Name: Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a construir um patch de engenharia de tecidos usando folhas celulares com polímero termossensível pNIPAM. Este método permite criar materiais implantáveis mantendo a integridade celular para aplicações terapêuticas avançadas.

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Este trabalho foi financiado por um New Faculty Award II do California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), Prêmio Nacional de Pesquisa financiado pelo NIH (F32-HL104924) e Bolsa de Treinamento CIRM (TG21163). Os materiais foram fornecidos por: Glycosan Biosystems Inc / BioTime e Dr. Stephen Badylak (Universidade de Pittsburgh)

1 Criação de placas PNIPAAm revestidas <ol><li> Dissolve-se o 2,6 g de PNIPAAm em 2 ml de uma solução de hexano a 60% de tolueno / 40%. </li><li> Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos agitou-se, até que a PNIPAAm é dissolvido. </li><li> Cortar papel de filtro para um círculo de diâmetro 60 mm e coloque o papel no funil de Buchner. </li><li> Filtrar a solução através de Buchner Funil para a pré-pesado copo de vidro (não use plástico, como o hexano vai derreter plásticos). </li><li> Colocar a proveta e o conteúdo para um vácuo de sino (24 psi) S / N (16 horas). Nota: Até o resíduo é reagido com isopropílico vai oxidar para ter certeza que não entra em contato com o oxigênio. </li><li> Pesar no copo para estabelecer o peso do PNIPAAm. </li><li> Adicionar álcool isopropílico para a PNIPAAm, criando uma 50/50 w / w solução. </li><li> Coloque 2 ml da solução sobre a superfície da placa de cultura de tecidos, e no revestimento, durante 5 min, sob luz UV. </li><li> Lava-se a placa com 2 ml de PBS quente duas vezesantes de usar para cultura de células. </li></ol> 2 Criação de Fichas de celulares Nota: as folhas da pilha de células primárias para o órgão-alvo podem ser criadas através de um número de métodos diferentes, ou por revestimento de superfícies de cultura de tecidos com o polímero termo-sensível, tal como descrito aqui. Placas termossensíveis Pré-revestidos também são oferecidos por um número de fornecedores. Nota: Este protocolo é para a cultura usando um prato de 35 mm. Resumidamente, as células são primeiro incubadas a 37 ° C durante um mínimo de 24 horas à confluência para estabelecer conexões laterais entre as células adjacentes. Para soltar as folhas de células, as placas são sujeitas a temperaturas inferiores a 32 ° C. A camada de células é então transferido para a matriz fibrosa base forte contendo um hidrogel permissiva neovascular com as células endoteliais vasculares. <ol><li> Isolar a população de células. Nota: Este método é dependente dos procedimentos de derivação individuais e o tipo de células. Rato mu liso aórticocélulas LECSA (RASMC) são utilizadas neste exemplo. Estas são células primárias de músculo liso isoladas a partir da aorta abdominal de um rato. </li><li> Lavam-se as células com 2 ml de PBS quente. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina (ou outro / solução dissociando clivagem) para as células durante 5 min. </li><li> Inibir a tripsina por adição de 3 ml do meio de cultura, ou uma solução tampão de fosfato (PBS) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Recolher as células num tubo cónico e contagem de uma alíquota. </li><li> Rodar as células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células no seu meio de crescimento (mais SmGM2 kit bala meio de cultura é usada para RASMC). </li><li> Coloque a mídia que contém as células em um termo-sensível placa 35 mm - PNIPAAm placa revestida com uma concentração que vai atingir 100% de confluência. Nota: Para RASMCs que o número foi determinado como sendo de 100.000 células / cm 2. No entanto, devido à perda de células durante a passagem, 120% do que va<html> lue é usado. </li><li> Colocar numa incubadora a 37 ° CO / N. Nota: É importante manter as células a 37 ° C, para manter a adesão de células à placa. </li></ol> 3: Preparação da Matriz Fundamental Nota: Várias matrizes fibrosas em 3D podem ser utilizados para a camada de matriz fibrosa forte entre as camadas de células delicadas. Alguns exemplos incluem: gelfoam, biovidro, materiais naturais acellularized 26 ou nanospun materiais 27,28 A matriz de bexiga do porco (UBM) utilizada nesses estudos foi generosamente fornecidos a partir de nosso colaborador, o Dr. Badylak 29. <ol><li> Antes de usar, determinar as características da matriz, incluindo a falta de conteúdo celular se descelularizados matriz é usado, 27,28 viabilidade celular específica, e o espaço vazio 22. </li><li> Cortar a matriz pré-esterilizados em um tamanho e forma desejados. Nota: Aqui, um furador é utilizada para cortar um círculo diâmetro de 4 mm. