Simulando pâncreas Neuroplasticidade:

O objetivo geral do seguinte experimento é estudar as alterações reativas dos neurônios periféricos em diferentes microambientes pancreáticos. Isso é alcançado primeiramente gerando lisados de tecido integral a partir de pâncreas humano normal e tecido pancreático doente. Em um segundo passo, células de gânglios da raiz dorsal (DRG) são isoladas de ratos recém-nascidos, que posteriormente são tratadas com os lisados de tecido isolados.

Em seguida, após incubação por 48 horas, as células são fixadas para coloração subsequente por imunofluorescência dupla. Os resultados mostram as diferenças no padrão de ramificação e densidade de neurites dos neurônios e na densidade glial de neurônios cultivados em diferentes extratos teciduais. Este método pode auxiliar estudos na área de neurogastroenterologia, como o papel de mediadores moleculares e de alterações neuroplásticas em diferentes doenças gastrointestinais.

Embora este método possa fornecer informações sobre os diferentes atributos neurotróficos de doenças pancreáticas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como cânceres ou estados inflamatórios de todo o trato gastrointestinal. Tivemos inicialmente a ideia de utilizar esse método quando iniciamos nossas colaborações com pesquisadores na área de doenças neuropáticas no sistema pediátrico, como, por exemplo, a doença de Ong, e o adaptamos para nossos propósitos de homogeneizar o tecido pancreático humano. Transfira cubos de tecido pancreático de cinco por cinco por cinco milímetros diretamente da temperatura de menos 80 graus Celsius para nitrogênio líquido.

Em seguida, coloque os blocos congelados primeiramente em tubos de homogeneização que possam conter uma esfera metálica de dissociação e, depois, no homogeneizador de tecidos, homogeneize sem permitir que o tecido descongele imediatamente após a dissociação. Re-suspenda o homogenato semelhante a um pó sólido em 300 a 500 microlitros de PBS 0,1 X gelado. Não utilize nenhum tampão de lise, pois isso pode.

Lise os neurônios, em seguida centrifugue o homogenato a 21.130 ×g a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Recolha o sobrenadante claro, que contém o extrato tecidual, para coletar o sobrenadante de linhagem celular de linhagens celulares pancreáticas humanas. Cultive as células até atingirem pelo menos 70 a 80% de confluência no meio de crescimento normal.

Quando estiverem prontas, lave as células pelo menos três vezes com PBS de grau para cultura celular e cultive-as em meio livre de soro por até 48 horas. Em seguida, meça a concentração de proteína dos homogenatos teciduais ou dos sobrenadantes de linhagem celular por meio do ensaio de proteína de Bradford. Em seguida, alíquotas dos extratos teciduais e dos sobrenadantes de linhagem celular devem ser preparadas de modo que a concentração final do extrato ou sobrenadante no meio neuronal seja de 100 microgramas por mililitro.

E armazene-os a menos 80 graus Celsius. Usando um rato recém-nascido decapitado de P2 a P12, corte a pele e exponha a coluna vertebral. Em seguida, realize uma laminectomia anterior para expor a medula espinhal.

Em seguida, exponha e remova os gânglios da raiz dorsal ou DRGs. Coloque o gânglio da raiz dorsal em MEM gelado suplementado com gentamicina e metronidazol. Continue a coletar gânglios da raiz dorsal, iniciando pelos gânglios lombossacrais e avançando até os gânglios cervicais superiores.

Quando finalizado, 52 gânglios da raiz dorsal são coletados, quantidade suficiente para uma placa de 24 poços. Em seguida, use tesouras microcirúrgicas para separar os gânglios das suas raízes e nervos. Depois, remova todas as projeções periféricas e centrais remanescentes.

Após a coleta dos gânglios das raízes dorsais, incube-os em HBSS suplementado com colagenase do tipo dois a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Após a incubação, tri-ture os gânglios das raízes dorsais por meio de seringas com diâmetros decrescentes.

