Name: Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a analisar apoptose em embriões de zebrafish usando imunofluorescência whole-mount para detectar Caspase 3 ativada. Este método permite visualizar células apoptóticas em diferentes estágios de desenvolvimento.

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O financiamento foi fornecido pela Huntsman Cancer Foundation (CJ, CT), American Cancer Society grant #RSG-13-025-01-CSM (RS) e NIH T32 GM007464-36 (SS).

1. Preparação de Soluções
<ol>
	<li>Prepare 500 ml de 1x PBST (1x PBS, 0,1% Tween-20) e esterilize com filtro. 1x PBST pode ser mantido em temperatura ambiente (RT) indefinidamente, desde que não haja sinais de crescimento bacteriano.</li>
	<li>CUIDADO: Prepare 50 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% em uma capa química dissolvendo o PFA em pó em 1x PBS a 60 °C por 1 hora e cobrindo com papel alumínio para proteger da luz. Conservar a 4 °C durante 1 mês ou a -20 °C durante 2 anos.</li>
	<li>Prepare 500 ml de 1x PDT fresco (1x PBST, 0,3% Triton-X, 1% DMSO). 1x PDT pode ser armazenado a 4 °C por até um mês.</li>
	<li>Prepare 50 ml de tampão de bloqueio (1x PBST, soro fetal bovino inativado por calor a 10%, albumina de soro bovino a 2%). Crie alíquotas de 10 ml e armazene a -20 °C por até 1 ano. Depois de descongelado, o tampão de bloqueio pode ser armazenado a 4 °C por até 48 horas.</li>
	<li>Prepare 100 ml de metilcelulose a 4% aquecendo 30 ml de água a 80 °C. Adicione 4 g de metilcelulose à água quente e misture usando uma barra de agitação em uma placa de agitação em temperatura ambiente. A mistura completa geralmente leva entre 4 horas e durante a noite. Adicione o restante da água (não aquecida) e misture a 4 °C por 1 hora. Armazene na RT.</li>
	<li>Se utilizar embriões entre a fase de botão caudal e 32 hpf, preparar 50 ml de 10 mg/ml de pronase e conservar durante 1 semana a 4 °C. Caso contrário, conservar em alíquotas de 10 ml a -20 °C durante um período máximo de 1 ano.</li>
	<li>Colocar 50 ml de metanol a 100% a -20 °C.</li>
	<li>Prepare 60x água de ovo dissolvendo 280 g de sal marinho oceano instantâneo em 2 L de água destilada (como em Westerfield16). Prepare 1x água de ovo diluindo o caldo 60x em água deionizada.</li>
</ol>
2. Preparação de embriões
<ol>
	<li>Colete embriões de peixe-zebra em uma placa de Petri em 1x água de ovo entre o estágio de 4 células e 32 hpf.
	<ol>
		<li>Para embriões entre os estágios de 4 células e botão de cauda, prossiga para a etapa 2.2.</li>
		<li>Para embriões entre o estágio de botão de cauda e 32 hpf, remova os córions adicionando 100 μl de 10 mg / ml de pronase aos embriões em 10 ml de 1x água de ovo.</li>
		<li>Nota: A atividade do Pronase pode ser variável entre os lotes. Assim, a concentração final de pronase deve ser otimizada para descorionação quando novos lotes são obtidos.
		<ol>
			<li>Deixe incubar em temperatura ambiente por 30 min.</li>
			<li>Despeje a água do ovo / solução de pronase no lixo e, lentamente, adicione de volta 1x água fresca do ovo.</li>
			<li>Enxágue 2x despejando a água do ovo existente (e os córions flutuantes) e adicione delicadamente a nova água do ovo.</li>
			<li>Nota: A maioria dos córions deve ser removida neste ponto. Com uma pipeta de transferência, chupe suavemente os embriões para cima e para baixo até que os córions restantes sejam removidos.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transferir até 40 embriões para um tubo de 1,5 ml. Enxágue 2 vezes com 1 ml de 1x PBST.  </li>
	<li>Remova o PBST, deixando o líquido logo acima dos embriões (aproximadamente 100 μl de volume devem permanecer no tubo). Adicione 1 ml de 4% de PFA. Coloque os tubos de lado (para que os embriões se espalhem ao longo do comprimento do tubo) em um recipiente de tamanho apropriado para facilitar o transporte (por exemplo, uma placa de Petri ou uma pipeta) e coloque em um balancim suave a 4 ° C durante a noite ou até uma semana.  
