Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como implementar o condicionamento comportamental de uma resposta reflexiva simples a alimentos em abelhas melíferas. Isso é realizado primeiramente capturando abelhas melíferas, imobilizando-as em arneses, alimentando-as com uma pequena quantidade de solução secreta e, em seguida, permitindo que se acostumem à imobilização. Em seguida, são selecionadas contas para condicionamento que mostrem motivação suficiente quando suas antenas são tocadas com sacarose.

Durante o condicionamento, a apresentação do odor é associada a uma recompensa de sacarose para induzir a resposta condicionada. Em seguida, ensaios não reforçados medem a presença ou ausência da resposta, a latência da resposta e a duração da resposta. A etapa final consiste na análise dos dados e na apresentação gráfica dos ensaios de condicionamento e teste.

Essa técnica tem sido aplicada com sucesso a estudos da biologia e da saúde das abelhas; o comportamento de aprendizado é particularmente sensível a tratamentos disruptivos, como pesticidas, tornando possível avaliar o impacto desses tipos de tratamentos sobre o comportamento das abelhas em níveis subletais. A demonstração visual desse método auxilia na compreensão do tempo de estímulo necessário para um condicionamento eficaz e dos erros comuns que reduzem sua efetividade. Um indivíduo novo nesse método terá dificuldades com o cuidado com os detalhes exigidos tanto pelo protocolo quanto pelas condições ambientais.

Para começar, colete abelhas operárias na entrada da colônia enquanto elas param antes de partir ou ao retornarem da coleta de alimento. Capture apenas uma abelha por frasco. Segure a abertura do frasco na posição horizontal ou voltada para baixo ao prender a tampa, para evitar a fuga.

Uma vez coletadas as abelhas, retorne ao laboratório e coloque alguns dos frascos de cada vez em uma mistura de água e gelo. Assim que uma abelha ficar imóvel, remova imediatamente o frasco do gelo para evitar exposição excessiva e coloque a abelha em um suporte de contenção. Prenda a abelha com o tórax dorsal voltado para a parte recortada do suporte e a cabeça ligeiramente acima da borda superior.

Pressione suavemente a abelha para que suas peças bucais se estendam além da borda do suporte. Deslize uma tira de fita adesiva entre a cabeça e o tórax no lado dorsal e prenda firmemente a extremidade solta ao lado do suporte. Certifique-se de que a fita no arnês esteja lisa e bem esticada.

Não deve haver lacunas visíveis entre a frente do suporte da abelha e a fita. Se houver lacunas, a abelha pode não conseguir estender adequadamente seu per bees ou pode ser capaz de escapar. Deixe as abelhas cerca de 30 minutos para se recuperarem do confinamento antes de alimentá-las.

Em seguida, em uma área distante da área de treinamento, ofereça a cada abelha cerca de três a quatro microlitros de sacarose 0,5 molar durante o intervalo entre a alimentação e o condicionamento. Coloque as abelhas em uma área tranquila do laboratório e em um recipiente de plástico com toalhas de papel úmidas. Nesse período, alguns minutos antes de iniciar o condicionamento, teste a motivação das abelhas para se alimentar tocando suas antenas com uma pequena gota de solução de sacarose 0,5 molar.

Não permita que eles se alimentem durante este teste. Se responderem estendendo seus psis, provavelmente estão suficientemente motivados para aprender e podem ser usados para o protocolo. Quando estiver pronto, coloque a seringa de vidro para odor em um suporte de massa de modelar e ajuste-a para que a abertura na extremidade larga aponte diretamente para as abelhas e 10 E. A extremidade da seringa deve estar a um ou dois centímetros da abelha, colocando firmemente a peça que conecta o cartucho ao sistema de tubos e válvulas de fluxo de ar na extremidade estreita da seringa.

No início de cada ensaio, posicione a abelha presa na haste da arena de condicionamento com suas antenas apontando diretamente para o cartucho de odor. Deixe a abelha descansar na arena por 15 a 25 segundos antes de iniciar o estímulo odorante, para que se acostume com o novo ambiente. Pressione o botão de início para acionar o mecanismo de temporização para a liberação do odor.

