Question 1

Como a interferência de RNA funciona para silenciar genes em C. elegans?

Accepted Answer

O RNA de fita dupla entra nas células de C. elegans após a ingestão. A enzima Dicer cliva o dsRNA em RNA de interferência curta (siRNA), com 21-23 nucleotídeos de comprimento. O siRNA associa-se ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) e liga-se ao mRNA-alvo através do emparelhamento complementar de bases, levando à degradação do mRNA e à redução da expressão gênica.

Question 2

Qual é o primeiro passo na preparação de bactérias para experimentos de RNAi?

Accepted Answer

Transforme o plasmídeo que codifica seu dsRNA alvo em linhagem HT115(DE3) E. coli, que não possui RNA polimerase III e contém um gene de DNA polimerase T7 induzida por IPTG. Transforme também as bactérias com um plasmídeo vazio como controle. Espalhe as bactérias transformadas em placas de ágar LB contendo tetraciclina e carbenicilina, depois incube durante a noite a 37°C.

Question 3

Por que a sincronização de vermes é importante antes do tratamento com RNAi?

Accepted Answer

A sincronização de estágios de desenvolvimento assegura que as diferenças fenotípicas observadas resultem da redução gênica em vez de variação de desenvolvimento. Transfira vermes L4 para placas RNAi durante a noite a 20°C para se tornarem adultos jovens, depois mova-os para novas placas por 6-8 horas para botar ovos. Isso produz progênie sincronizada de desenvolvimento para análise.

Question 4

Como os pesquisadores usam RNAi para realizar triagens genéticas reversas?

Accepted Answer

Reverse genetic screens derrubam genes conhecidos de uma biblioteca e avaliam resultados fenótipos para descobrir a função do gene. Pesquisadores cultivam bactérias expressando dsRNA para muitos genes de C. elegans em placas de múltiplos poços e as alimentam para vermes. Efeitos fenótipos revelam funções normais do gene in vivo e podem ser automatizados para análise de alto rendimento de milhares de genes.

Question 5

O que acontece durante a fase de preparação da cultura bacteriana?

Accepted Answer

Selecione uma única colônia bacteriana e adicione-a a 1 ml de caldo LB com 100 μg/ml de ampicilina. Incube durante a noite a 37°C com agitação. Em seguida, adicione 5 ml de caldo LB fresco com ampicilina e incube por 4-6 horas a 37°C. Esta cultura é então adicionada a placas de vermes RNAi e incubada durante a noite a 37°C para criar um tapete bacteriano.

Question 6

Que fenótipos podem ser observados ao analisar vermes tratados com RNAi?

Accepted Answer

Compare os vermes com RNAi reduzido com os controles e note as diferenças no tamanho, estágio de desenvolvimento, morfologia e padrões de localização das proteínas marcadas fluorescentemente. Os cientistas também podem avaliar os efeitos no tempo de desenvolvimento, como genes que atrasam o desenvolvimento quando reduzidos, ou genes envolvidos em órgãos desenvolvimento e outros processos biológicos.

Question 7

Como é preparado um slide de microscópio para visualizar C. elegans?

Accepted Answer

Cole duas lâminas de vidro com fita adesiva de rotulagem como espaçadores. Coloque uma lâmina limpa entre eles e pipete 150 μl de ágar derretido a 4% sobre ela. Cubra com uma lâmina perpendicular, depois separe gentilmente. Adicione 10 μl de anestésico de azida de sódio ao disco de ágar, transfira os vermes usando uma ponta de platina, adicione um lamínula e observe ao microscópio.

RNAi em C. elegans - Questionário de avaliação