	<ol>
		<li>Para embriões entre os estágios de 4 células e botão de cauda, descorione manualmente os embriões fixados com fórceps.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedimento de imunofluorescência
<ol>
	<li>Coloque os tubos em um suporte de tubos para que todos os embriões afundem no fundo do tubo. Remova o PFA (para o recipiente de lixo apropriado) deixando o líquido logo acima do nível dos embriões. Após a fixação (etapa 2.3), os embriões nunca devem ser expostos ao ar para evitar a coloração de anticorpos de fundo.</li>
	<li>Adicione 1 ml de metanol 100% gelado (para permeabilizar) gota a gota. Os embriões agora são frágeis após a fixação, e cuidados extras devem ser tomados para evitar que caiam dentro do tubo durante toda a remoção/adição subsequente de líquidos. Coloque os tubos de lado e coloque a -20 °C por 2 horas. Alternativamente, os embriões podem ser deixados a -20 °C por até 24 horas.</li>
	<li>Coloque os tubos em um rack para coletar embriões na parte inferior do tubo. Remova o metanol, deixando o líquido logo acima do nível dos embriões.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 1 ml 1x PDT. Remova o PDT e adicione 1 ml de PDT 1x fresco. Coloque os tubos de lado e balance suavemente em RT por 30 minutos. Remova o PDT e repita a lavagem de 30 min com PDT fresco.</li>
	<li>Remova a PDT até que o líquido esteja um pouco acima do nível dos embriões e adicione 500 μl de tampão de bloqueio.
	<ol>
		<li>Coloque os embriões de lado em um contêiner de transporte e certifique-se de que os embriões não viajem mais de 2/3 do comprimento do tubo. Caso contrário, os embriões ficam presos na tampa do tubo e fora do líquido.  </li>
		<li>Coloque cuidadosamente o recipiente de transporte com tubos em um balancim muito suave em RT por 1 hora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque os tubos na vertical em um suporte para tubos e abra todos os tubos para verificar se há embriões presos na tampa. Para qualquer tubo com embriões na tampa, feche a parte superior e balance suavemente o tubo com a mão para trazer todos os embriões de volta ao líquido.</li>
	<li>Adicionar 1 μl de anticorpo Caspase 3 antiativado em coelho (diluição a 1:500).
	<ol>
		<li>Se estiver realizando um experimento de comarcação, basta adicionar a diluição apropriada do segundo anticorpo não derivado de coelho, além do anticorpo anti-ativado Caspase 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque cuidadosamente os embriões de lado e balance suavemente em temperatura ambiente por 2 horas. Alternativamente, os embriões podem ser incubados a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Coloque os tubos em um rack de tubos. Remova a solução de bloco / anticorpo. Adicione 1 ml de 1x PDT. Certifique-se de inverter o tubo manualmente para coletar quaisquer embriões presos na tampa do tubo. Em seguida, abra todos os tubos para garantir que todos os embriões foram removidos da tampa.</li>
	<li>Repita a etapa 3.4.</li>
	<li>Repita as etapas 3.5-3.10, mas substitua o anticorpo anti-ativado Caspase 3 pela diluição apropriada de um anticorpo conjugado com fluoróforo de coelho que absorve a luz azul e emite luz verde. No entanto, qualquer anticorpo conjugado com fluoróforo com um espectro de absorção/emissão preferível ao usuário pode ser usado aqui. Após a adição do anticorpo secundário, é importante manter os embriões no escuro durante o restante do ensaio. Cubra o recipiente de transporte com papel alumínio durante as etapas de incubação, mas não se preocupe com a exposição à luz ao trocar os amortecedores.
	<ol>
		<li>Se estiver realizando um experimento de comarcação, basta adicionar a diluição apropriada de um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo complementar nesta etapa.</li>
		<li>Nota: Se o usuário desejar rotular a Caspase 3 ativa com células que expressam Gfp, o anticorpo anti-Caspase 3 anti-ativo de coelho deve ser seguido aqui por um anticorpo secundário anti-coelho não fluorescente verde, e o anticorpo anti-GFP deve ser seguido por um anticorpo secundário não coelho fluorescente verde. Isso eliminará a confusão se alguma fluorescência Gfp permanecer visível após a fixação dos embriões.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Análise de células apoptóticas por microscopia de fluorescência
<ol>
	<li>Analise embriões em 1x PDT em uma pequena placa de Petri ou placa de vidro sob um microscópio fluorescente usando o filtro de luz apropriado. Se os controles positivos tiverem fluorescência brilhante com fundo mínimo, prossiga para a etapa 4.2. (Caso contrário, consulte a seção de solução de problemas na Discussão e repita o protocolo com novos embriões.) Os embriões podem ser armazenados a 4 °C em 1x PDT por até 48 horas.</li>
	<li>Despeje 4% de metilcelulose em uma placa de Petri de 3,5 cm, apenas o suficiente para cobrir o fundo da placa. Alternativamente, uma placa de ponto de vidro ou lâmina de depressão pode ser usada com uma grande gota de metilcelulose na depressão. Sugue cuidadosamente os embriões do fundo do tubo para uma pipeta de transferência limpa e transfira para a placa de Petri para visualização.</li>
	<li>Oriente um embrião de interesse para documentação usando uma sonda angular. Provavelmente haverá alguma variabilidade entre embriões da mesma amostra, por isso é importante tirar imagens que representem a intensidade e o padrão de fluorescência observados na maioria dos embriões dessa amostra. A documentação deve ser realizada dentro de 48 horas após a conclusão do ensaio para evitar o acúmulo de fluorescência de fundo não específica. A metilcelulose residual a 4% não interferirá nas reações de PCR subsequentes necessárias para a genotipagem de embriões.</li>
