Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um In Vitro Adesão Assay

O objetivo geral deste procedimento é examinar a capacidade de um levarius de células estreptocócicas probióticas de inibir a adesão pneumocócica a uma linhagem de células epiteliais. Isso é feito preparando primeiro as monocamadas de células epiteliais CCL 23. Em uma placa de 24 poços, em seguida, eslovar e pneumococos são adicionados à monocamada em sequência e as células são incubadas.

Na etapa final, os poços são lavados para remover as bactérias não aderentes. As células epiteliais CCL 23 são lisadas e o conteúdo do poço é colhido. Em última análise, o impacto do salivarius na adesão pneumocócica pode ser avaliado quantificando o número de pneumococos associados a células.

Esse método ajuda a responder a questões-chave no campo de doenças infecciosas, como se os probióticos podem inibir a adesão de patógenos bacterianos, como o pneumococo. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando começamos a investigar o uso potencial de lactobacilos hipnose, GG e outros probióticos no trato respiratório. Demonstrando este procedimento estará Jane Manning e Zen para estudantes de doutorado de nosso laboratório No dia anterior ao experimento, divida para cultura de confluência, CCL 23 células epiteliais e, em seguida, dilua-as em meio pré-aquecido para uma concentração de 150.000 células por mililitro em um tubo estéril de 50 mililitros.

Em seguida, semente, um mililitro das células por poço em uma placa de cultura de tecidos tratada de 24 poços e incubar as células durante a noite. Em seguida, usando um inocular de loop de 10 microlitros, 10 a 12 colônias bem separadas de cada cultura bacteriana em uma alíquota de 10 mililitros de caldo Todd Hewitt mais 0,5% de extrato de levedura. Um breve vórtice e incubar as culturas por 14 a 16 horas no dia do experimento.

Vortex cada uma das culturas bacterianas por três a cinco segundos e, em seguida, adicione 100 microlitros de pneumococos e 100 microlitros de salivarius em tubos pré-aquecidos rotulados, contendo 10 mililitros de caldo. Vortex os tubos inoculados por três a cinco segundos e incube a 37 graus Celsius para aumentar as culturas até a fase logarítmica intermediária. Depois de confirmar pelo menos 80% de fluência da cultura de células CCL 23, use a pipeta de transferência para remover o meio de cada poço da placa de 24 poços, inclinando levemente a placa para evitar perturbar a monocamada de células e, em seguida, lave os poços duas vezes adicionando aproximadamente 500 microlitros de PBS pré-pré-aquecido e removendo suavemente o líquido com uma pipeta de transferência.

Incline a placa durante as lavagens para ajudar a preservar a monocamada após a segunda lavagem. Adicione 500 microlitros de meio pré-aquecido a cada poço e devolva a placa à incubadora enquanto prepara as culturas bacterianas. Primeiro, meça a densidade óptica de um mililitro da cultura levarius no absorvente 600.

Em seguida, transfira cinco mililitros da cultura Sal Levarius para um tubo de 10 mililitros e centrifugue para o tubo por quatro minutos a 1.870 Gs em temperatura ambiente. Depois de descartar o snat Resus, suspenda o pellet em 200 a 1000 microlitros de cloreto de sódio a 85%, dependendo da leitura da DO, até uma concentração final de aproximadamente 1,5 vezes 10 elevado à nona colônia formando unidades por mililitro. Adicionar o número correto de bactérias é a parte mais complicada do experimento, pois o número real de bactérias adicionadas não é determinado até que a contagem de colônias seja realizada no dia seguinte.

Agora transfira o inóculo salivar ressuspenso para um tubo de micro fuga rotulado como alto. Dilua a alta concentração em um a 10 e um a 100 em mais ponto de cloreto de sódio a 85% para fazer concentrações médias e baixas de alvar para os tubos de vórtice de ensaio entre as diluições para criar os poços de controle de heparina. Remova 40 microlitros de meio de cada poço de controle e adicione 50 microlitros de heparina a uma concentração final de 100 unidades por mililitro por poço.