Monitore a resposta da abelha ao odor após o início do estímulo e antes da apresentação do estímulo incondicionado. Após cada ensaio, permita que a abelha descanse na área de condicionamento por mais 15 a 25 segundos para permitir a formação inicial da memória. Mover a abelha muito cedo após o ensaio reduzirá significativamente a eficácia de cada ensaio de condicionamento.

Para administrar a sacarose, segure a ponta da agulha a dois ou três centímetros da abelha enquanto o odor é apresentado. Use a borda da arena de treinamento para evitar tremer a seringa, pois esse movimento pode distrair a abelha. Um sinal sonoro de alimentação será emitido durante a apresentação do estímulo odorífero.

Assim que o sinal de alimentação soar, toque levemente as antenas até que a abelha protruda o probóscide, então alimente a abelha. O intervalo entre a apresentação do odor e a apresentação da sacarose é crítico. Idealmente, esses dois estímulos devem se sobrepor brevemente.

Se transcorrer mais de alguns segundos entre a apresentação do odor e a apresentação da sacarose, o desempenho no condicionamento diminuirá. Após o condicionamento, utilize ensaios de teste não reforçados para avaliar quão bem as abelhas lembram da associação condicionada. Primeiro, posicione uma câmera de vídeo sobre um tripé acima da área de treinamento e foque a câmera na parte frontal da cabeça da abelha, de modo que as antenas e o probóscide fiquem em foco nítido.

Certifique-se de que uma pequena luz LED, que indica a apresentação do estímulo odorante, esteja em uma área atrás da abelha e visível no vídeo, mas não para a abelha. Isso permite a identificação do momento de início e término do odor durante a análise. Para obter os resultados mais consistentes, utilize cartuchos de odor recém-preparados para o teste, uma vez que tudo esteja configurado.

Inicie o teste apresentando o odor conforme mostrado anteriormente. Comece a gravar 20 segundos antes de apresentar o odor e continue a gravação por pelo menos 20 segundos após a apresentação. Após o teste, utilize um software de edição de vídeo para pontuar a resposta de cada abelha à condição em relação ao estímulo.

Utilize um sistema de pontuação binária para avaliar a resposta de extensão do psis, classificando as respostas como positivas ou negativas. Classifique a resposta de B como positiva. Quando o psis de B se estende além da linha formada pela conexão das pontas das mandíbulas abertas, considere apenas como resposta positiva se B estender seus probóiscis após o início do odor, mas antes do término do odor. Classifique a resposta de B como negativa quando não houver extensão do probóscis durante a tentativa, ou se o probóscis for estendido após o término do odorante. Outros parâmetros podem ser registrados, como a latência da extensão, o número e a duração total das respostas de extensão em relação à condição.

O estímulo aumentou ao longo dos ensaios subsequentes de condicionamento. As respostas a odores teste novos, que diferiam do estímulo no comprimento da cadeia carbônica e/ou na posição da ligação carbono-carbono, foram reduzidas proporcionalmente ao grau de diferença entre o estímulo condicionado e o odor teste novo. Esses dados ilustram a variabilidade e o condicionamento bem-sucedido entre novos pesquisadores.

As respostas ao octal diferiram conforme o grupo que realizou o teste. Durante os ensaios experimentais, o odor utilizado como estímulo condicionado provocou a resposta mais intensa. Quando o octal foi usado como estímulo condicionado, a resposta foi mais forte durante o teste em comparação com a metilciclona, um odor novo.

Da mesma forma, o ciclone de metila produziu respostas mais intensas quando foi usado como estímulo condicionado. Quando foi emparelhado em ordem inversa, a resposta condicionada reduziu-se a níveis próximos aos do odor novo, ilustrando a importância de um tempo preciso para um condicionamento bem-sucedido após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem as bases neurais da aprendizagem e da memória em organismos-modelo de insetos, como a abelha melífera.

Não se esqueça de que trabalhar com insetos, especialmente abelhas melíferas, pode ser perigoso. Certifique-se de usar equipamentos de proteção adequados ao trabalhar com esses animais.