	<li>Nota: Para ajudar na imobilização de um embrião em um determinado ângulo, é útil empurrar suavemente o embrião para o fundo do prato, de modo que a gema ou alguma outra parte do embrião (dependendo da visualização desejada) fique apoiada no fundo do prato. Em seguida, use a sonda para mover o embrião ou a metilcelulose imediatamente circundante (enquanto visualiza simultaneamente ao microscópio) para obter o ângulo desejado para documentação.</li>
</ol>

<ol><li>Tait, S. W., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cell+death%3A+outer+membrane+permeabilization+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621-632 (2010).</li>
<li>Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+controlled+demolition+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: controlled demolition at the cellular level.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 231-241 (2008).</li>
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<li>Beers Jr, R. F., Hendley, D. D., Steiner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+activation+of+polynucleotide+phosphorylase+through+the+formation+of+complexes+between+acridine+orange+and+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition and activation of polynucleotide phosphorylase through the formation of complexes between acridine orange and polynucleotides.</a> Nature. 182, 242-244 (1958).</li>
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<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).</li>
<li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li>
<li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Dev. Biol. 227, 279-293 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O ensaio Casp3, conforme apresentado neste protocolo, deve ser simples e, se realizado conforme as instruções aqui, deve dar origem a uma relação sinal-ruído robusta. As etapas críticas deste protocolo incluem o uso de tampão PDT 1x fresco para todas as lavagens, duração suficiente das etapas de lavagem no tampão PDT após a incubação de embriões no anticorpo primário, manuseio cuidadoso de embriões e contabilidade meticulosa de todos os embriões dentro de tubos ou pipetas de transferência durante todas as etapas do protocolo.
Em nossa experiência, as seguintes são as razões mais comuns para a falta de sinal nos controles positivos: 1) 1x PBST é substituído por 1x PDT durante as etapas de lavagem, 2) 1x tampão PDT tem mais de um mês, 3) o anticorpo secundário errado foi usado, 4) embriões com mais de 32 hpf e/ou 5) mais de 40 embriões foram analisados em um tubo. Quando surgem resultados inconsistentes ou variabilidade nas amostras, isso geralmente ocorre porque 1) não foi tomado cuidado para garantir que todos os embriões permanecessem dentro do líquido o tempo todo durante o procedimento e/ou 2) os embriões não foram incubados sob balanço suficiente. Altos níveis de ruído de fundo são freqüentemente visualizados como uma névoa fluorescente geral surgindo em todo o tecido animal do embrião (ver Figura 4, "fluorescência de fundo"). Uma relação sinal-ruído ruim pode surgir quando 1) os embriões não foram lavados por tempo suficiente após o anticorpo primário e / ou 2) os embriões foram deixados em PFA ou metanol por mais tempo do que o recomendado. Se os embriões não permanecerem intactos até o final do ensaio: 1) as soluções não foram adicionadas gota a gota após a fixação com PFA e / ou 2) a velocidade do balancim durante as etapas de incubação foi definida muito alta.
A visualização de montagem total inerente ao ensaio Casp3 é útil para a localização espacial de células apoptóticas. No entanto, a especificidade do tecido é aproximada e provavelmente dependerá de técnicas de co-rotulagem (ver Figura 5) e / ou seccionamento de embriões para identificar a identidade exata das células submetidas à apoptose. No protocolo descrito aqui, a co-rotulagem é limitada pela exigência do anticorpo específico derivado de coelho usado em nosso ensaio. Não identificamos um anticorpo anti-Caspase 3 não derivado de coelho comercialmente disponível que rotule especificamente células apoptóticas por imunofluorescência de montagem total em embriões de peixe-zebra. Assim, anticorpos específicos de tipo de célula criados em coelhos não serão compatíveis com o ensaio Casp3 para experimentos de comarcação. Uma alternativa é realizar um ensaio TUNEL, que requer um anticorpo derivado de camundongo para marcar células apoptóticas6. No entanto, descobrimos que o ensaio TUNEL de montagem inteira realizado em embriões de peixe-zebra é muito sensível a uma série de variáveis na reação, incluindo a concentração da enzima TdT, a duração da incubação do embrião na enzima TdT e o número de embriões presentes por tubo (nossas observações não publicadas). Assim, é um desafio encontrar um equilíbrio de enzimas que dê uma interpretação consistente dos resultados. Portanto, uma alternativa preferível é analisar células apoptóticas em embriões de peixe-zebra transgênicos que expressam um fluoróforo (com anticorpos robustos disponíveis comercialmente) como GFP em um tipo específico de célula. Em seguida, os experimentos de co-rotulagem podem ser realizados usando um anticorpo primário anti-Gfp de camundongo seguido por um anticorpo secundário anti-camundongo com fluorescência verde. Veja a Figura 5 para um exemplo.
