IHC de Drosophila Larval

<em>Drosophila</em> Larval IHC

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Larval IHC

3.2: Drosophila Maintenance

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08:29 min

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May 10, 2013

Overview

A imunohistoquímica (IHC) é uma técnica usada para visualizar a presença e localização de proteínas dentro dos tecidos. As larvas de drosophila são particularmente favoráveis ao IHC devido à facilidade com que podem ser processadas para coloração. Além disso, as larvas são transparentes, o que significa que alguns tecidos podem ser visualizados sem a necessidade de dissecção.

No IHC, as proteínas são finalmente detectadas com anticorpos que se ligam especificamente a “epítopos” dentro da proteína de interesse. Para preservar esses epítopos, os tecidos devem ser fixados antes da coloração. Além disso, para que os anticorpos penetrem nas membranas, as células devem ser permeabilizadas com detergentes. Este artigo em vídeo oferece uma visão detalhada dos reagentes, ferramentas e procedimentos necessários para a coloração de tecidos larvais dissecados, incluindo fixação, bloqueio e etapas de coloração. Destaque também para uma demonstração de técnicas de montagem de tecidos para microscopia de fluorescência. Finalmente, são fornecidos exemplos da ampla gama de aplicações para essas técnicas (e algumas variações sobre elas).

Procedure

Drosophila melanogaster é um organismo modelo amplamente estudado devido à sua versatilidade e facilidade de uso.

A imunohistoquímica realizada nas preparações larvais de Drosophila é um método inestimável que pode fornecer informações sobre a presença, localização e co-localização de proteínas.

Este vídeo abordará os métodos essenciais para a dissecção, fixação, bloqueio e montagem de tecido larval Drosophila e exemplos de suas aplicações.

A imunohistoquímica é um processo que usa anticorpos modificados para atingir, ligar e, finalmente, visualizar proteínas específicas no tecido.

A imunohistoquímica da larva de Drosophila depende da dissecção adequada, que exige precisão e pontualidade devido à sensibilidade do tecido larval.

A dissecção é normalmente feita em soro fisiológico tamponado de fosfato, ou “PBS” para abreviar.

Após a extração os órgãos são temporariamente colocados em PBS â uma solução salina com o mesmo pH do pH interno da larva.

Após a dissecção, o próximo passo na larva Drosophila IHC é a fixação.

A fixação é um processo onde o tecido é colocado em uma solução diluída à base de formaldeído, que preserva o tecido.

Esta solução de fixação evita a quebra enzimática de proteínas no tecido.

Após a fixação, várias etapas de lavagem ocorrem durante todo o processo de imunossuagem usando PBS contendo Triton-X, chamado PBST.

Triton-X100 fornece uma pequena quantidade de detergente que serve como um disjuntor de tensão superficial e permeabiliza a célula, permitindo que anticorpos e outros reagentes entrem.

Após fixação e lavagem, o tecido está pronto para o bloqueio.

A solução de bloqueio contém proteínas que se ligam ao tecido e ocupam locais de ligação não específicos aos quais os anticorpos específicos do alvo adeririam de outra forma. O bloqueio ajuda a prevenir um falso sinal de proteína positivo.

Depois de bloquear o tecido é preparado para coloração.

A coloração incorpora um anticorpo “primário” altamente específico que se liga a uma proteína alvo chamada antígeno.

Um anticorpo “secundário” conjugado a uma molécula de repórter liga o anticorpo primário.

A molécula do repórter emite um sinal localizado que pode ser visualizado, que muitas vezes é fluorescente na natureza.

Após cada etapa de incubação de anticorpos, o excesso de anticorpos é lavado para remover quaisquer anticorpos que tenham ligado sem especificamente.

Após o processo de coloração, a amostra deve ser montada.

Para ver os resultados da coloração, o tecido deve ser cuidadosamente montado em lâminas.

Um reagente espesso ou meio de montagem é usado para encear o tecido.

A amostra está então pronta para ser vista sob o microscópio.

Agora que passamos pelos princípios da imunohistoquímica de Drosophila, estamos prontos para ver como se faz.

Neste vídeo vamos focar nos reagentes, ferramentas e processos usados na imunohistoquímica do cérebro larval Drosophila começando com fixação.

O processo que estamos seguindo usa todo o cérebro e é conhecido como coloração de montagem inteira.

