Name: Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo Drosophila Testes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a dissecar e preparar testículos de Drosophila para microscopia de contraste de fase e imunofluorescência. Este método permite observar estágios da espermatogênese e localização subcelular de proteínas.

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Os autores gostariam de agradecer a Michael Anderson para a criação em laboratório Lee estes métodos aceitos para estudar espermatogênese com aconselhamento especializado de Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente forneceu a γ-tubulina-GFP voar estoque. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para LAL (GM074044).

1. Testes Dissection <ol><li> Anestesiar moscas em uma garrafa ou frasco, usando um fluxo de CO 2 e transferir para uma almofada de mosca. </li><li> Ordenar opera sob um microscópio de dissecação com um pequeno pincel, e recolher um número apropriado (dependendo do ensaio) de Drosophila, os machos dos genótipos desejáveis. Jovens do sexo masculino (0-2 dias de idade) são ideais para examinar as células ao longo das etapas anteriores da espermatogênese (por exemplo, espermatogônias, espermatócitos e espermátides iniciais pós-meióticas), enquanto que os homens um pouco mais velhos (2-5 dias de idade) são ideais para examinar células nos estágios finais da espermatogénese (em particular, o esperma maduro). </li><li> Use uma pinça para remover as asas de cada voar (para evitar que as moscas de flutuando no líquido durante a dissecção). </li><li> Adicionar ~ 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3 mM de NaH 2 PO 4; PBS) numa gota de um prato de dissecação com revestimento de silicone emum fundo preto. Outras soluções aquosas têm sido usados ​​com sucesso para os testículos dissecção 3. </li><li> Ponto de fórceps para o anterior da mosca, segure-o pelo tórax e mergulhá-lo na queda PBS. Durante a visualização através do microscópio de dissecação, use outro par de fórceps para agarrar e puxar a genitália externa (estrutura marrom escuro localizado na extremidade posterior do abdome ventral) posteriormente até que ele se separa do abdômen. Na maioria dos casos, os testículos, vesículas seminais e glândula acessória vai ser removido do abdómen, juntamente com os órgãos genitais externos e, se não, inserir um único par de fórceps para o abdómen e provocar os testículos. </li><li> Testículos separadas de glândula acessória e genitais externos utilizando dois pares de pinças na gota de PBS (Figura 2). De tipo selvagem testículos são facilmente distinguidos dos tecidos brancos vizinhos por sua cor amarela. Vá imediatamente para a etapa 2. </li><li> Para isolar os testículos dos machos pharate (i.. E fechada dentro da caixa de pupa), um passo adicional tem de ser realizada primeiramente que envolve a remoção da mosca do caso de pupa, este passo tem sido previamente descrita 31. Prossiga com dissecção como para os testículos adultos começando no passo 1.2. </li><li> Para isolar os testículos dos machos larvais, realizar uma modificação de um protocolo para isolar ovários de larvas de Drosophila 32. Resumidamente, as larvas do sexo masculino pode ser distinguido a partir de larvas femininas pela presença de um par de estruturas grandes, claros, ovais (testículos larva) incorporados no terço posterior do corpo gordo. Para isolar os testículos larvais, parcialmente esfolar abrir a larva do sexo masculino para isolar os testículos e o corpo gordo circundante do abdómen, tal como descrito para o isolamento de ovários de larvas. Prosseguir imediatamente para a etapa 2 do protocolo aqui descrito, os testículos pode depois ser removido do corpo gordo pouco antes da montagem (passos 2.3 ou 3.14) como descrito para os ovários 32. </li></ol><ol><li> Use uma pinça para colocar suavemente 2-3 pares de testículos em uma gota de 4-5 ml de PBS em uma praça lamínula de vidro. Note-se que a razão entre o número testículos ao volume PBS pode precisar de ser ajustado: muito líquido vai evitar que as células se espalhe corretamente quando esmagado, enquanto muito pouco líquido fará com que as células de estourar quando esmagado. Opcional: Use capa siliconizada desliza para minimizar a aderência de tecido para cobrir deslizamento no passo 3.2. </li><li> Utilizar um par de pinças para rasgar cada testículo numa posição apropriada de modo a maximizar a presença de tipos de células da linha germinal desejados na preparação (notar que o conteúdo do testículo principalmente vai egresso da região rasgada na lâmina durante o esmagamento etapa.) Para enriquecer para espermatogônias e espermatócitos, rasgar abrir o testículo adjacente à sua ponta apical (nível 1, Figura 2B). Para enriquecer para espermatócitos e espermátides, rasgar abrir o testículo em um position ligeiramente basal ao nível 1 (nível 2, Figura 2B). Para enriquecimento em células da linha germinal mais maduros, rasgar a testículo mais perto de onde a curvatura começa (nível 3, Figura 2B). </li><li> Delicadamente, coloque uma lâmina de vidro sobre a lamínula para esmagar os