Adicione 10 microlitros de ponto, cloreto de sódio a 85% apenas às células CCL 23, e as células CCL 23 mais pneumococos apenas revestem completamente todas as concentrações de áreas de SIV. Em seguida, adicione 10 microlitros de uma a 10 e uma a 100 siv várias concentrações não diluídas aos poços apropriados para promover o contato bacteriano com a célula. Centrifugue a placa por três minutos a 114 Gs à temperatura ambiente e, em seguida, incube a placa por uma hora enquanto as células estão incubando, dilua em série o estoque salivar no ponto 85% de cloreto de sódio e use um espalhador estéril para dispersar 100 microlitros das diluições de 10 a menos cinco, 10 a menos seis e 10 a menos sete diluições em duplicata em placas de ágar sangue de cavalo.

Cultive as placas em uma posição invertida durante a noite em direção ao final da monocamada como incubação de salvas. Meça a densidade óptica da cultura pneumocócica e, em seguida, gire um mililitro das células. Resus suspende o pellet em 300 a 2000 microlitros de cloreto de sódio de 85% dependendo da leitura de OD para uma concentração final de aproximadamente 150 milhões de unidades formadoras de colônias por mililitro.

Em seguida, adicione 10 microlitros de pneumococos não diluídos a todos os poços, exceto os poços de controle negativo, centrifugue novamente a placa de 24 poços e, em seguida, incube as coculturas por três horas durante a etapa de incubação. Diluir em série e plaquear o estoque pneumocócico de maneira semelhante ao salivarius. Após três horas de incubação, verifique as células ao microscópio quanto a qualquer efeito citopático.

Agora remova o meio de cada poço e lave suavemente as coculturas três vezes com um XPBS para remover as bactérias não aderentes, tomando cuidado para não perturbar as monocamadas. Em seguida, as células com 200 microlitros de 0,1% de cavar por sete minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, adicione 800 microlitros de THB a cada um.

Poço pipete para cima e para baixo algumas vezes e colha as suspensões celulares de cada poço em tubos de microcentrífuga rotulados. Por último, diluir em série os pneumococos aderentes e contar as colónias no dia seguinte nas placas de diluição adequadas. Para quantificar os pneumococos e alvares nesta tabela, são mostrados os resultados de um experimento representativo no qual os pneumococos foram adicionados às células CCL 23 uma hora após a adição de slovar.

A adesão pneumocócica foi quantificada tanto pela contagem viável quanto pela lit. Os resultados do A-Q-P-C-R foram consistentes entre os dois métodos tanto para o número absoluto de bactérias quanto para a porcentagem de adesão. Normalizado para o número de pneumococos aderentes nos poços contendo pneumococos sozinhos.

A heparina é usada como controle, pois é conhecida por inibir a adesão pneumocócica. Portanto, a redução da adesão em aproximadamente 40% ou mais nas amostras de pneumococo mais heparina em comparação com o pneumocócico isolado é indicativa de um ensaio bem-sucedido. Como salivar inibe a adesão pneumocócica de maneira dose-dependente, onde a alta concentração de salivarius de aproximadamente 10 salivarius para um pneumococo resultou na menor adesão pneumocócica.

Esses enxertos demonstram a aderência dos pneumococos às células CCL 23 quando o salivarius é adicionado, uma hora antes do pneumococo concomitantemente ou uma hora após o pneumococo. Alvar é mais eficaz na inibição da adesão pneumocócica quando adicionado antes do pneumococo, pois as doses altas e médias de Alvar reduziram significativamente a adesão pneumocócica no ensaio de pré-edição. Enquanto a edição Coit e a pós-edição testam apenas as altas doses de Slovar inibiram a adesão pneumocócica.

Portanto, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio in vitro para medir a inibição da adesão pneumocócica pelas áreas de células probióticas de estreptococos.