Embora o procedimento de dissecção difere dependendo do tipo de tecido usado para o experimento, as principais etapas do IHC permanecem as mesmas, por isso vamos pular para a etapa de fixação.

Uma vez que a dissecção dos cérebros larvais esteja completa, remova a PBS com uma pipeta.

Adicione fixativo e incubar de acordo com seu protocolo específico, para que o cérebro use 23 min.

Após a fixação, lave amostras quatro vezes em PBST.

Incubar amostras em solução de bloqueio por pelo menos 30 min de temperatura ambiente.

Usando as diluições apropriadas, incubar-se em solução de anticorpos primários durante a noite a 4 °C.

Após o período de incubação, lave os cérebros quatro vezes em PBST com uma ponta de pipeta à temperatura ambiente.

Incubar as amostras em anticorpos secundários durante a noite a 4 °C no escuro para evitar que os fluoroforos branqueem.

Novamente, lave os cérebros quatro vezes no PBST.

Equilibre os cérebros em meio de montagem por uma hora.

Após o equilíbrio, transfira os cérebros para um slide usando uma pipeta p200 com a ponta cortada.

Coloque os espaçadores ao redor da amostra para evitar que ela seja esmagada.

Coloque uma mancha de cobertura sobre as amostras.

Sele as bordas de deslizamento com esmalte. Cérebros larvais estão agora prontos para serem visualizados com imunohistoquímica

Agora que cobrimos a imunohistoquímica dos cérebros de Drosophila, vamos passar por algumas formas alternativas de aplicar procedimentos de IHC.

Técnicas alternativas de dissecção e fixação podem ser usadas para preparar larva de Drosophila para imagem.

Neste experimento, os pesquisadores querem aprender como as células geram formas específicas.

Eles fazem isso rastreando as morfologias das células terminais traqueais larvais.

Os pesquisadores se aproveitam de uma linha de moscas mutante que expressa GFP.

A expressão GFP é induzida pela exposição ao calor em um banho de água

Larvas são selecionadas sob um microscópio de dissecção com fluorescência.

Moscas que emitem fluorescência indicam ativação bem sucedida de GFP.

Estas moscas são submetidas a uma forma alternativa de fixação por calor; nenhuma dissecção é necessária.

Após o uso de software para auxiliar o rastreamento, são identificadas morfologias celulares de ramos traqueais e lúmen.

O ovário Drosophila é um excelente modelo para entender como as células-tronco interagem com seu ambiente celular.

O IHC dos ovários de Drosophila começa pela identificação de fêmeas de Drosophila pela presença de ovários versus testículos, que são aparentes em machos.

As larvas fêmeas coletadas são transferidas para poços individuais onde são cuidadosamente dissecadas para obter uma estrutura conhecida como corpo de gordura, que abriga os ovários.

Corpos de gordura são fixos e manchados, e então – depois de colocar o tecido em lâminas – os ovários são separados do tecido corporal gordo. Após a montagem e visualização dos slides, a coloração fluorescente revela a localização de células sommáticas e células germinativas primordiais no ovário larval .

A imunohistoquímica das larvas de Drosophila tem muitos paralelos com pupal e IHC adulto.

Por exemplo, os pesquisadores podem usar o IHC para olhar as retinas de Drosophila em diferentes estágios de desenvolvimento: larval, pupal e adulto, ilustrando assim a diferença entre procedimentos de pupal, larval e imunohistoquímica adulta.

Os resultados mostram as várias etapas de desenvolvimento das retinas de Drosophila.

A imunohistoquímica da larva de Drosophila é uma ferramenta com uma grande quantidade de aplicações e variações. Neste vídeo, cobrimos os procedimentos para larvas imunossustaining, incluindo dissecção, fixação, coloração e montagem. Obrigado por assistir!

Transcript

Drosophila melanogaster is a widely studied model organism due to its versatility and facility of use.

Immunohistochemistry performed on Drosophila larval preparations is an invaluable method that can provide information on the presence, location, and the co-localization of proteins.

This video will cover the essential methods for the dissection, fixation, blocking, and mounting of Drosophila larval tissue and examples of their applications.

Immunohistochemistry is a process that uses modified antibodies to target, bind, and ultimately visualize specific proteins in tissue.

Immunohistochemistry of Drosophila larva hinges on proper dissection, which demands accuracy and timeliness due to the sensitivity of larval tissue.

Dissection is typically done in phosphate buffered saline, or “PBS” for short.