testículos; não aplique pressão manualmente, como o peso de só a lamínula é suficiente para obter uma amostra adequada esmagado. Tente evitar bolhas de interceptação. Opcional: Utilização de poli-L-lisina revestido lâminas de microscópio para promover a aderência do tecido a deslizar no passo 3.2. </li><li> Use preparação imediatamente (de preferência dentro de 15 minutos de preparação) para observar células vivas por microscopia de contraste de fase, pois moscas transgênicas com expressão de proteínas fluorescentes marcados nos testículos, células vivas podem ser examinados por microscopia de fluorescência nesta etapa. Alternativamente, proceder com a fixação e coloração de anticorpos (Protocolo 3). </li><li> Gentilmente pavio qualquer excesso de líquido sob a lamela usando uma limpeza wipe para permitir o achatamento de preparação até que as células germinais são claramente em foco. </li></ol> 3. Formaldeído Fixação e Coloração Anticorpo <ol><li> Encaixar congelar cada slide contendo testículos esmagados (das Protocolo 2) usando um par de pinças de metal para mergulhá-lo brevemente em nitrogênio líquido (até nitrogênio líquido pára borbulhando). </li><li> Retire a tampa de deslizamento imediatamente usando uma lâmina de barbear. </li><li> Use pinças metálicas para transferir lâminas para uma grade deslizante de vidro previamente arrefecido com gelo-etanol frio a 95% (grau de espectrofotometria, livre de metanol). Armazenar a -20 ° C durante 10 min. </li><li> Use pinças metálicas para transferir lâminas para uma grade deslizante de vidro cheio com 4% de formaldeído em PBS mais 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Armazenar à temperatura ambiente durante 7 min. </li><li> Use pinças de metal para transferir slides para um porta-lâminas de vidro cheio de PBS. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 1x. Executar todas as lavagens de solução descartando no rack lâmina de vidro ( <em&gt; Ie. derramando-o para fora) e substituindo com solução fresca. </li><li> Descartar o PBS e mergulhar as lâminas em PBS-T, durante 30 minutos à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas das células. </li><li> Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 2x. </li><li> Bloqueio passo (opcional): mergulhar as lâminas em PBS mais 1% de BSA durante 45 min à temperatura ambiente. </li><li> Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo no slide em torno de tecido amassado (facilmente visível a olho nu), a fim de limitar as soluções de anticorpos (adicionados em passos 3,9 e 3,11). O tecido deve ser mantido úmido em todos os momentos durante a execução de imunomarcação. </li><li> Adicionar 30-40 mL de anticorpo primário (diluído em PBS-T, 1:400 a 1:50, dependendo do anticorpo) para o tecido no interior do círculo. Se o bloqueio foi realizado, diluir o anticorpo primário em PBS-T + 1% de BSA. Anticorpo anti-gama-tubulina (por coloração de centrossomas na Figura 4) foi diluída de 1:100. Incubar em uma câmara escura úmida (caixa de plástico, por exemplo. Fechadocom toalhas de papel húmidas) durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas em PBS por 5 min a sala de 3x de temperatura. Se o bloqueio foi realizado, lavar duas vezes em PBS-T, e uma vez em PBS (5 min a temperatura ambiente, cada um). </li><li> Adicionar 30-40 mL de anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (diluído 1:400 em PBS) para o tecido e incubar no escuro durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 2x. </li><li> Adicionar 30-40 mL de solução DAPI (0,2 mg / ml em PBS) para o tecido no interior do círculo. </li><li> Delicadamente, coloque uma lamínula de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar bolhas de interceptação. Se bolhas de ar devem aparecer, cuidadosamente mover ao redor da lamínula sem destruir a abóbora até que as bolhas escapar dos lados da lamínula. </li><li> Use uma limpeza limpar para apagar o excesso de DAPI a partir das bordas do slide. </li><li> Selar a lamela para o slide usando claro unha polonês. </li><li> Use esta preparaçãono próximo 3-4 hr para ver células imunomarcadas por microscopia fluorescente. Para o armazenamento de longo prazo de lâminas (até, pelo menos, várias semanas), use uma mídia difícil montar à base de glicerol com DAPI, e armazenar a -20 ˚ lâminas C. </li><li> Em alternativa, fixar as amostras em metanol em vez de formaldeído (dependendo do antigénio). Depois de completar todo o protocolo até a etapa 3.2, mergulhe as lâminas de testículos esmagados em metanol por 10 min a -20 ° C e prossiga com o passo 3.5 em diante. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Embora os testículos de moscas do tipo selvagem pode ser facilmente identificado, devido à sua cor amarela (em contraste, os tecidos brancos vizinhos), os testículos de moscas mutantes brancos são brancos e, assim, eventualmente, pode ser confundido com o intestino. Mais estirpes transgénicas, que são tipicamente num fundo branco, também têm testículos branco porque o mini-gene de branco encontrada em P-elementos não promove a acumulação de pigmentos nos testículos. Quando os testícul...