Embora o protocolo Casp3 forneça coloração robusta e confiável de células apoptóticas em embriões do estágio de 4 células até 32 hpf, ele tem aplicação limitada além de 32 hpf devido à incapacidade dos anticorpos de penetrar na pele de embriões mais velhos. Técnicas adicionais para permeabilizar os embriões, incluindo tratamento com colagenase, tripsina, acetona ou etanol, podem ser otimizadas para adaptar este ensaio à análise de embriões mais velhos. A coloração com AO, no entanto, pode ser realizada em peixes-zebra vivos até pelo menos 5 dias de idade9. Assim, o ensaio AO contorna a restrição do estágio embrionário e representa um ensaio rápido para analisar células apoptóticas (1-2 horas). Por outro lado, o ensaio Casp3 requer fixação noturna de embriões e leva de 2 a 4 dias para ser concluído. As desvantagens do ensaio AO incluem que a documentação fotográfica eficiente de embriões pode ser um desafio com várias amostras, uma vez que os embriões estão vivos e as células apoptóticas são rapidamente formadas e eliminadas. Isso pode ser especialmente problemático se os embriões precisarem ser montados para obter uma orientação específica para documentação. Além disso, descobrimos que a coloração AO diminui após a fixação com PFA, portanto, não é compatível com experimentos de comarcação envolvendo imunofluorescência.
A análise quantitativa da Caspase 3 ativada pode ser realizada utilizando programas de software que medem a intensidade de fluorescência de imagens documentadas. Quantificamos a apoptose induzida por IR no tecido neural, um método que descrevemos em detalhes em outro lugar10. Dependendo do experimento, a análise quantitativa da Caspase 3 ativada pode exigir manipulação adicional de embriões, como montagem plana, para obter orientação adequada para uma análise de tecido ideal. Além disso, a linearidade da análise dependerá da espessura do tecido que está sendo analisado. Por exemplo, analisamos a apoptose induzida por IR no tecido neural medindo a imunofluorescência da caspase 3 ativa no tecido neural raso da medula espinhal, em vez do tecido denso de neurônios do cérebro4,10.
Em nossa experiência, o ensaio Casp3 é o ensaio mais robusto e confiável disponível para analisar a apoptose em embriões de peixe-zebra entre o estágio de 4 células e 32 hpf quando a análise requer tempo suficiente para documentação. Quando anticorpos apropriados ou linhas transgênicas estão disponíveis para identificar células específicas, este ensaio também é altamente passível de co-rotulagem para identificar os tipos específicos de células submetidas à apoptose.

Aqui descrevemos como realizar a imunofluorescência total em embriões iniciais de peixe-zebra para detectar células com Caspase 3 ativada (doravante denominada ensaio Casp3). O objetivo geral deste método é identificar a abundância relativa e a localização das células apoptóticas no peixe-zebra desde o estágio de 4 células até 32 horas após a fertilização (hpf).
Ambas as vias apoptóticas intrínsecas (mediadas por mitocôndrias) e extrínsecas (mediadas por receptores de morte) medeiam a morte celular por meio da ativação da cascata de caspases1-2. As caspases iniciadoras normalmente existem como monômeros dentro da célula e, uma vez recrutadas para plataformas específicas da via em resposta a um sinal pró-apoptótico, tornam-se dímeros ativados. As caspases iniciadoras ativadas (Caspase 9; via intrínseca e Caspase 8; via extrínseca) então direcionam as caspases efetoras inativas e pré-dimerizadas (Caspase 3, 6, 7) para clivagem para formar heterotetrâmeros ativos. As caspases efetoras ativas então clivam os alvos celulares com resíduos específicos de tetrapeptídeos para iniciar a destruição proteolítica específica que culmina nas características ultraestruturais da apoptose, como condensação da cromatina e bolhas de membrana, e sinais de superfície celular que medeiam o empacotamento da célula para engolfamento por fagócitos de maneira imunológica silenciosa. Em células de mamíferos, acredita-se que as caspases efetoras ativas realizem a maioria dos eventos de clivagem celular que medeiam a apoptose por meio das vias intrínseca e extrínseca1-2. O protocolo aqui descrito usa um anticorpo que se liga especificamente à forma heterotetramérica clivada da Caspase 3, mas não ao dímero inativo da Caspase 3.
Uma das vantagens do ensaio Casp3 é a capacidade de visualizar a distribuição espacial das células apoptóticas no contexto de todo o embrião. Portanto, os tecidos de interesse podem ser examinados quanto à presença de células apoptóticas e, se existirem anticorpos ou cepas transgênicas fluorescentes que rotulam tipos específicos de células, é possível identificar a identidade exata das células submetidas à apoptose por meio de experimentos de co-rotulagem. Vários grupos usaram com sucesso a Caspase 3 ativada como marcador de apoptose em embriões de peixe-zebra (por exemplo, 3-7). Técnicas adicionais de montagem total para identificar células apoptóticas em embriões de peixe-zebra incluem o ensaio TUNEL8 e a coloração de laranja de acridina (AO)9. Usamos todos os três métodos para identificar células apoptóticas em embriões de peixe-zebra4,6,10.
