Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e preparar testículos de drosófilas para microscopia. Isso é realizado primeiramente pela dissecação dos pares de testículos a partir do abdômen de moscas macho. O segundo passo consiste em rasgar os testículos no estágio apropriado de desenvolvimento e esmagá-los para liberar as células internas.

Em seguida, os testículos esmagados são fixados e então incubados com anticorpos primários e secundários. O passo final é montar o tecido em uma lâmina para análise por imagem. Por fim, utiliza-se microscopia de contraste de fase ou imunofluorescência para observar células em diferentes estágios da espermatogênese, avaliando defeitos e morfologia, bem como para observar as localizações subcelulares de diversas proteínas.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como a identificação de papéis essenciais de proteínas durante a progressão da espermatogênese. A demonstração visual da dissecação dos testículos de RAs é fundamental, pois um iniciante nesse procedimento pode inicialmente ter dificuldade em localizar os testículos dentro do abdômen da mosca. Além disso, é mais fácil demonstrar do que descrever por palavras a maneira mais eficaz de realizar a prensagem do tecido.

Para iniciar a dissecação, anestesie moscas em um frasco ou tubo usando um fluxo de dióxido de carbono. Em seguida, transfira as moscas anestesiadas para uma placa para moscas. Separe as moscas sob um microscópio estereoscópico utilizando um pincel pequeno para coletar aproximadamente seis a oito machos oph do genótipo desejado.

Em seguida, remova as asas de cada mosca com pinças. Isso impedirá que as moscas flutuem no líquido. Durante a dissecação, adicione 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS em uma única gota sobre uma placa de dissecação revestida com silicone sobre um fundo preto.

Em seguida, direcione a pinça para a extremidade anterior de uma das moscas sem asas. Segure-a pelo tórax e imerja-a na gota de PBS. Identifique a estrutura marrom-escura localizada na extremidade posterior do abdômen ventral e use outro par de pinças para segurar e puxar as genitálias externas em direção posterior até que se soltem do abdômen.

Na maioria dos casos, os testículos, vesículas seminais e glândula acessória serão removidos do abdômen junto com as glândulas genitais externas. No entanto, se isso não ocorrer, insira um par de pinças no abdômen e retire cuidadosamente os testículos. Separe os testículos das glândulas acessórias e das glândulas genitais externas utilizando dois pares de pinças.

Distinga os testículos do tipo selvagem dos tecidos brancos adjacentes pela sua cor amarela. Para preparar a amostra para imagem em tempo real, use uma pinça para colocar suavemente dois a três pares de testículos em uma gota de quatro a cinco microlitros de PBS sobre uma lamínula de vidro quadrada. Em seguida, rasgue.

Abra cada testículo com uma pinça em uma posição de nível apropriada para maximizar a presença dos tipos celulares da linhagem germinativa desejados no preparo. O conteúdo dos testículos sairá pela região rompida e se espalhará sobre a lâmina. Durante a etapa de esmagamento para enriquecer espermátogonias e espermatócitos, rompa os testículos adjacentes à sua ponta apical para enriquecimento.

Para espermatócitos e espermátides, rasgue os testículos em uma posição ligeiramente basal ao nível um para enriquecer com células germinativas mais maduras. Abra os testículos mais próximo ao ponto onde começa a curvatura. O próximo passo é esmagar os testículos colocando suavemente uma lâmina de microscópio sobre a lamínula.

Não aplique pressão manualmente e evite aprisionar bolhas de ar. Utilize a amostra dentro de 15 minutos após a preparação para observar células vivas. Por microscopia de contraste de fase, remova suavemente com uma toalha de limpeza qualquer líquido em excesso sob a lamínula, permitindo o achatamento da preparação até que as células germinativas fiquem claramente em foco.

Congele rapidamente lâminas preparadas contendo testículos esmagados mergulhando-as com um par de pinças de metal em nitrogênio líquido até que a agitação do líquido cesse. Remova imediatamente a lamínula com uma lâmina de barbear. Em seguida, transfira as lâminas com as pinças de metal para um suporte de vidro previamente resfriado, cheio com etanol a 95% gelado, e armazene a amostra a menos 20 graus Celsius por 10 minutos.