Testículos de Drosophila são um sistema modelo ideal para o estudo de muitos processos biológicos incluindo a regulação das células estaminais, a meiose, e desenvolvimento do esperma 13-18. Os espermatócitos e os seus fusos meióticos são grandes e, portanto, conveniente para análise citológica e relaxado checkpoints do ciclo celular durante a espermatogênese facilitar o estudo de mutações em genes do ciclo celular. Diferentes tipos de células pode ser observada na progressão ordenada ao longo do comprimento dos testículos, e qualquer interrupção da espermatogénese pode conduzir a alterações neste arranjo global. Estas características combinadas com ferramentas genéticas Drosophila têm facilitado a análise mutacional da espermatogênese 21-23. As fases de Drosophila espermatogénese foram bem definidos. As células da linha germinativa que se desenvolvem de forma síncrona nos cistos progredir sequencialmente através das fases de espermatogénese ao longo do comprimento do testículo. Durante both da mitose e meiose divisões das células germinais masculinas, citocinese ocorre de forma incompleta de modo a que as células filhas permanecem ligados por pontes citoplasmáticos conhecidos como canais de anel (Figura 1). A extremidade apical do testículo contém uma população de células estaminais da linha germinativa, que dá origem a células spermatogonial, que se submetem a quatro divisões mitóticas com citocinese incompletos para gerar cistos de 16 células de espermatócitos primários. Após a fase S pré-meiótica, espermatócitos primários entrar G2, um período prolongado de crescimento ~ 90 horas, durante o qual o volume celular aumenta ~ 25 vezes. Progressão através da meiose I e meiose II resulta na formação de quistos de 32 células de espermatócitos secundários e de cistos de 64 células de espermatídeos haplóides, respectivamente. As espermátides arredondadas, imaturos passam por extensos remodelamento celular para formar espermatozóides maduros. Células pós-meióticas, em especial os molhos de alongamento e espermatídeos maduros, ocupam a maior parte do volume do testículo. Tele o transporte de sucesso de esperma funcional para moscas fêmeas requer a coordenação entre as diferentes partes do sistema reprodutor masculino, a qual é composta de várias estruturas emparelhados (os testículos, vesículas seminais e glândulas acessórias) e de uma única conduta ejaculatório (Figura 2). Os espermatozóides são produzidos dentro dos testículos e armazenado dentro das vesículas seminais até a cópula 24. As glândulas acessórias conter células secretoras de fluido seminal. O esperma migração das vesículas seminais são misturados com o fluido seminal dentro do ducto ejaculatório, a qual está ligada a ambas as vesículas seminais e glândulas acessórias. Esta mistura de esperma e fluido seminal é finalmente bombeado para fora do macho no interior da vagina da fêmea voar através do bulbo ejaculatório localizado na extremidade posterior do abdómen macho 25. As proteínas no fluido seminal, são essenciais para a armazenagem prolongada de esperma dentro de órgãos especializados conhecidos como Espermatecas na reptrato roductive de Drosophila fêmeas 26. Excelentes métodos para o isolamento de testículos de Drosophila e a visualização de células em vários estádios da espermatogénese estão disponíveis na literatura científica 3-12. Nós aqui acrescentar a este corpo de conhecimento, apresentando exemplos desses protocolos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. O protocolo para a preparação de amostras de testículos vivos para microscopia de fase de contraste baseia-se num método anteriormente descrito 27. O protocolo para a fixação de formaldeído e imunocoloração de testículos também se baseia em um método previamente descrito 28. As abordagens aqui descritos têm sido utilizados em vários estudos de Drosophila espermatogénese (por exemplo, para avaliar as funções da dineína, um motor de microtúbulos menos dirigida-fim, durante a espermatogénese de Drosophila). Além dos protocolos básicos, são apresentadas sugestões para varying a dissecação, de modo a enriquecer a espermatogônias, espermatócitos, ou espermatozóides maduros. Diferentes métodos para o processamento dos testículos tais que cistos ou permanecem intactos ou são interrompidos quando necessário são descritos. Uma vantagem no uso de testículos de Drosophila como sistema modelo é que, em comparação com oócitos e embriões de Drosophila, os anticorpos e corantes podem facilmente penetrar nas células após a sua dispersão a partir dos testículos, e menos passos de lavagem são necessários, assim, os protocolos podem ser realizadas em um relativamente curto espaço de tempo.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Elastômero de silicone de duas partes para fazer prato de dissecação revestido de silicone da placa de Petri Kimax</td></tr><tr><td>Caneta PAP</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Protetor de unhas transparente</td><td></td> Reagente antidesbotamento <td>Wet n Wild</td> 7780235001 <td></td></tr><tr><td>ProLong Gold com DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-gama-tubulina de camundongo (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldeído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Use de acordo com as instruções do fabricante para siliconizar lamínulas</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 mg / ml em etanol a 75%; armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Limpadores de tarefas delicadas Fisher</td><td>Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de coloração Coplin de vidro</td> de grau de biologia molecular, tampa de rosca <td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio fosco simples</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina revestida lâminas</td><td>de microscópio Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Opcional (para substituir lâminas de microscópio não tratadas)</td></tr> <tr><td>Vidro de cobertura quadrado</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 Pinça EMD</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Padrão 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS estereoscópio</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetiva Plan-Fluor 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objetiva</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