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4. células endoteliais de semeadura em um Neovascular Permissivo Hidrogel Nota: As células endoteliais podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a diferenciação de células estaminais ou progenitoras. Aqui, são utilizadas células HUVEC. <ol><li> Use qualquer hidrogel permissiva (fibrina, géis de colagénio), enquanto o tempo de reticulação é suficientemente curto para permitir que as células permanecem viáveis. Nota: Aqui, um gel de hialuronano (HA), com base reticulados com uma ponte de dissulfureto é utilizado. </li><li> Prepare o hidrogel de HA, de acordo com o protocolo da empresa. </li><li> Recolher as células endoteliais e dispersam-se numa solução de uma única célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase ou dissociação celular Tampão também poderia ser utilizada para a dispersão de células individuais. </li><li> Desactivar a enzima tripsina, utilizando uma quantidade igual de inibidor de tripsina de soja (que é importante que as células não entram em contacto com o soro) ou 10% de FBS em PBS, recolhendo a solução / células para um tubo de 15 ml. </li><li> CONT as células, e calcular o volume necessário para as dimensões de emenda (previamente quantificada). Nota: Para um patch 4 milímetros, aqui de 2 milhões de células endoteliais são usados. </li><li> Extrato de 2 milhões de células, e coloque em um novo tubo de 15 ml. </li><li> Giram em (228 xg) por 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante, deixando as células como um sedimento num tubo cónico. </li><li> Misturar os materiais líquidos de HA e de gelatina numa proporção de 1: 1 ração. Em seguida, adicionar 80% do volume total dentro do tubo cónico contendo o sedimento. </li><li> Ressuspender as células endoteliais na mistura 1: 1 HA / Gelatina </li><li> Colocar as células em suspensão na mistura de HA / gelatina para a base de matriz fibrosa a partir do Passo 2. </li><li> Adicionar 1/5 (20 por cento) do volume total desejada do agente de reticulação </li><li> Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 5. Isolamento de Folhas Celulares <ol><li> Retirar as placas tratadas com PNIPAAm 35 milímetros contendo as células a partir do incubador e colocar num capuz de cultura de células emRT. </li><li> Aspirar rapidamente o meio das células, e adicionar 2 ml de 6% de gelatina normal que foi aquecido a 37 ° C. </li><li> Enquanto que a gelatina está ainda quente, coloque a estrutura de metal em que a gelatina, submergindo-a abaixo da superfície da gelatina normal (Filme 1). </li><li> Coloque a totalidade da placa em gelo durante 5 a 7 minutos, permitindo que a gelatina endureça. </li><li> Após 7 min, uma espátula para separar cuidadosamente os bordos de gelatina do lado da placa, e em seguida utilizar uma pinça para levantar a estrutura de metal da placa Nota: A gelatina 6%, e a folha de célula deve levantar com a estrutura. </li><li> Mover a lâmina da célula para o prato e colocar na parte superior do conjunto de matriz de hidrogel de base fibrosa, ajustando cuidadosamente a estrutura no topo da construção. Nota: O lado apical da camada de células ainda estará na posição superior. </li><li> Adicionar 2 ml de meio morno (37 ° C). </li><li> Incubar S / N permitindo que a folha de células para aderirem à superfície do hidrogel. </li><li> Remover tele grade metálica após a solução aquece (aproximadamente 1 hora), ou no dia seguinte. </li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

Os passos críticos no protocolo incluem: revestimento das superfícies das placas com o polímero thermoresponsive e manipular as folhas de células após o arrefecimento das placas. Como as células diferentes apresentam diferentes propriedades físicas, como adesividade, o tempo de elevação deve ser otimizado para cada tipo de célula diferente. O segundo, e mais importante desafio componente deste protocolo, centra-se na manipulação da camada de células, um aspecto crítico dos métodos para a montagem do tecido. A camada úni...