TUNEL (Terminal desoxinucleotidil transferase dUTP nick end labeling) a coloração aproveita a enzima Terminal desoxinucleotidil transferase (TdT) que é usada para adicionar nucleotídeos às extremidades 3' hidroxila do DNA durante a recombinação de VDJ em linfócitos11. TdT adiciona dUTP-biotina para liberar grupos hidroxila 3 'no DNA, que são abundantes principalmente em células apoptóticas. Os tecidos são então expostos à avidina-peroxidase e as células apoptóticas são coradas após a adição do substrato 3-amino-9-etilcarbazol. O ensaio TUNEL foi usado para realizar uma extensa análise de células apoptóticas durante o desenvolvimento embrionário em tecidos de peixe-zebra do tipo selvagem12. Semelhante ao ensaio Casp3, o ensaio TUNEL é realizado apenas em embriões fixos. Descobrimos que o ensaio Casp3 é mais consistente e menos dispendioso do que o ensaio TUNEL.
A coloração AO foi descrita pela primeira vez como um mecanismo para identificar especificamente células apoptóticas em Drosophila13. A AO cora o citoplasma e o núcleo das células apoptóticas, mas não necróticas. Sabe-se que o AO se liga aos ácidos nucléicos14, e acredita-se que isso seja responsável pela coloração nuclear. No entanto, o AO não cora a cromatina das células vivas; em vez disso, parece que mudanças específicas que ocorrem durante a apoptose permitem a intercalação e coloração de núcleos apoptóticos condensados15. A coloração AO tem a vantagem de uma rápida análise apoptótica de embriões vivos. No entanto, a documentação das amostras deve ser realizada rapidamente devido à natureza dinâmica da formação e depuração das células apoptóticas. Por outro lado, a fixação simultânea de todas as amostras fornece um instantâneo da apoptose em um determinado momento em todas as amostras e não está sujeita a essa variável temporal. Assim, uma vez que a análise de células apoptóticas por coloração AO não é compatível com embriões fixos, o ensaio Casp3 é preferível para experimentos nos quais a documentação fotográfica e/ou quantificação é necessária em várias amostras.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 ml&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>c2170</td><td>Não perigoso. Quaisquer tubos de plástico semelhantes de 1,5 m serão suficientes.</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Não Perigoso.</td></tr><tr><td>anticorpo a-ativado-humano-caspase-3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559565</td><td>Pode ser prejudicial se inalado ou ingerido.</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal a-GFP (camundongo)</td><td>Life Technologies</td><td>33-2600</td><td>Pode ser prejudicial se inalado ou ingerido.</td></tr><tr><td>Proteína neuronal humana a-HuC/HuD, IgG2b de camundongo, monoclonal 16A11 - UNCONJ</td><td>Life Technologies</td><td>A21271</td><td>Pode ser prejudicial se inalado ou ingerido.</td></tr><tr><td>Albumina, Isolamento de Choque Térmico Bovino BSA&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>CAS 9048-46-8</td><td>Não perigoso. Também pode ser comprado através da Bioexpress: 0332-1006</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>Use na diluição de 1:200.&nbsp; Pode ser prejudicial se inalado ou ingerido.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Use na diluição de 1:200.&nbsp; Pode ser prejudicial se inalado ou ingerido.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>Use na diluição de 1:200.&nbsp; Pode ser prejudicial se inalado ou ingerido.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>Inflamável.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinça de Inox (pontas padrão/retas)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-20</td><td>Afiadas!</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino FBS HyClone&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SH3091003</td><td>não perigoso.</td></tr><tr><td>Rotador Ocelot Fisher Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-21</td><td>Qualquer rotador com controle manual de velocidade é adequado.</td></tr><tr><td>Sal Instantâneo para Aquário Oceânico</td><td>Petco</td><td>1373684</td><td>Não Perigoso.</td></tr><tr><td>Metanol (sem acetona)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Inflamável: tóxico por inalação, ingestão e contato.</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0387-1006</td><td>Não Perigoso.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Inflamável: tóxico por inalação, ingestão e contato.</td></tr><tr><td>Sonda (Angular 80 Short/15.5cm/0.15mm de diâmetro da ponta)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10140-02</td><td>Afiada!</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>não perigoso.</td></tr><tr><td>Placa de Spot Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td>Não Perigosa.</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência, Samco de uso geral</td><td>Thermo-Scientific</td><td>204</td><td>Não perigoso.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Irritante: prejudicial por ingestão ou contato.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td>Não perigoso. Outras marcas incluem VWR #97063-872.</td></tr></tbody></table>

análise de apoptose em embriões zebrafish por whole-mount imunofluorescência para detectar caspase 3 ativado

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount imunofluorescência para detectar ativado Caspase 3 (ensaio CASP3) é útil para identificar células em apoptose ou intrínseca ou extrínseca em embriões de peixe-zebra. A análise de todo o monte fornece informação espacial em relação à especificidade do tecido de células apoptosing, embora o corte e / ou colabeling é finalmente obrigado a identificar os tipos de células em apoptose exatas. O ensaio todo-mount CASP3 é otimizado para análise de embriões fixadas entre o estágio de 4 células e 32 horas pós-fecundação e é útil para uma série de aplicações, incluindo a análise de mutantes peixe-zebra e morphants, superexpressão de tipo selvagem e mutante mRNAs, e exposição a substâncias químicas. Comparado com coloração laranja de acridina, que pode identificar células em apoptose em embriões vivos em uma questão de horas, CASP3 e TUNEL ensaios levar muito mais tempo para ser concluído (2-4 dias). No entanto, devido ao carácter dinâmico da formação de células apoptóticas e de apuramento, análise de correcçãoembriões ed assegura comparação precisa de células apoptóticas através de múltiplas amostras em pontos de tempo específicos. Descobrimos também o ensaio CASP3 ser superior à análise de células em apoptose pelo ensaio todo-mount TUNEL em relação ao custo e confiabilidade. Em geral, o ensaio CASP3 representa, um ensaio altamente reprodutível robusto, em que a análise de células em apoptose em embriões de peixe-zebra iniciais.

