Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

O protocolo de condicionamento Proboscis Extension Response (PER), desenvolvido para a abelha melífera (Apis mellifera), fornece um meio ecologicamente relevante e facilmente quantificável para estudar vários mecanismos diferentes de aprendizagem em muitas espécies de insetos.

O objetivo geral deste procedimento é mostrar como implementar o condicionamento comportamental de uma resposta reflexiva simples ao alimento em abelhas. Isso é feito primeiro capturando as abelhas, prendendo-as em arreios, alimentando-as com uma pequena quantidade de solução secreta e, em seguida, permitindo que elas se acostumem com a restrição. Em seguida, as contas são selecionadas para condicionamento que mostram motivação suficiente quando suas antenas são tocadas com sacarose.

Durante o condicionamento, a apresentação do odor é combinada com uma recompensa de sacarose para provocar a resposta condicionada. Em seguida, os ensaios não reforçados medem a presença ou ausência da resposta, a latência da resposta e a duração da resposta. A etapa final é a análise dos dados e a apresentação gráfica dos ensaios de condicionamento e teste.

Esta técnica tem sido aplicada com sucesso a estudos de biologia de abelhas e o comportamento de aprendizagem em saúde é particularmente sensível a tratamentos disruptivos, como pesticidas, tornando possível avaliar o impacto desses tipos de tratamentos no comportamento das abelhas em níveis subletais. A demonstração visual desse método ajuda a entender o tempo de estímulo necessário para um condicionamento eficaz e os erros comuns que reduzem a eficácia. Um indivíduo novo neste método terá dificuldades com a atenção aos detalhes exigidos tanto no protocolo quanto nas condições circundantes.

Para começar, colete as abelhas operárias na entrada da colônia enquanto elas param antes de partir ou quando retornam da forrageamento. Capture apenas uma abelha por frasco. Segure a abertura do frasco horizontalmente ou voltada para baixo enquanto fecha a tampa para evitar fugas.

Depois que as abelhas forem coletadas, retorne ao laboratório e coloque alguns frascos de cada vez em uma pasta de água gelada. Quando uma abelha estiver imóvel, remova o frasco do gelo imediatamente para evitar a superexposição e coloque a abelha em um arnês de contenção. Prenda a abelha com o tórax dorsal voltado para a parte cortada do suporte e a cabeça logo acima do topo.

Pressione suavemente a abelha para que suas partes bucais se estendam além da borda do suporte. Deslize uma tira de fita adesiva entre a cabeça e o tórax no lado dorsal e prenda firmemente a extremidade livre na lateral do suporte. Certifique-se de que a fita do arnês esteja lisa e esticada.

Não deve haver lacunas perceptíveis entre a frente do porta-abelhas e a fita. Se houver lacunas, a abelha pode não ser capaz de estender seu per bois adequadamente ou pode escapar. Permita que as abelhas se recuperem do arreio antes de se alimentarem.

Em seguida, em uma área bem longe da área de treinamento, alimente cada abelha com cerca de três a quatro microlitros de sacarose 0,5 molar durante o intervalo entre a alimentação e o condicionamento. Coloque as abelhas em uma área tranquila do laboratório e em um recipiente de plástico com toalhas de papel molhadas. Durante esse período, alguns minutos antes de iniciar o condicionamento, testa a motivação para se alimentar tocando suas antenas com uma pequena gota de solução de sacarose 0,5 molar.

Não permita que eles se alimentem durante este teste. Se eles responderem estendendo seu psis, provavelmente estão suficientemente motivados para aprender e podem ser usados para o protocolo. Quando estiver pronto, coloque a seringa de vidro em um suporte de argila de modelagem e ajuste-a de forma que a abertura na extremidade larga fique apontada diretamente para as abelhas e 10 E. A extremidade da seringa deve estar a um a dois centímetros da abelha colocada com segurança o encaixe conectando o cartucho ao tubo Airstream e ao sistema de válvula sobre a extremidade estreita da seringa.