Observe que a tripsina em excesso pode destruir neurônios, mas é menos destrutiva para a glia. Assim que o meio contendo os GRDs ficar turvo, centrifugue a suspensão a 93,9 ×g por cinco minutos. Em seguida, descarte o meio e ressuspenda.

Suspenda as células em meio basal neural para preparar as células para o cultivo. Utilize um hemocitômetro para estimar o número total de neurônios e gliócitos. Em seguida, plante as células em lamínulas pré-revestidas de 13 milímetros.

Em uma placa de 24 poços, o revestimento utilizado depende dos objetivos experimentais. Em seguida, adicione o meio basal neuro sobre os poços e deixe as células aderirem aos poços durante a noite. No dia seguinte, descongele o meio suplementado com extrato tecidual ou o meio suplementado com sobrenadante de linhagem celular.

Em seguida, aspire o meio de semeadura dos GDRs e realize uma lavagem opcional, muito suave, com PBS. Então, pipete lentamente o tecido, o meio suplementado com extrato ou o sobrenadante de linhagem celular com meio suplementado sobre as células para obter 100 microgramas por mililitro. Agora, deixe as células crescerem por 48 horas a 37 graus Celsius no meio fornecido com extrato de tecido ou sobrenadante de linhagem celular após 48 horas.

Aspire o meio e fixe em paraformaldeído 4% para imunomarcação. Para dupla marcação por imunofluorescência, utilize marcadores específicos para neurônios e específicos para glia para análise da morfogeometria. Utilize um microscópio óptico invertido equipado com câmera CCD em combinação com software automatizado para medir a densidade de neuritos utilizando aumento de 200 x.

Meça a densidade de neuritos em culturas neuronais sobrepondo uma grade de 50 por 50 mícrons e contando a densidade de fibras por quadrado, medida nas fibras que se cruzam. Repita esta análise em quatro regiões diferentes com maior crescimento, em quatro a cinco microfotografias representativas de cada lamínula. Meça a extensão média dos neuritos, o número médio de ramificações por neurônio, o comprimento médio das ramificações e o tamanho perineural em 30 neurônios isolados selecionados aleatoriamente de cada lamínula, marcando os neuritos e os corpos celulares dos neurônios do GDR. Neurônios do GDR cultivados com um extrato tecidual de pâncreas normal são mostrados aqui.

Em contraste, neurônios do gânglio da raiz dorsal cultivados com extratos de tecido de pancreatite crônica ou câncer de pâncreas exibem uma maior densidade de neuritos. Aqui estão neurônios do plexo mioentérico cultivados com diversos extratos de tecido pancreático humano.

Neurônios do plexo mientérico cultivados em extratos de pâncreas com pancreatite crônica ou câncer de pâncreas desenvolvem neuritos mais longos e exibem um padrão de ramificação mais complexo do que aqueles cultivados em extratos de pâncreas normal. Quando neurônios de gânglios da raiz dorsal foram cultivados com o sobrenadante de células de câncer de pâncreas, observou-se também um aumento na densidade neural, semelhante ao observado com os extratos teciduais. Esse aumento, no entanto, foi reversível quando fatores neurotróficos selecionados, como nossa proteína ou fator de crescimento neural, foram esgotados ou bloqueados.

As células Ggl também respondem de maneira diferente a diferentes extratos de tecido pancreático, extratos de pancreatite crônica ou câncer de pâncreas, com aumento do crescimento de células gliais e contagem de células gliais em culturas de glia derivadas de gânglios da raiz dorsal. Embora o efeito tenha sido mais acentuado com extratos de câncer de pâncreas do que com extratos de pancreatite crônica, uma vez dominada. Esta técnica pode ser realizada em quatro a cinco horas se for executada corretamente após o seu desenvolvimento.

Este método abriu caminho para pesquisadores na área de neurogastroenterologia explorarem mecanismos de neuroplasticidade em diferentes doenças gastrointestinais, incluindo distúrbios gastrointestinais inflamatórios e malignos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar neurônos periféricos para estudar a neuroplasticidade pancreática no pâncreas e de como implementar esse sistema e outras alterações neurais e outros ensaios de neuroplasticidade em distúrbios gastrointestinais.