Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

O objetivo geral deste procedimento é utilizar folhas celulares para construir um retalho de tecido engenharizado. Isso é realizado primeiramente tratando a superfície de cultura celular com o polímero termossensível polipropilacrilamida, também denominado pNIPAM. O segundo passo é cultivar as células de interesse em alta densidade sobre a superfície revestida com polímero para criar folhas celulares.

Em seguida, as lâminas são levantadas pela redução da temperatura da placa, o que permite que as células se soltem da placa na forma de uma lâmina contínua de células. O passo final consiste em transferir as lâminas de células intactas, sem rasgá-las, para um suporte destinado ao implante. Em última análise, pode-se utilizar uma microscopia de luz simples para demonstrar que a lâmina celular foi criada e mantida durante sua manipulação ao se produzir um material tecidual engenharizado implantável.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que incorporam células em matrizes semelhantes a hidrogéis, é que, com esta técnica, as bordas laterais das células podem ser geradas e mantidas como um tecido funcional. Esses métodos também podem viabilizar estudos adicionais na área da engenharia de tecidos. Por exemplo, com que eficiência as células sobrevivem após o transplante quando estão nesse estado organizado?

Demonstrará este procedimento o Dr. William Turner, pesquisador pós-doutorando em meu laboratório, e a Srta. Snapshot Sand Do. Para iniciar este procedimento, dissolva 2,6 gramas de P nipam em dois mililitros de uma solução de 60% de tolueno e 40% de hexano. Em seguida, aqueça a mistura a 60 graus Celsius por 10 minutos e agite até que o P nipam esteja completamente dissolvido.

Em seguida, corte o papel de filtro em um círculo de 60 milímetros de diâmetro e coloque-o em um funil de Büchner. Filtre a solução através do funil de Büchner em um béquer de vidro previamente pesado. Mantenha o béquer e seu conteúdo em uma câmara de vácuo durante a noite.

Posteriormente, pese o béquer com p NIPAM. Em seguida, adicione álcool isopropílico ao P NIPAM para criar uma solução peso/peso 50/50. A seguir, coloque dois mililitros da solução sobre a superfície da placa de cultura de tecidos e recubra por cinco minutos sob luz UV.

Em seguida, lave a placa com dois mililitros de PBS morno duas vezes antes de utilizá-la para cultura celular. Neste procedimento, primeiro, isole as células musculares lisas aórticas de rato lavando as células com dois mililitros de PBS morno. A seguir, adicione três mililitros de tripsina ou outra solução dissociadora clivadora às células e incube por cinco minutos.

Em seguida, adicione três mililitros do meio de cultura ou PBS contendo 10% de FBS às células. Depois disso, colete as células em um tubo cônico e conte-as. Posteriormente, centrifugue as células a 1000 RPM durante cinco minutos.

Aspire o sobrenatante e ressuspenda as células no meio de crescimento. Em seguida, coloque o meio contendo as células em uma placa termossensível de 35 milímetros numa concentração que alcance 100% de confluência, e incube a 37 graus Celsius durante a noite para manter a adesão celular à placa. Agora, colete as células endoteliais e dispersa-as numa solução de células individuais.

Um tampão de tripsina a um x, agudo ou de dissociação celular também pode ser usado para a dispersão em células isoladas. Em seguida, desative a enzima tripsina com uma quantidade igual de inibidor de tripsina de soja ou 10% de FBS em PBS. Então, colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros.

Conte as células com um hemocitômetro e calcule o volume necessário para as dimensões do retalho; para um retalho de quatro milímetros, são utilizadas 2 milhões de células endoteliais. Depois disso, retire 2 milhões de células e coloque-as em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células por cinco minutos, aspire o sobrenadante, deixando as células como um pellet no tubo cônico. Agora, prepare o hidrogel de aurina alta de acordo com o protocolo da empresa.

Misture aurina alta e gelatina líquida em uma proporção de um para um. Em seguida, transfira 80% do volume final total para o tubo cônico contendo o pellet, ressuspenda as células endoteliais na mistura de gelatina com aurina alta. A seguir, transfira as células suspensas para a matriz fibrosa.

Adicione 20% do volume final total do agente de reticulação e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Nesta etapa, retire a placa tratada de 35 milímetros de P nypa contendo as células do incubador e coloque-a em uma capela de cultura celular. À temperatura ambiente, aspire rapidamente o meio das células.

Em seguida, adicione dois mililitros de gelatina normal a 6%, a 37 graus Celsius, ao placa enquanto a gelatina ainda estiver morna, coloque a grade metálica na gelatina, submergindo-a abaixo da superfície da gelatina normal. Depois disso, coloque toda a placa sobre gelo por cinco a sete minutos, permitindo que a gelatina endureça. Após sete minutos, use uma espátula para separar cuidadosamente as bordas da gelatina da lateral da placa.

Em seguida, levante a grade metálica da placa com pinças. Transfira a lâmina de células para a placa e coloque-a sobre a combinação de hidrogel fibroso. Adicione dois mililitros de meio a 37 graus Celsius à placa de cultura de tecidos e incube durante a noite para permitir que a lâmina de células adira à superfície do hidrogel.

Enquanto isso, remova a grade metálica após o aquecimento da solução. Aqui, as células foram cultivadas em uma superfície revestida com Pippa e, em seguida, transferidas como uma lâmina para a superfície da matriz fibrosa. Ensaios iniciais que não foram transferidos com a grade metálica de gelatina resultaram em pequenos fragmentos desordenados.

Esta imagem representa uma composição inicial do desenho do retalho, combinando o marcador mito, células musculares lisas aórticas de rato coradas em vermelho, células endoteliais de veia umbilical humana fluorescentes em verde pelo indicador de cálcio e a imagem de luz transmitida. E esta é a composição da folha celular combinada com a combinação de hidrogel de matriz fibrosa de base mais resistente. Esta imagem composta foi obtida a partir da parte inferior do retalho através de uma matriz fibrosa de base mais resistente, e esta imagem composta das folhas celulares foi obtida sobre a matriz fibrosa de base.

Células em combinação com hidrogel na camada cobrem a base de hidrogel combinado com matriz fibrosa, que apresenta aumento da fluorescência nas bordas devido ao agrupamento das células. Esta é uma imagem de transmissão da estrutura, sendo mostrada aqui a matriz fibrosa natural autofluorescente em DPI. Após este procedimento, outros experimentos de engenharia de tecidos podem responder a outras questões, como como o alinhamento e a comunicação celular afetam o sucesso do transplante.

Essa técnica permite que pesquisadores em engenharia de tecidos explorem maneiras complexas de transplantar múltiplos tipos celulares. Não se esqueça de que trabalhar com solventes pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de máscaras apropriadas e capelas químicas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.