A injeção de células e/ou materiais únicos por si só mostrou sucesso variável em outros sistemas de órgãos e sucesso limitado na regeneração cardíaca. 5,7-12 Atualmente, as células derivadas de células-tronco são entregues ao tecido danificado usando uma variedade de métodos de entrega, incluindo: injeção direta de células no tecido e perfusão no suprimento sanguíneo. 13-17 Outros implantaram células sozinhas, materiais sozinhos e / ou em combinação com transportadores de materiais para ajudar a regenerar órgãos danificados. 18-21 Este projeto combina várias estratégias que fornecem resistência do material, padronizando em vários materiais e vários tipos de células. 
Especificamente, a matriz fibrosa acelularizada de base fornece a força física fundamental para a construção, tornando-a adequada para sutura no paciente, se necessário. Os espaços vazios na matriz de base são preenchidos com células endoteliais em um hidrogel permissivo neovascular22 para estabelecer rapidamente a vascularização da construção implantada. Este composto é então integrado com folhas de células pré-padronizadas que permitem uma comunicação célula a célula aprimorada, imitando mais de perto o tecido nativo. 1,23-25 O processo geral de produção do adesivo celular em camadas é descrito pelo fluxograma na Figura 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Calcein-AM Invitrogen</td><td></td><td>C3099</td><td>Cell tracker / corante vivo</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Cell tracker</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Visible Cell dye</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-isopropilacrilamida)</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>Células musculares lisas aórticas de rato</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149 Meios de</td><td>músculo liso</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>Células endoteliais venosas humanas</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan / Álcool</td> isopropílico Biotime <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento Específico</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Ahlstrom&nbsp;</td><td>6310-0900&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Funil Buchner&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas UpCell&nbsp;</td><td>Nunc&nbsp;</td><td>2014-11&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luz UV</td><td>Jelight Company&nbsp;</td><td>Limpador UVO Modelo No.42</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de tecidos: construção de um multicelular 3d andaime para a entrega de camadas celulares sheets

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Muitos tecidos, como os corações humanos adultos, são incapazes de se regenerar adequadamente após a lesão. 2,3 Estratégias em engenharia de tecidos propor inovações para ajudar o corpo a recuperação e reparação. Por exemplo, as abordagens TE pode ser capaz de atenuar a remodelação cardíaca após infarto do miocárdio (IM) e, possivelmente, aumentar a função cardíaca total a um próximo nível pré-MI normal. 4 Tal como acontece com qualquer tecido funcional, regeneração bem sucedida do tecido cardíaco envolve a entrega dos vários tipos de células com sinais ambientais que favoreçam a integração e sobrevivência do enxerto de células / tecido implantado. Tecidos artificiais devem abordar vários parâmetros, incluindo: sinais solúveis, interações célula-célula, e materiais de matriz avaliados como veículos de entrega, os seus efeitos sobre a sobrevivência da célula, resistência do material, e facilitação de organização célula-tecido. Estudos empregando a injeção direta de células do enxerto apenas ignorar esses elementos essenciais. 2,5,6Um projeto de tecidos combinando esses ingredientes ainda tem de ser desenvolvido. Aqui, apresentamos um exemplo de projetos integrados que utilizam camadas de folhas de células padronizadas com dois tipos distintos de materiais biológicos derivados contendo o tipo de célula para órgãos-alvo e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos no &quot;tecido&quot;. Embora esses estudos concentram-se na geração de tecido cardíaco semelhante, este projeto tecido pode ser aplicado a muitos outros do que o coração com design e material alterações mínimas órgãos, e é destinado a ser um produto off-the-shelf para terapias regenerativas. O protocolo contém cinco etapas detalhadas. Uma temperatura de poli sensível (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) é usado para placas de cultura de tecidos revestimento. Em seguida, as células são cultivadas de tecido específico sobre a superfície das placas revestidas / superfícies micropattern para formar camadas de células com aderências laterais fortes. Em terceiro lugar, uma matriz de base, é criado para o tecido através da combinação de matriz porosa com Permissi neovascularve hidrogéis e células endoteliais. Finalmente, as folhas de células são levantados a partir dos pratos PNIPAAm revestidos e transferido para o elemento de base, fazendo com que a construção completa.