O ensaio Casp3 fornece evidência clara de células apoptóticas desde o estágio de 4 células até 32 hpf. Figura 2A mostra que a injeção de embriões com altas concentrações de mRNA que codifica proteínas pró-apoptóticas potentes do tipo apenas-BH3, como Bim ou Noxa, rapidamente leva à ativação da Caspase 3 já no estágio de 4 células do desenvolvimento. A morte embrionária ocorre subsequentemente dentro de 1 hora4. Observe que a intensidade da fluorescência é moderada, mas os resultados são conclusivos. Em estágios mais avançados, a intensidade da fluorescência é mais acentuada. Por exemplo, Figura 2B mostra células ativas positivas para Caspase 3 em embriões na fase de esfera que foram injetados com níveis moderadamente tóxicos4 de mRNA que codifica a pró-apoptótica apenas bh3 gene puma. RNA mensageiro que codifica o antiapoptótico bcl-2 gene foi coinjetado para provar que a injeção de puma O mRNA induz apoptose através da via intrínseca, mediada por mitocôndrias.
A apoptose induzida por IR em peixe-zebra requer a transcrição mediada por p53 de genes do tipo apenas bh3, como puma5-6. O atraso na apoptose induzida por IR em Figura 3 é consistente com a necessidade de transcrição mediada por p53.
O protocolo Casp3 deve gerar uma relação sinal-ruído robusta. Figura 4 compara o resultado ideal do ensaio Casp3 com dois resultados comuns, porém subótimos, que surgem quando etapas críticas são comprometidas (ver Discussão): uma relação sinal-ruído fraca devido à fluorescência de fundo no tecido animal e à fluorescência do vitelo, que desvia a atenção do sinal de interesse.
Experimentos de codetecção utilizando linhagens transgênicas que expressam GFP aproximam tecidos que estão passando por apoptose (Figura 5).
<img alt="Fluxograma da imunomarcação de embriões: permeabilização com metanol, tratamento com anticorpo, processo de imagem." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Esquema simplificado do protocolo Casp3.
<img alt="Zebrafish embryonic development, 4-cell and sphere stages, bright-field microscopy with gene expression analysis." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. (A) Análise da apoptose em embriões na fase de 4 células. Os embriões foram injetados na fase de uma célula de desenvolvimento com 50 pg de mRNA codificando egfp (controle) ou pró-apoptótico apenas bh3 genes bim e noxa. Na fase de 4 células (aproximadamente uma hora após a injeção, hpi), os embriões foram analisados por imunofluorescência para detectar a Caspase 3 ativada. Bim e agente nocivo O mRNA induz apoptose rápida em embriões de peixe-zebra imediatamente após a injeção, o que, caso os embriões sejam deixados em desenvolvimento, leva à morte até 2 hpi4. Uma imagem em campo claro de um embrião selvagem em estágio de 4 células é mostrada para comparação. (BAnálise da apoptose em embriões de peixe-zebra na fase de blástula. Embriões foram injetados no estágio de uma célula com mRNA codificando 50 pg egfp (controle), 5 pg puma mais 45 pg egfp (puma), ou 5 pg puma mais 45 pg de bcl-2 (bcl-2). Na fase de blástula (aproximadamente 4 hpi), os embriões foram analisados pelo ensaio Casp3. São apresentadas vistas laterais e do polo animal para visualizar as células apoptóticas. Resgate da apoptose induzida por puma por bcl-2 indica que a injeção de puma O mRNA induz apoptose especificamente através da via intrínseca, mediada por mitocôndrias. Uma imagem em contraste de fase de um embrião selvagem no estágio de esfera é mostrada para comparação.