Upon extraction organs are temporarily placed in PBS – a saline solution with the same pH as the internal pH of the larva.

After dissection the next step in Drosophila larva IHC is fixation.

Fixation is a process where tissue is placed in a diluted formaldehyde-based solution, which preserves tissue.

This fixing solution prevents the enzymatic breakdown of proteins in tissue.

Following fixation, several washing steps occur throughout the immunostaining process using PBS containing Triton-X, called PBST.

Triton-X100 provides a small amount of detergent that serves as a surface tension breaker and permeabilizes the cell, allowing antibodies and other reagents to enter.

After fixation and washing, the tissue is ready for blocking.

Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites to which the target-specific antibodies would otherwise adhere. Blocking helps to prevent a false positive protein signal.

After blocking the tissue is prepared for staining.

Staining incorporates highly-specific “primary” antibody that binds to a target protein called an antigen.

A “secondary” antibody conjugated to a reporter molecule binds the primary antibody.

The reporter molecule emits a localized signal that can be visualized, which is often fluorescent in nature.

Following each antibody incubation step, excess antibody is washed off to remove any antibodies that have bound nonspecifically.

After the staining process, the sample must be mounted.

In order to see the results of staining, the tissue must be carefully mounted onto slides.

A thick reagent or mounting medium is used to encase the tissue.

The sample is then ready to be viewed under the microscope.

Now that we’ve gone through the principles of Drosophila immunohistochemistry, we’re ready to see how it’s done.

In this video we’ll focus on the reagents, tools, and processes used in the immunohistochemistry of the Drosophila larval brain beginning with fixation.

The process we are following uses the entire brain and is known as whole mount staining.

While the dissection procedure differs depending on the tissue type used for the experiment, the major steps of IHC remain the same so we’ll skip to the fixation step.

Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.

Add fixative and incubate for according to your specific protocol, for brains use 23 min.

Following fixation, wash samples four times in PBST.

Incubate samples in blocking solution for at least 30 min room temperature.

Using the appropriate dilutions, incubate in primary antibody solution overnight at 4 °C.

After the incubation period wash brains four times in PBST with a pipette tip at room temperature.

Incubate the samples in secondary antibody overnight at 4 °C in the dark to prevent the fluorophores from bleaching.

Again, wash brains four times in PBST.

Equilibrate the brains in mounting medium for one hour.

After equilibration transfer the brains to a slide using a p200 pipette with the tip cut off.

Place spacers around the sample to prevent it from being crushed.

Place a coverslip over the samples.

Seal the slip edges with nail polish. Larval brains are now ready to be visualized with immunohistochemistry

Now that we’ve covered the immunohistochemistry of Drosophila brains, let’s go through some alternative ways of applying IHC procedures.

Alternative dissection and fixation techniques can be used to prepare Drosophila larva for imaging.

In this experiment, researchers want to learn how cells generate specific shapes.

They do this by tracing the morphologies of larval tracheal terminal cells.

The researchers take advantage of a mutant fly line that expresses GFP.

The GFP expression is induced by exposure to heat in a water bath

Larvae are selected under a dissection microscope with fluorescence.

Flies emitting fluorescence indicate successful activation of GFP.

These flies are submitted to an alternative form of fixation by heat; no dissection is necessary.

After using software to assist tracing, cellular morphologies of tracheal branches and lumen are identified .

The Drosophila ovary is an excellent model for understanding how stem cells interact with their cellular environment.

IHC of Drosophila ovaries begins by identifying Drosophila females by presence of ovaries versus testes, which are apparent in males.

Collected female larvae are transferred to individual wells where they are carefully dissected to obtain a structure known as the fat body, which houses the ovaries.

Fat bodies are fixed and stained, and then – after placing the tissue on slides – the ovaries are separated from fat body tissue. After mounting and visualizing the slides, fluorescent staining reveals the location of somatic cells and primordial germ cells in the larval ovary .

Immunohistochemistry of Drosophila larvae has many parallels to pupal and adult IHC.

For example, researchers can use IHC to look at Drosophila retinas at different developmental stages: larval, pupal, and adult, thereby illustrating the difference between pupal, larval, and adult immunohistochemistry procedures.

Results show the various stages of development of Drosophila retinas.

Immunohistochemistry of Drosophila larva is a tool with a large amount of applications and variations. In this video we covered the procedures for immunostaining larvae including dissection, fixation, staining, and mounting. Thanks for watching!