O diagrama de fluxo (Figura 1) mostra o método geral para fazer o penso multicamadas. Folhas de células são separadas da placa tratada PNIPAAm por baixar a temperatura abaixo de 32 ° C. Em seguida, a camada de células é colocada em cima do hidrogel reticulado contendo as células endoteliais semeadas na matriz fibrosa subjacente (Figura 1). As placas pré-tratados termossensíveis, também podem ser utilizados para criar as camadas de células. Superfícies topológicas especiais são usados ​​...

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado. Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar folhas celulares para construir um retalho de tecido engenharizado. Isso é realizado primeiramente tratando a superfície de cultura celular com o polímero termossensível polipropilacrilamida, também denominado pNIPAM. O segundo passo é cultivar as células de interesse em alta densidade sobre a superfície revestida com polímero para criar folhas celulares.Em seguida, as lâminas são levantadas pela redução da temperatura da placa, o que permite que as células se soltem da placa na forma de uma lâmina contínua de células. O passo final consiste em transferir as lâminas de células intactas, sem rasgá-las, para um suporte destinado ao implante. Em última análise, pode-se utilizar uma microscopia de luz simples para demonstrar que a lâmina celular foi criada e mantida durante sua manipulação ao se produzir um material tecidual engenharizado implantável.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que incorporam células em matrizes semelhantes a hidrogéis, é que, com esta técnica, as bordas laterais das células podem ser geradas e mantidas como um tecido funcional. Esses métodos também podem viabilizar estudos adicionais na área da engenharia de tecidos. Por exemplo, com que eficiência as células sobrevivem após o transplante quando estão nesse estado organizado?Demonstrará este procedimento o Dr. William Turner, pesquisador pós-doutorando em meu laboratório, e a Srta. Snapshot Sand Do. Para iniciar este procedimento, dissolva 2,6 gramas de P nipam em dois mililitros de uma solução de 60% de tolueno e 40% de hexano. Em seguida, aqueça a mistura a 60 graus Celsius por 10 minutos e agite até que o P nipam esteja completamente dissolvido.Em seguida, corte o papel de filtro em um círculo de 60 milímetros de diâmetro e coloque-o em um funil de Büchner. Filtre a solução através do funil de Büchner em um béquer de vidro previamente pesado. Mantenha o béquer e seu conteúdo em uma câmara de vácuo durante a noite.Posteriormente, pese o béquer com p NIPAM. Em seguida, adicione álcool isopropílico ao P NIPAM para criar uma solução peso/peso 50/50. A seguir, coloque dois mililitros da solução sobre a superfície da placa de cultura de tecidos e recubra por cinco minutos sob luz UV.Em seguida, lave a placa com dois mililitros de PBS morno duas vezes antes de utilizá-la para cultura celular. Neste procedimento, primeiro, isole as células musculares lisas aórticas de rato lavando as células com dois mililitros de PBS morno. A seguir, adicione três mililitros de tripsina ou outra solução dissociadora clivadora às células e incube por cinco minutos.Em seguida, adicione três mililitros do meio de cultura ou PBS contendo 10% de FBS às células. Depois disso, colete as células em um tubo cônico e conte-as. Posteriormente, centrifugue as células a 1000 RPM durante cinco minutos.Aspire o sobrenatante e ressuspenda as células no meio de crescimento. Em seguida, coloque o meio contendo as células em uma placa termossensível de 35 milímetros numa concentração que alcance 100% de confluência, e incube a 37 graus Celsius durante a noite para manter a adesão celular à placa. Agora, colete as células endoteliais e dispersa-as numa solução de células individuais.Um tampão de tripsina a um x, agudo ou de dissociação celular também pode ser usado para a dispersão em células isoladas. Em