<img alt="Desenvolvimento embrionário sequencial, imagem de fluorescência; estágios de crescimento do embrião 0-3 hpfIR, 17-20 hpf." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Curso temporal da apoptose induzida por radiação ionizante (RI) entre 17-20 hpf. Embriões de peixe-zebra foram irradiados com 8 Gy de RI aos 17 hpf e analisados aos 0, 1,5, 2 e 3 horas após a RI (hpRI) por meio do ensaio Casp3. As setas aos 20 hpf mostram o acúmulo de células apoptóticas na medula espinhal aos 3 hpRI. Uma imagem em contraste de fase de um embrião aos 17 hpf é apresentada para comparação.
<img alt="Análise da fluorescência de embriões; imagens comparativas de microscopia de amostras controle e tratadas." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Resultados ótimos e subótimos da imunofluorescência para Casp3 em embriões de 27 hpf. Embriões de peixe-zebra foram irradiados (ou não) aos 24 hpf com 15 Gy e analisados pelo ensaio Casp3. O grupo "ótimo" mostra resultados ideais, nos quais as células apoptóticas fluorescem intensamente, enquanto as células não apoptóticas e a gema apresentam fluorescência de fundo mínima. As setas no grupo “fluorescência de fundo no controle” indicam fluorescência de fundo excessiva no tecido animal de embriões controle. Os asteriscos no grupo “fluorescência da gema” demonstram fluorescência inespecífica excessiva na gema.
<img alt="Análise por microscopia de fluorescência; expressão de α-Gfp, α-Casp3; detecção de apoptose celular; diagrama sobreposto." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51060/51060fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51060/51060fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Experimentos de codetecção aproximam a especificidade tecidual da apoptose induzida por IR. A linhagem transgênica Tg(olig2:egfp)vu12 marca neurônios motores e oligodendrócitos17, e a linhagem Tg(elavl3:egfp) marca todos os neurônios em diferenciação18. Cada linhagem transgênica foi irradiada com 15 Gy às 24 hpf e analisada 3 horas depois, utilizando anticorpos primários anti-GFP de camundongo e anti-Caspase 3 ativa de coelho, seguidos por anticorpos secundários com fluorescência verde e vermelha, respectivamente. É mostrado um aumento da medula espinhal (localizada dorsalmente ao final da extensão do vitelo em embriões de 27 hpf, 3 h após a IR). As células apoptóticas parecem estar parcialmente localizadas nas populações Tg(elavl3:egfp) e Tg(olig2:egfp)vu12 (ver setas no sobreposição), sugerindo que neurônios e oligodendrócitos são sensíveis à apoptose induzida por IR.

Certas perturbações genéticas ou exposição a toxinas podem interromper os processos normais de desenvolvimento, levando à morte de tipos específicos de células. A análise da Caspase 3 ativada por imunofluorescência total em embriões de peixe-zebra revela a localização específica do estágio e do tecido de células especificamente submetidas à apoptose.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar embriões inteiros de peixe-zebra entre o estágio de quatro células e 32 horas após a fertilização, para detectar a presença e localização de células apoptóticas. Isso é realizado primeiramente revestindo os embriões em um ponto temporal desejado. Em seguida, os embriões são fixados e tornados permeáveis.Em seguida, os embriões são incubados com anticorpo de coelho anti-caspase três ativada, seguido por um anticorpo secundário anti-coelho marcado com fluoróforo para rotular fluorescentemente as células apoptóticas. Por fim, os embriões são analisados por microscopia de fluorescência. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram diferenças no número e na localização de células apoptóticas entre embriões controle e embriões tratados ou mutantes por meio de imunofluorescência.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise de células apoptóticas por coloração com laranja de Aine ou ensaio TUNEL, é que o ensaio de caspase-3 é um método altamente reprodutível e relativamente econômico para experimentos nos quais é necessária a documentação fotográfica e/ou a quantificação de células apoptóticas em múltiplas amostras. O procedimento será demonstrado por Shelly SOLs, aluna de pós-graduação do meu laboratório, e Christian Tono, técnico do meu laboratório, sob uma cabine de segurança química. Prepare 50 mililitros de paraformaldeído a 4% ou PFA adicionando o pó de PFA, o XPBS protegido da luz, e agite a 60 graus Celsius por uma hora para dissolver. Armazene a quatro graus Celsius por um mês ou a menos 20 graus Celsius por dois anos.Prepare 100 mililitros de Metilcelulose 4% aquecendo 30 mililitros de água a 80 graus Celsius. Em seguida, adicione quatro gramas de Metilcelulose e agite para dissolver à temperatura ambiente. De quatro horas a durante a noite.Complete o volume até 100 mililitros e misture a quatro graus Celsius por uma hora. Armazene à temperatura ambiente, colete os embriões imediatamente após a fertilização e deixe-os desenvolver até o ponto temporal desejado entre a fase de quatro células e 32 horas pós-fertilização ou HPF, sendo quatro embriões entre a fase de início da cauda e 32 HPF. Remova o córion