citológica análise da espermatogênese: preparados ao vivo e fixo<em&gt; drosophila</em&gt; testes

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster é um poderoso sistema modelo que tem sido amplamente utilizado para elucidar de uma variedade de processos biológicos. Por exemplo, estudos, tanto do sexo feminino e as linhas germinativas masculinas de Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão atual da meiose, bem como a biologia de células-tronco. Excelente protocolos estão disponíveis na literatura para o isolamento e imagiologia de ovários e testículos 3-12 Drosophila. Aqui, os métodos para a dissecação e preparação de testes de Drosophila para análise microscópica são descritos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. Um protocolo para o isolamento de testículos do abdómen de adultos do sexo masculino e preparar as lâminas de tecido vivo, para análise por microscopia de contraste de fase, bem como o protocolo para a fixação e imunocoloração testículos para análise por microscopia de fluorescência são apresentados. Estas técnicas podem ser aplicadas na caracterização de mutantes de Drosophila que exibem defects na espermatogénese, assim como na visualização de localizações subcelulares de proteínas.

Um exemplo de um par adequadamente dissecados dos órgãos reprodutores masculinos de Drosophila é mostrado na Figura 2A. Testículos do abdómen da mosca adulta masculina está normalmente ligado ao ducto ejaculatório (castanho, Figura 2A &#39;) e um par de glândulas acessórias (verde, Figura 2A&#39;), através de um par de vesículas seminais (azul, Figura 2A &#39;) . Para separar os testículos da maioria do tecido somático que o acompanha, o ducto ...

Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e preparar testículos de drosófilas para microscopia. Isso é realizado primeiramente pela dissecação dos pares de testículos a partir do abdômen de moscas macho. O segundo passo consiste em rasgar os testículos no estágio apropriado de desenvolvimento e esmagá-los para liberar as células internas.Em seguida, os testículos esmagados são fixados e então incubados com anticorpos primários e secundários. O passo final é montar o tecido em uma lâmina para análise por imagem. Por fim, utiliza-se microscopia de contraste de fase ou imunofluorescência para observar células em diferentes estágios da espermatogênese, avaliando defeitos e morfologia, bem como para observar as localizações subcelulares de diversas proteínas.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como a identificação de papéis essenciais de proteínas durante a progressão da espermatogênese. A demonstração visual da dissecação dos testículos de RAs é fundamental, pois um iniciante nesse procedimento pode inicialmente ter dificuldade em localizar os testículos dentro do abdômen da mosca. Além disso, é mais fácil demonstrar do que descrever por palavras a maneira mais eficaz de realizar a prensagem do tecido.Para iniciar a dissecação, anestesie moscas em um frasco ou tubo usando um fluxo de dióxido de carbono. Em seguida, transfira as moscas anestesiadas para uma placa para moscas. Separe as moscas sob um microscópio estereoscópico utilizando um pincel pequeno para coletar aproximadamente seis a oito machos oph do genótipo desejado.Em seguida, remova as asas de cada mosca com pin&ccedil;as. Isso impedir&aacute; que as moscas flutuem no l&iacute;quido. Durante a disseca&ccedil;&atilde;o, adicione 500 microlitros de solu&ccedil;&atilde;o salina tamponada com fosfato ou PBS em uma &uacute;nica gota sobre uma placa de disseca&ccedil;&atilde;o revestida com silicone sobre um fundo preto.Em seguida, direcione a pinça para a extremidade anterior de uma das moscas sem asas. Segure-a pelo tórax e imerja-a na gota de PBS. Identifique a estrutura marrom-escura localizada na extremidade posterior do abdômen ventral e use outro par de pinças para segurar e puxar as genitálias externas em direção posterior até que se soltem do abdômen.Na maioria dos casos, os testículos, vesículas seminais e glândula acessória serão removidos do abdômen junto com as glândulas genitais externas. No entanto, se isso não ocorrer, insira um par de pinças no abdômen e retire cuidadosamente os testículos. Separe os testículos das glândulas acessórias e das glândulas genitais externas utilizando dois pares de pinças.Distinga os testículos do tipo selvagem dos tecidos brancos adjacentes pela sua cor amarela. Para preparar a amostra para imagem em tempo real, use uma pinça para colocar suavemente dois a três pares de testículos em uma gota de quatro a cinco microlitros de PBS sobre uma lamínula de vidro quadrada. Em seguida, rasgue.Abra cada testículo com uma pinça em uma posição de nível apropriada para maximizar a presença dos tipos celulares da linhagem germinativa desejados no preparo. O conteúdo dos testículos sairá pela região rompida e se espalhará sobre a lâmina. Durante a etapa de esmagamento para enriquecer espermátogonias e espermatócitos, rompa os testículos adjacentes à sua ponta apical para enriquecimento.Para espermatócitos e espermátides, rasgue os testículos em uma posição ligeiramente basal ao nível um para enriquecer com células germinativas mais maduras. Abra os testículos mais próximo ao ponto onde começa a curvatura. O próximo passo é esmagar os testículos colocando suavemente uma lâmina de microscópio sobre a lamínula.Não aplique pressão manualmente e evite aprisionar bolhas de ar. Utilize a amostra dentro de 15 minutos após a preparação para observar células vivas. Por microscopia de contraste de fase, remova suavemente com uma toalha de limpeza qualquer líquido em excesso sob a lamínula, permitindo o achatamento da preparação até que as células germinativas fiquem claramente em foco.Congele rapidamente lâminas preparadas contendo testículos esmagados mergulhando-as com um par de pinças de metal em nitrogênio líquido até que a agitação do líquido cesse. Remova imediatamente a lamínula com uma lâmina de barbear. Em seguida, transfira as lâminas com as pinças de metal para um suporte de vidro previamente resfriado, cheio com etanol a 95% gelado, e armazene a amostra a menos 20 graus Celsius por 10 minutos.Transfira as lâminas equilibradas para uma grade de vidro contendo 4% de formaldeído em PBS com 0,1% de Triton X-100 ou PBST e armazene à temperatura ambiente por sete minutos. Em seguida, transfira as lâminas para uma grade contendo PBS. Lave as lâminas em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente, descartando a solução da grade e substituindo-a por solução fresca de PBS.Repita a lavagem uma vez. Descarte o PBS e imerja as lâminas em PBST por 30 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as membranas celulares. Em seguida, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos cada, à temperatura ambiente. Desenhe um círculo ao redor do tecido esmagado na lâmina