Name: Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um In Vitro Adesão Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a avaliar a inibição da adesão de Streptococcus pneumoniae por probióticos usando ensaios in vitro com células epiteliais CCL 23. Este método demonstra o potencial de Streptococcus salivarius na redução da colonização pneumocócica.

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria Childrens Research Institute e Murdoch.

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<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
<li>Tonnaer, E. L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+glycosaminoglycans+in+the+attachment+of+pneumococci+to+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells.</a> Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A parte crítica deste ensaio é a adição de concentrações adequadas de S. salivarius e pneumococos nas seções 3.1.7 e 3.1.12. As concentrações são estimados usando leituras OD mas os inóculos exacta não é determinado até que as placas são contadas no dia seguinte. Por esta razão, recomenda-se realizar as curvas de crescimento para medir a OD e as contagens viáveis ​​(CFU / ml) ao longo do tempo para todas as estirpes bacterianas usadas no teste para identificar a fase mid-log e auxiliar no cálculo da concentraçã...

Streptococcus pneumoniae (pneumococos) é uma bactéria Gram positiva que pode causar infecções, incluindo pneumonia, otite média, e meningite. É uma das principais causas de doenças em crianças em países de baixa renda e responsável por cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos de idade anualmente 1. Os pneumococos são freqüentemente realizadas na nasofaringe de crianças pequenas. Embora esta colonização é considerado geralmente assintomática, que precede a infecção por pneumococos e serve como um reservatório para as bactérias em duas populações humanas. Vacinação conjugada pneumocócica reduz eficazmente o transporte dos serotipos contidos na vacina. No entanto, existem mais de 90 serotipos de pneumococos, e a vacinação pode levar à substituição do serotipo, em que a eliminação dos serotipos da vacina é seguido por um aumento no transporte e doença causada por serotipos nonvaccine 3. Além disso, em algumas populações de alto risco, pneumocócicacolonização frequentemente ocorre muito cedo na vida, antes da administração da primeira dose de vacina de 4,5. Recentemente, o uso de probióticos tem sido proposta como uma estratégia adicional para inibir pneumocócica 6,7 colonização. Ensaios in vitro de adesão foram usadas para examinar a aderência pneumocócica 8,9. Estes ensaios foram adaptados para investigar o impacto do probiótico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) na aderência pneumocócica 10. Além LGG e outras bactérias de ácido láctico, Streptococcus salivarius, residente comuns da cavidade oral, tem sido investigada como um probiótico potencial para o tracto respiratório devido ao seu potencial de colonização e a capacidade para inibir a pneumococos e outros patogénicos respiratórios in vitro 11 - 13. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de aderência utilizado para investigar os efeitos de S. salivarius K12 na adesão pneumocócicapara a linha de células epiteliais humanas CCL-23. Antes de ser utilizado no ensaio, pneumococos isolados foram avaliadas por capacidades de adesão, como o crescimento e as propriedades de aderência pode variar entre substancialmente isolados 10,14. As curvas de crescimento de pneumococos e S. salivarius foram realizados para determinar a fase mid-log e estimar a concentração de (unidades formadoras de colónias ou de UFC / mL) por densidade óptica (OD, Figura 1). Recomenda-se para analisar o crescimento de contagem viável e OD para cada isolado antes da sua utilização no ensaio. Este ensaio pode ser realizado em qualquer laboratório com equipamento de cultura de tecido padrão e equipamento. Neste protocolo, os efeitos de três doses de S. salivarius administrado 1 hora antes da adição de pneumococos na aderência de S. pneumoniae PMP843, um sorotipo 19F transporte isolado derivado de um swab de nasofaringe, são examinados. Duas formas diferentes para quantificar pneumococos aderente são apresentados: plaqueamento em agar sangue para determina contagens viáveis, e a extracção do ADN e a detecção do gene lytA pneumocócica por qPCR 15. O protocolo básico de ensaio de aderência pode ser facilmente modificado para testar diferentes doses ou o tempo de administração de probióticos e também pode ser utilizado com outras estirpes bacterianas ou de espécies.

<table><tbody><tr><td>Mídia Essencial Mínima (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco T-75</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Células CCL-23</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de ágar sangue de cavalo (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Placas de ágar de sangue de ovelha também aceitáveis</td></tr><tr><td>Caldo Oxoid Todd-Hewitt</td><td></td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Cubetas descartáveis</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>vem em ampolas estéreis a 5.000 UI/5m/&nbsp;</td></tr><tr><td>Espalhador estéril</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternativamente, um espalhador de vidro pode ser mergulhado em etanol a 96% e esterilizado por chama antes de cada uso</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-kit QIAamp DNA (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Primer LytA F</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sequência personalizada de</td><td>5' -> 3' ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>Primer LytA R</td><td>Sigma-Aldrich Sequência</td><td>personalizada de</td><td>5' -> 3'&nbsp; Sonda TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA</td><td>Eurogentec</td><td>Sequência personalizada de</td><td>5' -> 3' Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, fluoróforos alternativos podem ser usados</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de detecção Thermo-Fast 96</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tiras de tampa qPCR ultraclear</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema QPCR Mx3005</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*Fontes alternativas estão disponíveis para a maioria/todos os produtos listados</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica colonização usando um<em&gt; in vitro</em&gt; adesão assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

