VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

O objetivo geral aqui é demonstrar a metodologia utilizando o silenciamento gênico induzido por vírus para identificar genes envolvidos na resistência não hospedeira, visando obter VIGs da planta endógena. Inocule plantas de Nicotiana benthamiana com o vírus do mosaico da raiz do tabaco (TRV), contendo uma construção com um fragmento do gene alvo, prepare e inocule culturas do patógeno não hospedeiro expressando a proteína verde fluorescente nas folhas das plantas com o gene silenciado. Em seguida, avalie as colônias verdes fluorescentes do patógeno não hospedeiro sob luz ultravioleta no escuro.

Para identificar plantas com genes silenciados que comprometem a resistência de não hospedeiros, identifique o gene-alvo por meio do sequenciamento do inserto no vetor viral. De modo geral, essa metodologia de triagem genética direta mediada por VIX permite aos pesquisadores identificar facilmente os genes envolvidos na resistência de não hospedeiros de plantas contra patógenos bacterianos. Em um curto período de tempo, percebemos a importância de combinar genética direta mediada por silenciamento gênico induzido por vírus com patógenos que expressam GFP sob luz UV para identificar os genes responsáveis pela resistência não ST.

Quando realizamos anteriormente uma tediosa triagem genética direta, pontuando a morte celular induzida por resposta hiper e morte celular induzida por doença. Semeie sementes de Nicotiana ben em uma mistura de plantio sem solo e germe as sementes em uma câmara de crescimento. Após três semanas, transplante as mudas para vasos individuais e cultive-as em estufa por pelo menos dois a três dias antes do vírus do mosaico do tabaco.

Gradualmente descongele os colmos congelados de agrobactérias contendo os clones de cDNA para inoculação com vetor. Em condições estéreis, inocular os cultivos individuais de agrobactérias em meio Luria. Incubar as placas com agrobactérias em Bertani a 28 graus Celsius por até dois dias.

Cultive quatro colônias replicadas para cada clone, de modo que haja inóculo de agrobactéria adequado disponível para a inoculação de duas plantas. Inocule o TRV um em meio líquido Luria Berti. Recolha as culturas cultivadas durante a noite por centrifugação, re-suspenda as bactérias no tampão de inoculação e incube por três horas à temperatura ambiente em agitador a 50 RPM.

Após colher as células por centrifugação, meça a densidade óptica e ressuspenda os pellets bacterianos em tampão MES cinco milimolar pH 5,5. Em seguida, inocule a cultura bacteriana TRV1 com OD600 de 0,3 no lado abaxial de três a quatro folhas de Nicotiana benthamiana usando uma seringa sem agulha no local da inoculação com TRV1. Fure as folhas com o inóculo das respectivas colônias de TRV2 usando um palito de dente durante duas semanas. Mantenha as plantas em temperatura baixa com nutrição adequada, pois o crescimento vigoroso é importante para o silenciamento gênico eficiente por meio de TRVs.

Como exemplo, *Pseudomonas syringae* pv. *tomato* T1 é utilizado neste experimento. Os patógenos devem carregar um plasmídeo que possa expressar GFP-UV. Cresça as cepas PGE em meio líquido de King B suplementado com 10 microgramas por mililitro de rifampicina e 50 microgramas por mililitro de canamicina a 28 graus Celsius por 12 horas.

Colete as culturas bacterianas por centrifugação e, em seguida, confirme a presença de fluorescência verde utilizando uma lâmpada de luz ultravioleta de comprimento de onda longo no escuro. Após duas lavagens em água estéril, ressuspenda as células na concentração desejada em água estéril e ajuste a DO 600. Em seguida, inocule os patógenos respectivos no lado axial do alvo.

Folhas com genes silenciados formam círculos de aproximadamente 1,5 centímetro de diâmetro, se necessário. Teste simultaneamente diversos patógenos não hospedeiros quanto ao seu crescimento em plantas com genes-alvo silenciados e inclua também um controle vetorial para comparação. Implante um crescimento bacteriano entre dois e cinco dias.

Exponha as folhas inoculadas à luz ultravioleta de comprimento de onda longo no escuro. Certifique-se de usar proteção para a pele e os olhos. Monitore as colônias bacterianas como pontos fluorescentes verdes no lado axial da folha, sobre o fundo de fluorescência vermelha emitida pela superfície da folha.

Verifique a fluorescência verde emitida pelo patógeno hospedeiro, que serve como controle positivo. Observe o crescimento do patógeno diariamente, de dois a cinco dias após a inoculação. Elabore uma lista dos clones cujo silenciamento resultou no crescimento de um ou mais patógenos não hospedeiros.

Para remover os falsos positivos da primeira triagem, repita os VIGs para os clones selecionados e novamente teste a resposta das plantas com genes silenciados a patógenos não relacionados. Utilize PCR de colônia no clone selecionado para amplificar o inserto utilizando os primers A TTB um e TB dois no vetor T RV dois ou primers que flanqueiam o sítio de clonagem.

Execute o produto da PCR em um gel de agarose e verifique a amplificação da única banda. Em seguida, sequencie o inserto do gene vegetal no vetor T RV dois utilizando os iniciadores A TTB ou iniciadores que flanqueiam o sítio de clonagem. Realize um blast usando a sequência e identifique os detalhes do gene.

Um protocolo generalizado para o silenciamento de um grande número de genes utilizando figs baseados no vírus do mosaico do tabaco em Nicotiana. Hamana é mostrado neste fluxograma. Algumas das plantas com genes silenciados exibiram diversas alterações fenotípicas, incluindo crescimento reduzido, amarelecimento e fenótipos de fotobranqueamento.

Esses dados mostram a fluorescência verde de patógenos expostos à luz UV no escuro antes da inoculação nas plantas e seus implantes de crescimento três dias após a inoculação; a mesma folha exposta à luz branca é mostrada como controle. Este experimento acompanha o crescimento de bactérias que expressam G-F-P-U-V em plantas. Três não hospedeiros.

Os patógenos foram utilizados para demonstrar o processo de identificação do gene silenciado em plantas suscetíveis a patógenos não hospedeiros no tipo selvagem, em plantas de Nicotiana benthamiana não silenciadas com imunidade. Esses patógenos não cresceram. No entanto, pelo menos dois patógenos não hospedeiros cresceram no NB sgt.

Uma folha com gene silenciado. Dados quantitativos sobre o crescimento bacteriano demonstram o processo de identificação de plantas com genes silenciados que apresentam comprometimento na resistência não-ST. Utilizando essa abordagem de genética direta mediada por figs, silenciamos cerca de 5.000 genes em Nicotiana benthamiana e identificamos plantas com resistência não-ST comprometida ao longo de um período de aproximadamente um ano e meio.

Como exemplo, é mostrado aqui o crescimento de patógenos não hospedeiros em duas plantas com genes silenciados identificadas nesta triagem. Esperamos ter demonstrado como realizar o silenciamento gênico induzido por vírus para centenas de genes e, em seguida, avaliar as plantas silenciadas observando o crescimento de patógenos não hospedeiros nas plantas para dissecar a resistência não hospedeira. Ao utilizar este protocolo mediado por silenciamento gênico induzido por vírus, é possível silenciar centenas de genes em um período de cerca de duas a três semanas e, em seguida, avaliar o crescimento de patógenos não hospedeiros marcados com GFP UV em cerca de duas a três horas por dia, ao longo de aproximadamente dois a cinco dias.