com uma caneta de barreira hidrofóbica, a fim de conter as soluções de anticorpos e manter o tecido úmido durante todo o procedimento de imunomarcação.Em seguida, adicione de 30 a 40 microlitros de anticorpo primário diluído em PBST ao tecido dentro do círculo. Incube a lâmina em uma câmara úmida e escura por duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius após a incubação com o anticorpo primário. Lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 30 a 40 microlitros de um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo, diluído em PBS, ao tecido e incube no escuro por uma a duas horas à temperatura ambiente. A seguir, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. Então, adicione 30 a 40 microlitros de solução DAPI ao tecido dentro do círculo.Coloque suavemente uma lamínula de vidro sobre o tecido, tomando cuidado extra para evitar aprisionar bolhas de ar. Se aparecerem bolhas de ar, mova cuidadosamente a lamínula sem destruir a amostra até que as bolhas escapem pelas bordas da lamínula. Remova o excesso de líquido das bordas da lâmina com um lenço de limpeza.Em seguida, selar a lamínula usando esmalte e observar as células imunomarcadas em microscópio fluorescente dentro de três a quatro horas. Este desenho esquemático mostra a localização dos diversos níveis de maturação celular nos testículos de drosófila. O nível um contém células mais jovens que estão nos estágios iniciais da espermatogênese, e o nível três contém células espermáticas mais maduras.O nível dois contém uma população mista de células germinativas mióticas e pós-mióticas. Uma imagem correspondente em contraste de fase mostra a liberação de espermatogônias e espermatócitos primários iniciais e tardios quando os testículos são rompidos no nível um. A seta amarela também aponta para uma fusão de duas ou mais células interconectadas provenientes de citocinese incompleta.Um artefato do procedimento de esmagamento mostrado aqui é uma imagem correspondente em contraste de fase que mostra a liberação de espermatócitos primários tardios e células pós-meióticas, incluindo espermátides redondas, espermátides alongadas e espermatozoides maduros, quando os testículos foram rompidos no nível dois. A microscopia de contraste de fase de testículos esmagados também pode ser usada para identificar prontamente defeitos nas abundantes espermátides redondas. Espermátides selvagens com um núcleo claro em fase, mostradas aqui, estão ligadas a um agregado mitocondrial único escuro em fase de tamanho aproximadamente igual.Em contraste, espermátides de testículos Aun contêm múltiplos núcleos pequenos e um grande agregado mitocondrial como resultado da falha na citocinese e erros na segregação cromossômica. As imagens em escala de cinza mostradas aqui são provenientes de uma preparação de testículos esmagados corados com reagentes que identificam os microtúbulos, o DNA e os centrômeros em cores. As imagens combinadas mostram um espermatócito em divisão, um grande campo de espermátides redondos e um feixe de espermatozoides maduros. Após dominar a preparação das amostras para contraste de fase, a microscopia pode ser realizada em 20 a 30 minutos.O preparo de amostras para microscopia de imunofluorescência pode ser realizado em seis horas se for feito corretamente. Além do processamento de testículos de oph para microscopia, testículos dissecados podem ser alternativamente utilizados para a análise bioquímica de proteínas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imagiologia de proteínas centrosomal durante Drosophila espermatogénese é um método potente para identificar novas proteínas críticas para a biologia do centrossoma, bem como para elucidar a função particular de jogadores conhecidos neste processo.

Centrossomas de imagem na mosca Testículos

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo descreve a dissecção e o cultivo de testículos intactos e cistos germinativos de pupas de Drosophila melanogaster. Este método permite a observação microscópica da espermatogênese ex vivo. Além disso, descrevemos um ensaio farmacológico do efeito dos inibidores em estágios específicos do desenvolvimento de células germinativas em testículos de pupa.

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Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

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O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

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O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

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Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

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Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

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Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.

Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

Aprenda a dissecar e preparar testículos de Drosophila para microscopia de contraste de fase e imunofluorescência. Este método permite observar estágios da espermatogênese e localização subcelular de proteínas.

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