Transfira as lâminas equilibradas para uma grade de vidro contendo 4% de formaldeído em PBS com 0,1% de Triton X-100 ou PBST e armazene à temperatura ambiente por sete minutos. Em seguida, transfira as lâminas para uma grade contendo PBS. Lave as lâminas em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente, descartando a solução da grade e substituindo-a por solução fresca de PBS.

Repita a lavagem uma vez. Descarte o PBS e imerja as lâminas em PBST por 30 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as membranas celulares. Em seguida, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos cada, à temperatura ambiente. Desenhe um círculo ao redor do tecido esmagado na lâmina com uma caneta de barreira hidrofóbica, a fim de conter as soluções de anticorpos e manter o tecido úmido durante todo o procedimento de imunomarcação.

Em seguida, adicione de 30 a 40 microlitros de anticorpo primário diluído em PBST ao tecido dentro do círculo. Incube a lâmina em uma câmara úmida e escura por duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius após a incubação com o anticorpo primário. Lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 30 a 40 microlitros de um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo, diluído em PBS, ao tecido e incube no escuro por uma a duas horas à temperatura ambiente. A seguir, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. Então, adicione 30 a 40 microlitros de solução DAPI ao tecido dentro do círculo.

Coloque suavemente uma lamínula de vidro sobre o tecido, tomando cuidado extra para evitar aprisionar bolhas de ar. Se aparecerem bolhas de ar, mova cuidadosamente a lamínula sem destruir a amostra até que as bolhas escapem pelas bordas da lamínula. Remova o excesso de líquido das bordas da lâmina com um lenço de limpeza.

Em seguida, selar a lamínula usando esmalte e observar as células imunomarcadas em microscópio fluorescente dentro de três a quatro horas. Este desenho esquemático mostra a localização dos diversos níveis de maturação celular nos testículos de drosófila. O nível um contém células mais jovens que estão nos estágios iniciais da espermatogênese, e o nível três contém células espermáticas mais maduras.

O nível dois contém uma população mista de células germinativas mióticas e pós-mióticas. Uma imagem correspondente em contraste de fase mostra a liberação de espermatogônias e espermatócitos primários iniciais e tardios quando os testículos são rompidos no nível um. A seta amarela também aponta para uma fusão de duas ou mais células interconectadas provenientes de citocinese incompleta.

Um artefato do procedimento de esmagamento mostrado aqui é uma imagem correspondente em contraste de fase que mostra a liberação de espermatócitos primários tardios e células pós-meióticas, incluindo espermátides redondas, espermátides alongadas e espermatozoides maduros, quando os testículos foram rompidos no nível dois. A microscopia de contraste de fase de testículos esmagados também pode ser usada para identificar prontamente defeitos nas abundantes espermátides redondas. Espermátides selvagens com um núcleo claro em fase, mostradas aqui, estão ligadas a um agregado mitocondrial único escuro em fase de tamanho aproximadamente igual.

Em contraste, espermátides de testículos Aun contêm múltiplos núcleos pequenos e um grande agregado mitocondrial como resultado da falha na citocinese e erros na segregação cromossômica. As imagens em escala de cinza mostradas aqui são provenientes de uma preparação de testículos esmagados corados com reagentes que identificam os microtúbulos, o DNA e os centrômeros em cores. As imagens combinadas mostram um espermatócito em divisão, um grande campo de espermátides redondos e um feixe de espermatozoides maduros. Após dominar a preparação das amostras para contraste de fase, a microscopia pode ser realizada em 20 a 30 minutos.

O preparo de amostras para microscopia de imunofluorescência pode ser realizado em seis horas se for feito corretamente. Além do processamento de testículos de oph para microscopia, testículos dissecados podem ser alternativamente utilizados para a análise bioquímica de proteínas.