Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

O objetivo geral deste procedimento é usar folhas de células para construir um adesivo de engenharia de tecido. Isso é feito tratando primeiro a superfície da cultura de células com o polímero termossensível polipropilacrilamida, também conhecido como p nipam. O segundo passo é cultivar as células de interesse em alta densidade na superfície revestida com polímero para criar folhas de células.

Em seguida, as folhas são levantadas diminuindo a temperatura da placa, o que permite que as células se desprendam da placa como uma folha de células. A etapa final é mover as folhas de células intactas sem rasgá-las em uma construção para implantação. Em última análise, a microscopia de luz simples pode ser usada para mostrar que a folha de células foi criada e mantida durante sua manipulação enquanto cria um material de engenharia de tecido implantável.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, que irão incorporar células em matriz como hidrogéis, é que nesta técnica, as bordas laterais das células podem ser geradas e mantidas como um tecido funcional. Esses métodos também podem permitir novos estudos no campo da engenharia de tecidos. Por exemplo, quão bem as células sobrevivem após o transplante quando estão nesse estado organizado?

Demonstrando este procedimento estará o Dr. William Turner, um pós-doutorado em meu laboratório e a Sra. Snapshot areia. Para iniciar este procedimento, dissolva 2,6 gramas de P nipam em dois mililitros de uma solução de tolueno a 60% e hexano a 40%. Em seguida, aqueça a mistura a 60 graus Celsius por 10 minutos e mexa até que o P nipam se dissolva.

Em seguida, corte o papel de filtro em um círculo de 60 milímetros de diâmetro e coloque-o em um funil de buchner. Filtrar a solução através do funil de Buchner para um copo de vidro pré-pesado. Mantenha o copo e o conteúdo em um aspirador de campânula durante a noite.

Em seguida, pese o béquer com p nipam. Em seguida, adicione álcool isopropílico ao P nipam para criar uma solução de peso de 50 a 50 pesos. Em seguida, coloque dois mililitros da solução na superfície da placa de cultura de tecidos e cubra-a por cinco minutos sob luz ultravioleta.

Em seguida, lave a placa com dois mililitros de PBS quente duas vezes antes de usá-la para cultura de células. Neste procedimento, primeiro, isole as células do músculo liso aórtico do rato lavando as células com dois mililitros de PBS quente. Em seguida, adicione três mililitros de tripsina ou outra solução dissociante clivada às células e incube por cinco minutos.

Em seguida, adicione três mililitros do meio de cultura ou PBS contendo 10% de FBS às células. Depois disso, colete as células em um tubo cônico e conte-as. Em seguida, gire as células a 1000 RPM por cinco minutos.

Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células nos meios de cultura. Em seguida, coloque o meio contendo as células em uma placa termossensível de 35 milímetros a uma concentração que atinja 100% de confluência e, em seguida, incube a 37 graus Celsius durante a noite para manter a adesão da célula à placa. Agora colete as células endoteliais e disperse-as em uma única solução celular.

Usando uma tripsina x, acuato ou tampão de dissociação celular também pode ser usado para dispersão de célula única. Em seguida, desative a enzima tripsina com uma quantidade igual de inibidor de tripsina de soja ou 10% FBS em PBS. Em seguida, colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros.

Conte as células com um hemocitômetro e calcule o volume necessário para as dimensões do patch para um patch de quatro milímetros, 2 milhões de células endoteliais são usadas depois disso, extraia 2 milhões de células e coloque-as em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células por cinco minutos, aspire o sobrenadante, deixando as células como um pellet no tubo cônico. Agora prepare o hidrogel de alta aurina de acordo com o protocolo da empresa.

Misture alta aurina e gelatina líquida na proporção de um para um. Em seguida, transfira 80% do volume final total para o tubo cônico que contém o pellet, ressuspenda as células endoteliais na mistura de gelatina com alto teor de aurina. Em seguida, transfira as células suspensas para a matriz fibrosa.

Adicione 20% do volume final total do reticulador e incubado a 37 graus Celsius por uma hora. Nesta etapa, remova a placa tratada com P nypa de 35 milímetros contendo as células da incubadora e coloque-a em uma capela de cultura de células. À temperatura ambiente, aspire rapidamente o meio das células.

Em seguida, adicione dois mililitros de gelatina normal a 37 graus Celsius, 6% ao prato enquanto a gelatina ainda está quente, coloque a treliça de metal na gelatina, submergindo-a abaixo da superfície da gelatina normal. Depois, coloque todo o prato no gelo por cinco a sete minutos, permitindo que a gelatina endureça. Após sete minutos, use uma espátula para separar cuidadosamente as bordas de gelatina da lateral do prato.

Em seguida, levante a treliça de metal da placa com uma pinça. Transfira a folha de células para o prato e coloque-a em cima da combinação de hidrogel de matriz fibrosa. Adicione dois mililitros de meio de 37 graus Celsius à placa de cultura de tecidos e incube durante a noite para permitir que a folha de células adira à superfície do hidrogel.

Enquanto isso, remova a rede de metal após o aquecimento da solução. Aqui, as células foram cultivadas em uma superfície revestida de Pippa e depois movidas como uma folha para a superfície da matriz fibrosa. Os primeiros testes que não foram transferidos com a rede de metal de gelatina resultaram em pequenas manchas esfarrapadas.

Esta imagem representa uma imagem composta de design de patch inicial combinando o rastreador mito, células musculares lisas aórticas de rato tingidas de vermelho, células endoteliais da veia umbilical humana fluorescente verde de cálcio e a imagem de luz transmitida. E este é o composto de folha celular combinado com a combinação de hidrogel de matriz fibrosa de base mais forte. Esta imagem composta foi tirada da parte inferior do adesivo através de uma matriz fibrosa de base mais forte, e esta imagem composta das folhas de células foi tirada sobre a matriz fibrosa de base.

As células combinadas de hidrogel na folha cobrem a combinação de hidrogel de matriz fibrosa de base, que mostra maior fluorescência nas bordas devido ao agrupamento das células. Esta é uma imagem de transmissão da construção e a matriz de base fibrosa natural autofluorescente em DPI é mostrada aqui. Após esse procedimento, outros experimentos de engenharia de tecidos podem responder a outras perguntas, como como o alinhamento e a comunicação celular afetam o sucesso do transplante.

Essa técnica permite que pesquisadores em engenharia de tecidos explorem maneiras complexas de transplantar vários tipos de células. Não se esqueça de que trabalhar com solventes pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de máscaras adequadas e capuzes químicos, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.