Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios In Vitro E In Vivo Estudar Neuronal Morfologia e Migração
17 de março de 2014
Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.
O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o efeito da proteína de interesse na migração e morfologia neuronal. Isso é conseguido eletroporado, o cerebelo de filhotes de ratos P quatro. Como segunda etapa, é realizada a imuno-histoquímica de seções de cerebelo GFP positivo, que permite a visualização dos neurônios eletroporados.
Em seguida, as seções de coloração imunológica são visualizadas para medir a distância da migração neuronal e a duração dos processos neuronais. Os resultados obtidos mostrarão o efeito da proteína de interesse na migração neuronal e na morfologia no córtex cerebelar em desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como na aspiração do útero, é que o cerebelo pós-natal é facilmente acessível.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do neurodesenvolvimento, pois permite desvendar os mecanismos subjacentes à migração neuronal e à morfogênese A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois o direcionamento confiável do local da injeção requer prática. Antes de mostrar a eletroporação in vivo do cerebelo, primeiro demonstraremos um ensaio morfológico que usa neurônios de grânulos cerebelares cultivados como um sistema modelo. Comece este procedimento coletando o meio condicionado e submetendo os neurônios à fome no DMEM.
Em seguida, misture a solução de DNA e o cloreto de cálcio. Adicione dois X-H-B-S-S e misture delicadamente a solução fazendo bolhas de ar. Em seguida, adicione 40 microlitros de precipitado de DNA a cada poço e incube os neurônios por 18 minutos na incubadora a 37 graus Celsius.
Depois disso, remova a mistura DME e lave os neurônios duas vezes com 500 microlitros de DMEM pré-aquecido. Em seguida, adicione o meio condicionado coletado de volta aos neurônios se os neurônios estiverem em cultura por mais de três dias. Suplementar o meio com glicose 25 milimolar para repor a fonte de carbono após um a cinco dias.
Sujeite os neurônios à imunoquímica usando anticorpos GFP. Visualize pelo menos 30 neurônios individuais por condição de maneira cega usando um microscópio fluorescente para medir os axônios e dendritos. Converta imagens em oito bits com a imagem J abrindo a imagem.
Em seguida, escolha a imagem, clique em tipo, depois em oito bits e clique em salvar para salvar a imagem. Agora execute o plugin neuron J e abra a imagem de oito bits. Use a opção adicionar traçados para rastrear o axônio primeiro, clique com o botão esquerdo do mouse uma vez no início do axônio e mova o mouse ao longo do processo.
Em seguida, clique duas vezes na ponta do axônio se o traço corresponder à forma axonal. Se o traço sugerido for diferente da forma axonal, clique uma vez no processo axonal para ancorar o traço. Em seguida, clique duas vezes na ponta do axônio.
Em seguida, clique em traçados de medida. Escolha a opção exibir medições de rastreamento e pressione executar as medições de axônio são exibidas em uma nova janela. Salve-os como um arquivo separado que pode ser aberto em qualquer programa de planilha.
Para medir o comprimento total do dendrito, clique em medir traçados. Escolha as medidas do grupo de exibição e pressione executar. As medições totais de dendritos são exibidas em uma nova janela.
Salve-os como um arquivo separado que pode ser aberto em qualquer programa de planilha neste procedimento. Depois de anestesiar um sopro de rato P four com flúor iso, esterilize a parte de trás de sua cabeça com etanol 70%. Em seguida, localize o cerebelo de um filhote albino sob uma lâmpada pescoço de ganso.
O seio transverso, que demarca nitidamente o mesencéfalo dos hemisférios corticais, deve ser visível. O cerebelo está localizado adjacente ao mesencéfalo e aparece em um tom mais escuro. Mantenha o filhote em uma posição fixa e use um marcador permanente para indicar o cerebelo com um ponto.
Em seguida, insira uma agulha e injete lentamente três microlitros de DNA no cerebelo. Se a anestesia passar durante este procedimento, exponha o filhote ao flúor iso Antes de injetar o DNA, deixe a solução de DNA difundir por 30 segundos a um minuto. Após a injeção de DNA, coloque a cabeça do filhote entre os TROs da pinça para que o pólo negativo entre em contato com a região cerebelar na parte de trás da cabeça e o pólo positivo entre em contato com o lado oposto da cabeça.
Ajuste a voltagem de acordo com o peso do filhote para garantir uma boa eficiência de eletroporação sem comprometer sua sobrevivência. Em seguida, submeta o filhote a cinco pulsos elétricos. Após a eletroporação, deixe o filhote se recuperar em uma almofada aquecida ou embaixo de uma lâmpada infravermelha antes de devolvê-lo à barragem.
Para uma análise aprofundada, subdivida o IGL em metades, resultando em um IGL superior voltado para a camada molecular e um IGL inferior voltado para a substância branca e conte os neurônios positivos para GFP que residem em cada metade. Para medir o comprimento dos dendritos, abra a série de imagens no Amaris para gerar uma imagem 3D dos dendritos. Em seguida, clique no modo de superação para visualizar o neurônio em 3D.
Em seguida, selecione adicionar novo filamento e clique em ignorar Criação automática para iniciar o rastreamento semiautomático. Depois, selecione a guia de desenho e o caminho automático. Mova o cursor do mouse sobre o corpo da célula e shift mais o mouse Clique com o botão direito do mouse para selecionar o corpo da célula para realizar o cálculo automático.
Em seguida, adicione caminhos ao filamento usando shift mais clique esquerdo do mouse e visualize-os em tempo real. Por fim, vá para a janela de estatísticas do filamento e clique em valores específicos detalhados e soma do comprimento do dendrito do ácaro F para a soma do comprimento total do dendrito. Esta figura mostra a análise do crescimento de axônios e dendritos nos neurônios granulares cerebelares.