No início de cada tentativa, coloque a abelha aproveitada na estaca na arena de condicionamento com suas antenas apontadas diretamente para o cartucho de odor. Deixe a abelha descansar na arena por 15 a 25 segundos antes de iniciar o estímulo de odor para permitir que ela se acostume com o novo ambiente. Pressione o botão Iniciar para iniciar o mecanismo de temporização para a entrega do odor.

Monitore a resposta da abelha ao odor após o início do estímulo e antes da apresentação do estímulo incondicionado. Após cada teste, deixe a abelha descansar na área de condicionamento por mais 15 a 25 segundos para permitir a formação inicial da memória. Mover a abelha muito cedo após o teste reduzirá significativamente a eficácia de cada teste de condicionamento.

Para entregar a sacarose, segure a ponta da agulha a dois a três centímetros da abelha enquanto o odor é apresentado. Use a borda da arena de treinamento para evitar sacudir a seringa, pois esse movimento pode distrair a abelha. Um sinal de alimentação soará durante a apresentação do estímulo de odor.

Assim que o sinal de alimentação soar, toque levemente nas antenas até que a abelha se estenda como probos, então alimente a abelha. O tempo entre a apresentação do odor e a apresentação da sacarose é crítico. Idealmente, esses dois estímulos devem se sobrepor brevemente.

Se decorrerem mais de alguns segundos entre a apresentação do odor e a apresentação da sacarose, o desempenho no condicionamento diminuirá. Após o condicionamento, use testes não reforçados para avaliar o quão bem as abelhas se lembram da associação condicionada. Primeiro, instale uma câmera de vídeo em um tripé acima da área de treinamento e foque a câmera na frente da cabeça da abelha para que as antenas e o probo fiquem em foco nítido.

Certifique-se de que uma pequena luz LED, que indica a apresentação do estímulo de odor, esteja em uma área atrás da abelha e onde seja visível no vídeo, mas não para a abelha. Isso permite a identificação do tempo de início e deslocamento do odor durante a análise. Para obter resultados mais consistentes, use cartuchos de odor recém-preparados para testar assim que tudo estiver configurado.

Comece o teste apresentando o odor conforme mostrado anteriormente. Comece a gravar 20 segundos antes de apresentar o odor e continue gravando por pelo menos 20 segundos depois. Após o teste, use um software de edição de vídeo para pontuar a resposta de cada abelha à condição ao estímulo.

Use um sistema de pontuação binário para pontuar a resposta de extensão psis, pontuando as respostas como positivas ou negativas. Pontuação B Resposta como positiva. Quando o B extensus psis além da linha feita conectando as pontas das mandíbulas abertas só pontua uma resposta positiva quando o B estende seu prob bois após o início do odor, mas antes do odor compensar, pontue a resposta de B como negativa quando não há extensão do prob Bois durante o teste, ou se o Pro Bois é estendido após o deslocamento do odorante, Outros parâmetros podem ser coletados, como a latência para extensão e o número e a duração total das respostas de resposta de extensão à condição.

O estímulo aumentou em relação aos testes de condicionamento subsequentes. As respostas a novos odores de teste, que diferiram do estímulo no comprimento da cadeia de carbono e/ou posição do carbono carbono, foram reduzidas proporcionalmente ao grau de diferença entre o estímulo de condição e o novo odor de teste. Esses dados ilustram a variabilidade e o condicionamento bem-sucedido entre os novos investigadores.

As respostas ao octal diferiram dependendo do grupo que realizou o teste. Durante os testes, o odor usado como estímulo de condição provocou a resposta mais forte. Quando o octal foi usado como estímulo de condição, a resposta foi mais forte durante o teste quando comparada ao ciclone metil, um novo odor.

Da mesma forma, o ciclone metil produziu respostas mais fortes quando foi usado como estímulo condicionado. Quando o emparelhamento reverso foi usado, a resposta condicionada foi reduzida para perto do nível do novo odor, ilustrando a importância do tempo preciso para o condicionamento bem-sucedido após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem as bases neurais do aprendizado e da memória e organismos modelo de insetos, como a abelha.

Não se esqueça de que trabalhar com insetos, especialmente abelhas, pode ser perigoso. Certifique-se de usar equipamentos de proteção adequados ao trabalhar com esses animais.