exposto à luz ultravioleta no escuro antes da inoculação da planta e seus implantes de crescimento três dias após a inoculação, a mesma folha exposta à luz branca é mostrada como controle. Este experimento rastreia o crescimento de bactérias que expressam G-F-P-U-V em plana. Três não anfitriões.

Os patógenos foram utilizados para demonstrar o processo de identificação do gene da planta silenciada suscetível a patógenos não hospedeiros nas plantas selvagens nons silenced nicotiana hamama com imunidade. Esses patógenos não cresceram. No entanto, pelo menos dois patógenos não hospedeiros cresceram nas folhas silenciadas do gene NB sgt.One

. Dados quantitativos sobre o crescimento bacteriano demonstram o processo de identificação de plantas com silenciamento genético comprometidas para resistência não-ST. Usando esta abordagem genética direta mediada por figos, silenciamos cerca de 5.000 genes em nicotiana hamana e identificamos plantas que comprometem a resistência não-ST durante um período de cerca de um ano e meio.

Como exemplo, o crescimento de patógenos não hospedeiros em duas plantas silenciadas por genes identificadas nesta tela é mostrado aqui. Esperamos ter transmitido como realizar o silenciamento de genes induzido por vírus para centenas de genes e, em seguida, avaliar as plantas silenciadas observando o crescimento de patógenos não relacionados ao custo em planos para dissecar a resistência não custo. Usando este gene induzido por vírus, protocolo mediado por silenciamento, pode-se silenciar centenas de genes em um período de cerca de duas a três semanas e, em seguida, avaliar o crescimento de patógenos não equinos marcados com GFP UV em cerca de duas a três horas por dia, abrangendo cerca de dois a cinco dias.