Os neurônios granulares cerebelares que foram transfectados com um plasmídeo que codifica GFP na div zero foram cultivados por um, dois ou três dias em completo, médio ou basal. Águia média suplementada com insulina após fixação. Os neurônios foram submetidos à imunocitoquímica usando o anticorpo GFP e os comprimentos dos axônios e dendritos foram medidos.
Aqui, as pontas das setas brancas indicam axônios e as pontas das setas amarelas indicam dendritos. Neste experimento, o cerebelo de filhotes de ratos P quatro foi eletroporado com o plasmídeo PSIN GFP e isolado. Cinco dias depois, cortes coronais de 40 micrômetros foram submetidos à imuno-histoquímica usando o anticorpo GFP A localização dos neurônios do grânulo cerebelar no cerebelo foi avaliada e o comprimento total do dendrito foi medido usando um software Mars.
As setas indicam os corpos celulares dos neurônios granulares cerebelares e a ponta da seta indica os dendritos Uma vez dominados. Esta técnica permite terminar a exploração de um filhote em cinco minutos se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante ajustar a tensão de acordo com o peso do P.
Usando esta técnica, várias proteínas de interesse podem ser manipuladas simultaneamente para delinear uma via durante o desenvolvimento cerebelar.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se na morfogênese e migração neuronais, processos essenciais para o desenvolvimento cerebral. Os métodos descritos envolvem a manipulação genética de neurônios granulares cerebelares para avaliar suas características morfológicas e migratórias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Desenvolvimento Neuronal
- Biologia Celular
Contexto
- A morfogênese neuronal é essencial para o funcionamento adequado do cérebro.
- Os padrões migratórios dos neurônios influenciam a estrutura cerebral.
- Técnicas de manipulação genética podem fornecer informações sobre o comportamento neuronal.
- Compreender esses processos pode auxiliar no enfrentamento de transtornos do desenvolvimento.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o efeito de proteínas específicas na migração neuronal.
- Avaliar a morfologia dos neurônios granulares do cerebelo.
- Aprimorar técnicas para o estudo do desenvolvimento cerebelar pós-natal.
Métodos Utilizados
- Electroporação de cerebelos em filhotes de rato pós-natais.
- Imunohistoquímica para visualizar neurônios eletroporados.
- Obtenção de imagens de seções imunomarcadas para medir a distância de migração neuronal.
- Análise do comprimento dos processos neuronais para avaliar a morfologia.
Resultados Principais
- Os resultados demonstrarão o impacto da proteína na migração neuronal.
- As descobertas fornecerão insights sobre as alterações na morfologia neuronal.
- A técnica oferece vantagens em comparação com os métodos tradicionais.
- O cerebelo pós-natal acessível permite um estudo detalhado.
Conclusões
- O estudo aprimora a compreensão do desenvolvimento neuronal.
- A manipulação genética pode revelar insights cruciais sobre a formação do cérebro.
- Os resultados podem orientar pesquisas futuras sobre transtornos cerebrais do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a migração neuronal e a morfogênese é essencial para identificar alvos terapêuticos em transtornos do neurodesenvolvimento. A manipulação genética de neurônios granulares cerebelares fornece um modelo escalonável para reduzir o risco de hipóteses sobre alvos, vinculando a função proteica a fenótipos estruturais. Essa abordagem apoia o estágio inicial de descoberta, permitindo a avaliação quantitativa do crescimento axonal e dendrít游戏副本
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a função proteica na migração neuronal e na morfologia para validar hipóteses terapêuticas.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível in vitro e in vivo para comparar os efeitos de RNAi, superexpressão ou moléculas pequenas em relação aos controles.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras morfométricas quantitativas, como comprimento de axônios e dendritos, para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Suporta fluxos de trabalho de imagem de alto conteúdo com rastreamento cego de neurônios e saída de dados compatível com planilhas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza o cerebelo de rato pós-natal como um sistema relevante para doenças, a fim de estudar processos neurodesenvolvimentais com alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite colaboração interfuncional por meio de protocolos padronizados de eletroporação e análise de dendritos tridimensionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se à biologia de descoberta ao vincular a manipulação genética à triagem fenotípica, apoiando a identificação de compostos líderes por meio da redução de riscos morfológicos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre os efeitos de proteínas na migração neuronal e na morfogênese em um modelo geneticamente manipulável.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de imagem para avaliação confiável de compostos ou perturbações genéticas.
- Análises: Gera medições rastreáveis de comprimento de axônios e dendritos, permitindo comparações estatísticas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro ao desenvolvimento cerebelar in vivo, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de múltiplas proteínas de interesse no esclarecimento de vias cerebelares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurodesenvolvimentais por meio da ligação direta entre morfologia e migração.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio do ajuste padronizado da voltagem de eletroporação e protocolos de imagem cegos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer confiança fenotípica precoce nas vias-alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em fenótipos estruturais e migratórios neuronais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura neuronal, eletroporação e imunohistoquímica.
- Depende de microscopia fluorescente e ferramentas de análise de imagens, como ImageJ e Amaris, para rastreamento tridimensional.
- Necessita padronização entre equipes para calibração de voltagem com base no peso das cobaias e amostragem cega de neurônios.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir ensaios de neurônios granulares in vitro para eletroporação cerebelar in vivo.
- Limitado pela necessidade de prática técnica em direcionamento confiável do cerebelo e eficiência da eletroporação.