incubando os embriões em 100 microlitros de 10 miligramas por mililitro.Pronase em 10 mililitros de água para ovo 1x durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Remova lentamente a solução de pronase.Adicione uma vez a quantidade de água de ovo e repita a lavagem mais duas vezes. Em seguida, transfira até 40 embriões para um tubo de 1,5 mililitro e use um mililitro de PBS-T 1X para lavar duas vezes, após remover todo o PBT, exceto cerca de 100 microlitros. Adicione um mililitro de PFA 4%.Coloque os tubos em posição horizontal dentro de um recipiente de tamanho apropriado para facilitar o transporte e posicione-os em um agitador suave a quatro graus Celsius durante a noite ou por até uma semana após a fixação dos embriões. Remova a maior parte da solução de PFA e cuidadosamente, gota a gota, adicione um mililitro de metanol a 100% gelado. Coloque os tubos em posição horizontal e mantenha-os a menos 20 graus Celsius por duas horas.Alternativamente, os embriões podem ser mantidos a menos 20 graus Celsius por até 24 horas. Após a incubação, deixe os embriões sedimentarem no fundo do tubo antes de remover a maior parte do metanol e adicionar cuidadosamente um mililitro de 1 XPBS com 0,3% de Tritex e 1% de DMSO. Remova imediatamente o PDT e substitua por PDT fresco.Em seguida, coloque os tubos de lado e agite por 30 minutos à temperatura ambiente. Após remover cuidadosamente a maior parte do PDT, adicione 500 microlitros de tampão bloqueador e certifique-se de que o embrião permaneça submerso na solução. Agite suavemente por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, adicione um microlitro de anticorpo de coelho anti-caspase 3 ativada e anticorpos não rabídicos adicionais.Se desejar, agite suavemente os embriões por duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após remover a solução de anticorpo, adicione um mililitro de PDT para enxaguar rapidamente os embriões. Em seguida, substitua por PDT fresco e agite suavemente por 30 minutos à temperatura ambiente.Antes de repetir a lavagem, remova a solução de lavagem PDT e repita a etapa de bloqueio. Em seguida, adicione os anticorpos secundários conjugados com fluoróforo adequados. Proteja da luz e agite suavemente por uma hora à temperatura ambiente sob um microscópio fluorescente com o filtro apropriado.Analisar os embriões em um XPDT. Se os controles positivos apresentarem fluorescência intensa com fundo mínimo, transferi-los para uma placa de Petri de 3,5 centímetros com uma camada fina de Metilcelulose 4% ou para uma lâmina com cavidade contendo uma grande gota de metilcelulose, utilizando uma sonda em ângulo. Posicionar um embrião de interesse para aquisição de imagens, obtendo imagens que representem a intensidade e os padrões de fluorescência observados na maioria dos embriões dessa amostra.Esta figura demonstra que a injeção de embriões com altas concentrações de mRNA que codifica proteínas potentes do tipo BH3, como BIM ou NOA, rapidamente leva à ativação da caspase 3. Até a fase de quatro células do desenvolvimento, ocorre posteriormente a morte embrionária dentro de uma hora.Em estágios posteriores do desenvolvimento, a intensidade da fluorescência é mais robusta. Por exemplo, aqui são mostradas células ativas com caspase três positivas em embriões na fase de esfera que foram injetados com níveis moderadamente tóxicos de mRNA codificando a proteína pró-apoptótica BH3 apenas. O gene Puma, mensageiro de RNA, codificando o gene antiapoptótico BCL2, foi injetado simultaneamente para demonstrar que a injeção de mRNA de Puma induz apoptose por meio da via intrínseca mediada por mitocôndria.A radiação ionizante induziu apoptose e o peixe-zebra requer a transcrição mediada por P53 de genes apenas BH3, como puma. O atraso na apoptose induzida por radiação ionizante mostrado aqui é consistente com a necessidade de transcrição mediada por P53. O protocolo da caspase 3 deve gerar uma relação sinal-ruído robusta.Esta figura compara o resultado ideal do ensaio de caspase três com dois resultados comuns subótimos que surgem quando etapas críticas são comprometidas, conforme descrito na seção de discussão do protocolo textual. O primeiro é uma baixa relação sinal-ruído devido à fluorescência de fundo no tecido animal, e o segundo é a fluorescência do vitelo que interfere no sinal de interesse. Por fim, como mostrado aqui, experimentos de marcação dupla utilizando linhagens transgênicas que expressam GFP aproximam os tecidos que estão passando por apoptose; a linhagem transgênica OLE dois EGFP VU, 12 marca neurônios motores e oligodendrócitos, e a linhagem transgênica elev L três EEG FP marca todos os neurônios em diferenciação.Os resultados sugerem que tanto os neurônios quanto os oligodendrócitos são sensíveis à apoptose induzida por IR após este procedimento. Outros métodos, como coloração imunohistoquímica com anticorpos primários específicos para tecidos e aspiração de embriões, podem ser realizados para identificar com precisão o tipo de células que estão passando por apoptose.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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