seguida, desative a enzima tripsina com uma quantidade igual de inibidor de tripsina de soja ou 10% de FBS em PBS. Então, colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros.Conte as células com um hemocitômetro e calcule o volume necessário para as dimensões do retalho; para um retalho de quatro milímetros, são utilizadas 2 milhões de células endoteliais. Depois disso, retire 2 milhões de células e coloque-as em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células por cinco minutos, aspire o sobrenadante, deixando as células como um pellet no tubo cônico. Agora, prepare o hidrogel de aurina alta de acordo com o protocolo da empresa.Misture aurina alta e gelatina líquida em uma proporção de um para um. Em seguida, transfira 80% do volume final total para o tubo cônico contendo o pellet, ressuspenda as células endoteliais na mistura de gelatina com aurina alta. A seguir, transfira as células suspensas para a matriz fibrosa.Adicione 20% do volume final total do agente de reticulação e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Nesta etapa, retire a placa tratada de 35 milímetros de P nypa contendo as células do incubador e coloque-a em uma capela de cultura celular. À temperatura ambiente, aspire rapidamente o meio das células.Em seguida, adicione dois mililitros de gelatina normal a 6%, a 37 graus Celsius, ao placa enquanto a gelatina ainda estiver morna, coloque a grade metálica na gelatina, submergindo-a abaixo da superfície da gelatina normal. Depois disso, coloque toda a placa sobre gelo por cinco a sete minutos, permitindo que a gelatina endureça. Após sete minutos, use uma espátula para separar cuidadosamente as bordas da gelatina da lateral da placa.Em seguida, levante a grade metálica da placa com pin&ccedil;as. Transfira a l&acirc;mina de c&eacute;lulas para a placa e coloque-a sobre a combina&ccedil;&atilde;o de hidrogel fibroso. Adicione dois mililitros de meio a 37 graus Celsius &agrave; placa de cultura de tecidos e incube durante a noite para permitir que a l&acirc;mina de c&eacute;lulas adira &agrave; superf&iacute;cie do hidrogel.Enquanto isso, remova a grade metálica após o aquecimento da solução. Aqui, as células foram cultivadas em uma superfície revestida com Pippa e, em seguida, transferidas como uma lâmina para a superfície da matriz fibrosa. Ensaios iniciais que não foram transferidos com a grade metálica de gelatina resultaram em pequenos fragmentos desordenados.Esta imagem representa uma composição inicial do desenho do retalho, combinando o marcador mito, células musculares lisas aórticas de rato coradas em vermelho, células endoteliais de veia umbilical humana fluorescentes em verde pelo indicador de cálcio e a imagem de luz transmitida. E esta é a composição da folha celular combinada com a combinação de hidrogel de matriz fibrosa de base mais resistente. Esta imagem composta foi obtida a partir da parte inferior do retalho através de uma matriz fibrosa de base mais resistente, e esta imagem composta das folhas celulares foi obtida sobre a matriz fibrosa de base.Células em combinação com hidrogel na camada cobrem a base de hidrogel combinado com matriz fibrosa, que apresenta aumento da fluorescência nas bordas devido ao agrupamento das células. Esta é uma imagem de transmissão da estrutura, sendo mostrada aqui a matriz fibrosa natural autofluorescente em DPI. Após este procedimento, outros experimentos de engenharia de tecidos podem responder a outras questões, como como o alinhamento e a comunicação celular afetam o sucesso do transplante.Essa técnica permite que pesquisadores em engenharia de tecidos explorem maneiras complexas de transplantar múltiplos tipos celulares. Não se esqueça de que trabalhar com solventes pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de máscaras apropriadas e capelas químicas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

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