A adesão de Streptococcus pneumoniae (pneumococos), para o revestimento epitelial da nasofaringe pode resultar em colonização e é considerada um pré-requisito para as infecções pneumocócicas, tais como pneumonia e otite média. Ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de pneumococos para células epiteliais monocamadas e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos, para inibir a colonização de pneumococo. O protocolo aqui descrito é utilizado para investigar os efeitos do Streptococcus salivarius probiótico na aderência de pneumococos para a linha de células epiteliais humanas CCL-23 (por vezes referidas como células HEp-2). O ensaio envolve três passos principais: 1) a preparação de células epiteliais e bactérias, 2) a adição de bactérias de monocamadas de células epiteliais, e 3) detecção de pneumococos aderente por contagem de viáveis ​​(diluição em série e plaqueamento) ou quantitativa PCR em tempo real (qPCR ). Esta technique é relativamente simples e não requer equipamento especializado, que não seja uma instalação de cultura de tecidos. O ensaio pode ser usado para testar outras espécies de probióticos e / ou inibidores potenciais de colonização pneumocócica e pode ser facilmente modificado para tratar outras perguntas científicos sobre a adesão pneumocócica e invasão.

Os resultados de uma experiência representativa em que os pneumococos (S. pneumoniae PMP843, um isolado de colonizar 19F) foram adicionados a células CCL-23 de 1 hora após a adição de S. salivarius, e aderência pneumocócica foi quantificada por contagem de viáveis ​​e ambos lytA qPCR são mostrados na Tabela 2. resultados foram consistentes entre os dois métodos de ambos, o número absoluto de bactérias (apresentada como CFU / ml) e a aderência%, normalizada para o número pneumo...

Os ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de Streptococcus pneumoniae a monocamadas de células epiteliais e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos para inibir a colonização de pneumococo.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar a capacidade de uma célula probiótica de Streptococcus levarius de inibir a aderência pneumocócica a uma linhagem de células epiteliais. Isso é realizado primeiramente preparando monocamadas de células epiteliais CCL-23. Em uma placa de 24 poços, em seguida, leveduras e pneumococos são adicionados à monocamada em sequência e as células são incubadas.No passo final, as cavidades são lavadas para remover as bactérias não aderentes. As células epiteliais CCL 23 são lisadas e o conteúdo das cavidades é coletado. Por fim, o impacto do salivarius na aderência pneumocócica pode ser avaliado mediante a quantificação do número de pneumococos associados às células.Este método ajuda a responder perguntas fundamentais na área de doenças infecciosas, como se probióticos podem inibir a aderência de patógenos bacterianos, tais como o pneumococo. Tivemos a ideia inicial deste método ao começarmos a investigar o uso potencial de Lactobacillus hypnosis, GG e outros probióticos no trato respiratório. Demonstrarão este procedimento Jane Manning e Zen para estudantes de doutorado do nosso laboratório. No dia anterior ao experimento, divida uma cultura conf

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo é um ensaio de adesão bacteriana simples que consiste na contagem do número de unidades formadoras de colônia de bactérias que são aderidos em células em cultura. O ensaio é robusto, independente da adesina estudado, e inúmeras variações são usadas na maioria dos laboratórios que trabalham com patogênese bacteriana.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

Fonte: Jagau, H. et al. Infecção por pneumococo de células endoteliais humanas primárias em fluxo constante. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a visualização em tempo real da ligação pneumocócica às cadeias do fator de von Willebrand (FVW) em células endoteliais sob condições de fluxo de meio constante. Ele descreve as etapas para estimular a liberação de FVW, rotular as cordas e quantificar a ligação bacteriana.

Avaliação da ligação pneumocócica a células endoteliais humanas primárias sob fluxo constante de meios

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra um modelo intestino-microrganismo in vitro para estudar a viabilidade bacteriana. Uma cocultura de células Caco-2 e HT29-MTX é incubada com bactérias pré-tratadas sob condições digestivas simuladas. A integridade da barreira epitelial é avaliada usando resistência elétrica transepitelial, e frações do meio, muco...

Modelo intestinal in vitro para avaliar adesão bacteriana e internalização

O vídeo demonstra um ensaio de aderência em fase sólida para avaliar a formação de biofilme. Em uma placa de vários poços, as bactérias em meios suplementados com sais biliares aderem a superfícies sólidas, formando biofilmes, o que é confirmado por colorimetria por meio de coloração com cristal violeta e tratamento com etanol.

Um ensaio de aderência de fase sólida para avaliar a formação de biofilme

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

A competição em Streptococcus pneumoniae é mediada por bacteriocinas, pequenos peptídeos antimicrobianos com atividade inibitória em relação ao pneumococo e outras espécies relacionadas. Aqui descrevemos um ensaio de sobreposição bacteriana otimizado que permite a caracterização da atividade da bacteriocina e do espectro inibitório, imunidade específica da bacteriocina e detecção de peptídeos secretados de quorum sensing.

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Este estudo detalha o processo de quantidades precisas de gavaging de probióticos para camundongos neonatais. A montagem experimental foi otimizada para incluir, mas não está limitada ao probiótico dosagem, métodos de administração e quantificação de bactérias no intestino.

Estudos de probiótico em camundongos neonatais usando Gavage

A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Este protocolo descreve as etapas necessárias para a colonização de camundongos com pks+ Escherichia coli em condições não inflamatórias, bem como métodos não invasivos para validação da colonização e avaliação da expansão de pks+ E. coli nas fezes.

Colonização com Escherichia coli de Murine pks+ Escherichia coli sob condições não inflamatórias

Aprenda a avaliar a inibição da adesão de Streptococcus pneumoniae por probióticos usando ensaios in vitro com células epiteliais CCL 23. Este método demonstra o potencial de Streptococcus salivarius na redução da colonização pneumocócica.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um

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